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Tesis Doctoral

La melatonina previene el partoLa melatonina previene el partoprematuro y las consecuencias en laprematuro y las consecuencias en ladescendencia en un modelo murinodescendencia en un modelo murino

de parto prematuro inducido porde parto prematuro inducido porlipopolisacáridolipopolisacárido

Domínguez Rubio, Ana Paula

2016-03-08

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Cita tipo APA:

Domínguez Rubio, Ana Paula. (2016-03-08). La melatonina previene el parto prematuro y lasconsecuencias en la descendencia en un modelo murino de parto prematuro inducido porlipopolisacárido. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Domínguez Rubio, Ana Paula. "La melatonina previene el parto prematuro y las consecuenciasen la descendencia en un modelo murino de parto prematuro inducido por lipopolisacárido".Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2016-03-08.

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La melatonina previene el parto prematuro y las

consecuencias en la descendencia en un modelo

murino de parto prematuro inducido por

lipopolisacárido

Tesis presentada para optar al título de Doctora de la Universidad de Buenos Aires en

el área de CIENCIAS BIOLÓGICAS

Ana Paula Domínguez Rubio

Directora de tesis: Ana María Franchi

Directora Asistente: María Aurelia Zorrilla Zubilete

Consejera de Estudios: Lidia Szczupak

Lugar de trabajo: Laboratorio de Fisiopatología de la Preñez y el Parto, Centro de

Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFyBO) CONICET-UBA.

Buenos Aires, 2015

II

La melatonina previene el parto prematuro y las consecuencias en la descendencia en un modelo murino de parto prematuro

inducido por lipopolisacárido

El parto prematuro es la principal causa de morbilidad y mortalidad perinatal

De los procesos patológicos que se han relacionado con el parto prematuro, la

infección y/o la inflamación intrauterina son las que se encuentran más

frecuentemente asociadas Asimismo, existe evidencia clínica de que la infección

prenatal y la inflamación son también factores de riesgo para el desarrollo posterior

de secuelas a nivel del sistema nervioso central, tanto en bebés nacidos a término

como en prematuros

La melatonina, una molécula antioxidante y antiinflamatoria, que atraviesa la

placenta y la barrera hemato-encefálica tiene diversos usos farmacológicos debido a

su inocuidad a altas concentraciones

La administración de lipopolisacárido (LPS) a ratones BALB/c en el día 15 de

gestación produce 100% de parto prematuro La melatonina, administrada de forma

de pellet subcutáneo en el día 14 de gestación, previno el parto prematuro en el

50% de los casos e inhibió el daño en el cerebro fetal inducido por LPS Dentro de los

mecanismos estudiados en el desencadenamiento del parto prematuro y el daño en

el cerebro fetal, la melatonina inhibió la producción de TNF-α, de las prostaglandinas

y el óxido nítrico en el útero, e inhibió la producción de mediadores inflamatorios en

el cerebro fetal Además, la melatonina previno modificaciones en el patrón

epigenético en el cerebro fetal Asimismo, las crías provenientes de hembras

tratadas con melatonina y LPS donde se revirtió el parto prematuro, no presentaron

diferencias en su desarrollo durante el período de lactancia, ni tampoco cuando

fueron evaluadas en diversos test de comportamiento en la adultez

Palabras claves: parto prematuro, inflamación prenatal, LPS, melatonina, útero,

cerebro fetal, interleuquinas, óxido nítrico, prostaglandinas

III

Melatonin prevents preterm labor and

consequences on offspring in a murine model of preterm labor

induced by lipopolysaccharide

Maternal infection and inflammation have been implicated in the mechanisms

responsible for preterm labor Moreover, intrauterine inflammation has been

identified as a major risk for the offspring’s neuro-developmental brain damage and

may result in cognitive outcomes

Melatonin expresses powerful anti-inflammatory and anti-oxidant activities and

crosses the placenta and blood–brain barrier Furthermore, it has an excellent

biosafety profile and has shown important therapeutic benefits

We developed a murine model of preterm labor: lipopolysaccharide (LPS) was

administrated to BALB/c mice on day 15 of pregnancy, which induced 100% of preterm

delivery Melatonin, subcutaneously implanted with a pellet on day 14 of pregnancy,

prevented LPS-induced preterm delivery in 50% of cases and had a protective effect on

fetal brain Melatonin significantly prevented the LPS-induced rises in uterine TNF-α

levels, nitric oxide production, prostaglandins PGE2 and PGF2α levels and

inflammatory mediators in fetal brain Moreover, melatonin prevented epigenetic

modifications in fetal brain Besides, in the cases where melatonin prevented LPS

induced preterm delivery, the pups were born alive and showed no significant

difference with the control group, neither in physical parameters or adult behavior

Keywords: preterm labor, prenatal inflammation, LPS, melatonin, uterus, fetal

brain, interleukins, nitric oxide, prostaglandins

IV

Los resultados presentados en este trabajo de tesis han sido parcialmente publicados en:

Domínguez Rubio AP, Sordelli MS, Salazar AI, Aisemberg J, Bariani MV, Cella M,

Rosenstein RE, Franchi AM Melatonin prevents experimental preterm labor and

increases offspring survival J Pineal Res 2014 Mar; 56(2):154-62 doi: 10 1111/jpi

12108 Epub 2014 Jan 2

V

Agradecimientos

A Ana, por querer que sea su becaria y especialmente por darme un tema de trabajo que me gustó desde el primer momento porque unificaba muchos temas de los que me interesaban y los tenía como cuestiones separadas Por formarme y además por formar un grupo tan lindo para trabajar Por mostrar tu inquietante compromiso por cuestiones de género, sociales y políticas A María porque tu manera de ser me parece asombrosa y siempre disfruté bajar un piso para juntarnos Por enseñarme un sinfín de cosas siempre con la calidez y la simpatía que te caracteriza y por ayudarme con lo que necesitase Especialmente a Ruth por toda la ayuda a lo largo la tesis

A Juli, la original, porque no te das una idea de lo que me hiciste quererte No podría describir en todo lo que me ayudaste y acompañaste desde el primer día que entré al laboratorio hasta el día de hoy Por tu dedicación y por saber que cuento con vos en todos los aspectos de mi vida A Vicki por recibir tanto cariño durante toda la tesis Por haber compartido un sinfín de buenos recuerdos de una hermosa amistad y seguir haciéndolo Porque me dijiste un millón de veces que no baje al bioterio A Manolito por todo lo que me ensañaste y ayudaste desde que entré al laboratorio Porque ser cariñoso junto con Juli al invitarme una cerveza cuando entré A Maki por la buena onda y buena predisposición para cualquier cosita de cualquier índole Por enseñarme tus conocimientos del parto prematuro A Fer, por saber de todo, especialmente de la RAE y por las correcciones A Juli, la 2, por la buena onda, la ayuda y las salidas El legado del parto prematuro en el laboratorio queda en tus manos Juli 3 por todo el tiempo en el microscopio y lo que me ayudaste con histología

A Rami, por ser tan humana, tan sensible y tan atenta Gracias por la inmensa ayuda en el

laboratorio, los mates y las hermosas charlas

A Turi por toda la ayuda en el laboratorio, en el tramiterío y por los buenos momentos

A Torti porque me acuerdo que me ayudaste un montón mientras estuviste y por siempre ir

para adelante

A Gina, Ale y Dani por su charlas, consejos y ser tan adorables

A Sil, Lauchi, Mari, Fede y Eva por compartir los almuerzos y ayudas varias A la Cuchi y Clauchi

por todo lo que compartimos y por ser tan copadas A Mica, Jime y Cyn por tener siempre

buena onda

A la gente de administración, Ani, Patri, Noemí, Ale y Cristina por la ayuda constante

VI

A Dani y a Marce por su trabajo y dedicación en el manejo del bioterio

A Sara, Pachi y Vanesa, por su gran ayuda en general

A Julito y Eduardo

A Gabriela Meresman por enseñarme a operar a los ratones

A AmaichaDepino, Fernanda Parborell y Alicia Jawerbaum por aceptar ser mis juradas de tesis

A Lidia por ser mi consejera de estudios

A mis mamá y mi papá, Ana y Néstor, porque me quieren y me ayudan siempre con todo lo

que necesito y más también

A mis hermanos, Lucas, Javier y Ramiro porque me ayudan en un montón de cosas y hacen que

no me vuelva tan loca

A mi abuela Elisa por qué no sé qué sería mi vida sin ella, por siempre mimarme tanto

A todos los Mollerach y Domínguez Rubio por acompañarme y ayudarme siempre

A mis amigas de la “OLaPI”, “La resistencia”, “LCM” o como nos vayamos a llamar porque me

apoyan y me dan alegría

A Euge por ser mi amiguita cercana pese a la distancia

A Santi por la buena compañía y otras tantas cosas más

A todo el CEFYBO, por hacer del instituto un instituto donde da gusto trabajar

A la Facultad de Ciencias Exactas y Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires por

formarme

Al CONICET, por las becas otorgadas que hicieron posible esta tesis y junto con la AGENCIA por

los subsidios otorgados

A los más colaboradores de esta tesis, los sensibles ratones BALB/c Mi mayor respeto, afecto y

gratitud

VII

A Ana y Néstor

VIII

Abreviaturas

AcH3: histona 3 acetilada

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ADN: ácido desoxiribonucleico

C: control

COX-1: ciclo-oxigenasa 1

COX-2: ciclo-oxigenasa 2

EE: error estándar

H3: histona 3

H4: histona 4

HAT: acetiltransferasas de histonas

HDAC: deacetilasas de histonas

LPS: lipopolisacárido

M: melatonina

MT1: receptor de melatonina tipo 1

MT2: receptor de melatonina tipo 2

NF-κB: factor de transcripción nuclear

kappa B

NO: óxido nítrico

NOSe: óxido nítrico sintasa endotelial

NOSi: óxido nítrico sintasa inducible

NOSn: óxido nítrico sintasa neuronal

Nrf2: factor nuclear eritroide 2

PG: prostaglandina

PGE2: prostaglandina E2

PGF2α: prostaglandina F2α

RNS: especies reactivas de nitrógeno

ROS: especies reactivas de oxígeno

S: segundo

SNC: sistema nervioso central

TLR-4: receptores de la familia Tolltipo

4

TSA: tricostatina A

U a : unidades arbitrarias

#: cantidad

IX

Índice

Introducción 1

Parto prematuro 1

Definición y problemática 1

Frecuencia e incidencia 1

Clasificaciones 2

La vía común del parto 2

Recurrencia del parto prematuro 3

Etiología 4

Las infecciones como causa del parto prematuro 5

Vías de infección intrauterina 5

Potenciales sitios de infección-inflamación dentro del útero 6

Infección versus inflamación 7

Ventaja evolutiva del parto prematuro inducido por infección 8

Intervenciones terapéuticas para el parto prematuro 8

Intervenciones primarias 8

Intervenciones secundarias 9

Intervenciones terciarias 10

Mortalidad y secuelas desde la infancia a la adultez de los nacidos prematuros 11

Modelando el parto prematuro inducido por inflamación 14

Construcción de un modelo de parto prematuro inducido por inflamación 14

Aspectos del parto prematuro inducido por inflamación en el modelo utilizado 14

Validez predictiva del modelo del modelo utilizado 15

LPS, inflamación, parto prematuro y daño en el cerebro fetal 16

Lipopolisacárido 16

LPS, estrés nitro-oxidativo y respuesta inflamatoria 17

X

Respuesta inflamatoria: citoquinas 19

LPS y la respuesta inflamatoria de las citoquinas 19

Citoquinas, parto prematuro y daño en el cerebro fetal 20

Respuesta inflamatoria: óxido nítrico 21

LPS y la respuesta inflamatoria del NO 24

NO, parto prematuro y daño en el cerebro fetal 24

Respuesta inflamatoria: prostaglandinas 26

LPS y la respuesta inflamatoria de las prostaglandinas 28

Prostaglandinas y parto prematuro 29

Consecuencias de la inflamación prenatal sobre las crías 31

Inflamación prenatal, modificaciones epigenéticas y consecuencias en la descendencia 31

Melatonina 33

La melatonina, una molécula anti-oxidante y anti-inflamatoria 35

La melatonina como fármaco 38

La melatonina como fármaco epigenético 39

La tricostatina, un inhibidor de las HDAC 40

Animales de experimentación 41

Características generales 41

Características reproductivas 41

Tejidos en estudio 43

El útero 43

El cerebro fetal 44

Hipótesis y objetivos 46

XI

Materiales y métodos 47

Animales 47

Tratamientos 47

Evaluación del desarrollo físico en las crías y del comportamiento en los adultos 51

Desarrollo físico en las crías 51

Comportamiento en los adultos 51

Test de campo abierto 52

Test de laberinto elevado en cruz 54

Test de evitación inhibitoria 55

Ensayos con tricostatina 57

Técnicas 58

ELISA de TNF-α 58

RT-PCR 58

Western blot 60

Radioinmunoensayo de prostaglandinas 61

Actividad de las NOS medida por radioconversión 62

Actividad de las HAT medida por ensayo colorimétrico 63

Histología 63

Análisis estadísticos 64

Drogas y reactivos 67

Soluciones y buffers 68

XII

Resultados 70

1 Efecto de la melatonina sobre el desencadenamiento del parto prematuro 70

Porcentaje de parto prematuro, parto a término y tamaño de la camada 70

Dilatación del cérvix 71

2 Mecanismos implicados en el desencadenamiento del parto prematuro inducido por

LPS y la reversión por la melatonina 72

Morfología del útero 72

Respuesta inflamatoria 72

Citoquinas 72

Óxido nítrico 73

Prostaglandinas 75

3 Consecuencias de la administración de LPS en el día 15 de preñez en el cerebro fetal

y el posible efecto de la melatonina sobre el mismo 77

Evaluación macroscópica del feto 77

Histología del cerebro fetal 77

Respuesta inflamatoria 79

Citoquinas 80

Óxido nítrico 80

Modificaciones epigenéticas 82

Mecanismos implicados en el desencadenamiento del parto prematuro y el daño en el

cerebro fetal 84

4 Crecimiento y comportamiento de las crías provenientes de hembras tratadas con

melatonina y LPS donde se revirtió el parto prematuro 86

Efecto del tratamiento con melatonina y LPS en el período de lactancia 86

Peso 86

Parámetros de desarrollo 87

XIII

Efecto del tratamiento con melatonina y LPS en el período de adultez 88

Comportamiento 88

Test de campo abierto 88

Test de laberinto elevado en cruz 89

Test de evitación inhibitoria 92

Discusión 93

Conclusiones 105

Referencias 107

Introducción

Introducción

1

Introducción

Parto prematuro

Definición y problemática

Un embarazo normal en el ser humano dura 40 semanas. Sin embargo,

cuando el parto tiene lugar antes de que se haya completado la semana 37 de

gestación, los recién nacidos se consideran prematuros.

El parto prematuro es la principal causa de mortalidad perinatal, siendo ésta

definida como la muerte fetal a partir de la semana 28 de gestación o la muerte del

bebé recién nacido en los primeros 7 días de vida.

A su vez, el parto prematuro también es la principal causa de morbilidad

perinatal. Los recién nacidos prematuros necesitan cuidados especiales, ya que no

están totalmente preparados para la vida extrauterina. Aunque una proporción de

los nacidos prematuros sobrevive, tienen mayor riesgo de sufrir trastornos en el

desarrollo. La inmadurez, especialmente del cerebro y de los pulmones, puede dejar

secuelas para el resto de la vida (Jobe & Bancalari 2001; Rees & Inder 2005).

Frecuencia e incidencia

Cada año nacen en el mundo unos 15 millones de niños prematuros, es decir,

más de 1 de cada 10 nacimientos. Cada año mueren cerca de un millón de recién

nacidos prematuros y muchos otros sufren algún tipo de discapacidad física o

neurológica de por vida, lo cual supone un gran costo tanto para sus familias como

para la sociedad en general (Organización Mundial de la Salud 2012).

Cabe remarcar que el nacimiento prematuro es la principal causa de

mortalidad neonatal (durante los primeros 28 días de vida) y la segunda causa de

muerte entre los niños menores de cinco años después de la neumonía, aunque las

tasas de supervivencia presentan notables disparidades entre los distintos países del

mundo. Sin embargo, por más que los bebés prematuros sobrevivan corren mayor

riesgo de desarrollar discapacidades que les acompañarán toda la vida. El grado en

que esto puede afectarles depende en gran medida del grado de prematuridad, la

calidad de la atención y los cuidados recibidos en el parto, el período

inmediatamente posterior a este y en los días y semanas subsiguientes

(Organización Mundial de la Salud 2012).

Introducción

2

Clasificaciones

La Organización Mundial de la Salud ha clasificado a los niños prematuros de

acuerdo con las semanas de gestación o con la edad gestacional al momento del

nacimiento:

- Extremadamente prematuro: menores de 28 semanas.

- Severamente prematuro: aquellos nacidos entre las semanas 28 y 31.

- Moderadamente prematuro: aquellos nacidos entre las semanas 32 y 33.

- Cercano a término: aquellos nacidos entre las semanas 34 y 36.

La vía común del parto

Algunos de los mecanismos involucrados en el inicio del parto prematuro son

similares a los del parto a término, la diferencia crucial es en el momento de la

gestación en que éstos se desencadenan (Gotsch et al. 2009). En cambio, otros

procesos parecen involucrar distintos mecanismos, como ocurre en la maduración

del cérvix (Gonzalez et al. 2013).

La vía común del parto ha sido definida como eventos anatómicos,

fisiológicos, bioquímicos, endócrinos e inmunológicos que ocurren en la madre y/o

en el feto en el momento del parto, independientemente si esto ocurre

prematuramente o a término.

Los componentes más conocidos de la vía común del parto son los eventos que

ocurren a nivel uterino porque son clínicamente aparentes para los obstetras y sus

pacientes. Algunos de éstos son: 1) el incremento en la contractilidad endometrial;

2) la dilatación y borradura del cérvix; 3) la activación de las membranas

corioamnióticas y de la decidua (Figura 1), (Romero et al. 1994).

Figura 1. La vía común del parto (Gotsch et al. 2009)

Introducción

3

En el parto espontáneo a término estos tres componentes están

sincronizados: las contracciones uterinas se vuelven regulares y dolorosas, se

produce la dilatación del cérvix y ocurre la ruptura de las membranas. El tiempo de

gestación en el ser humano queda limitado por la capacidad de la madre y/o la

placenta de sostener el crecimiento del feto. Cuando se llega a ese límite se inicia el

trabajo de parto. Una duración ilimitada del embarazo acabaría con los recursos

maternos y a su vez la cabeza del feto no pasaría por el canal de parto. Asimismo, se

postula que la duración de la gestación queda determinada tanto por el genoma del

feto como por el de la madre (Haig 2010).

El comienzo del trabajo de parto antes de tiempo no ha sido aún dilucidado

y se postula que es una activación idiopática del proceso normal del trabajo de parto

como resultado de un evento patológico. En algunos casos, la activación de los

componentes de la vía común del parto puede estar desincronizada. Por lo tanto,

algunos pacientes sólo presentan un aumento de la contractilidad uterina, otros

presentan insuficiencia del cérvix (dilatación con las membranas protruyendo hacia

el mismo) y otros una ruptura prematura de las membranas. Aunque en otros casos,

la activación de los componentes de la vía común del parto puede estar

sincronizada (Gotsch et al. 2009).

Sin embargo, se han demostrado diferencias con respecto a la maduración

del cérvix entre el parto prematuro y el parto a término. Por ejemplo, en el parto

prematuro se ha observado infiltración de macrófagos y no así infiltración

leucocitaria. A su vez, en el parto prematuro, los macrófagos son los responsables de

la liberación de metaloproteinasas y en cambio en el parto a término son las células

epiteliales columnares y los fibroblastos las que producen estas enzimas. En ambos

casos, la liberación de las metaloproteinasas producen la degradación de las fibras

de colágeno que permiten la dilatación del cérvix (Gonzalez et al. 2013).

Recurrencia del parto prematuro

Las mujeres que tuvieron partos prematuros previos tienen de 2 a 5 veces

mayor riesgo de tener parto prematuro en su próximo embarazo. El riesgo de parto

prematuro en un próximo embarazo está directamente relacionado con la cantidad

de partos prematuros previos e inversamente relacionado con el tiempo de

gestación del parto prematuro anterior (Goldenberg et al. 2008).

Las mujeres que tuvieron parto prematuro espontáneo es más probable que

tengan uno subsecuente y las que tuvieron partos prematuros indicados tienden a

repetir ese tipo de parto. El mecanismo de recurrencia aún no fue dilucidado, pero

las infecciones persistentes o recurrentes probablemente expliquen muchos casos

de partos prematuros espontáneos repetitivos (Mercer et al. 1999). Por otro lado,

los desórdenes subyacentes que causan parto prematuro indicado como la diabetes,

Introducción

4

la hipertensión o la obesidad frecuentemente persisten entre gestaciones por lo

tanto también podrían explicar muchos casos de parto prematuro indicados

repetitivos (Laughon et al. 2014).

Etiología

Muchas patologías obstétricas se basan en la recopilación de signos y

síntomas clínicos que presentan las madres y no en los mecanismos responsables de

la enfermedad. El término “parto prematuro” no indica la causa, pudiendo éste ser

iniciado por una infección intrauterina, isquemia útero-placentaria, sobredistensión

uterina, desórdenes del cérvix, una reacción alogénica anormal, fenómenos de

alergia, desórdenes endócrinos u otros (Figura 2 Su diagnóstico describe

simplemente las manifestaciones clínicas sin considerar su etiología. Por lo tanto, se

propone tratar al parto prematuro como un síndrome. Según el Diccionario Médico

de Oxford un síndrome es “una combinación de síntomas y/o signos que forman una

descripción clínica de un desorden particular”. En esta definición queda implícito

que un síndrome puede tener varias etiologías (Romero et al. 2006).

Figura 2.Causas del parto prematuro (Gotsch et al. 2009).

Introducción

5

Las infecciones como causa del parto prematuro

Las infecciones intrauterinas durante la gestación son la principal causa de

parto prematuro (Goldenberg et al. 2000). Se ha observado que más del 85% de los

partos prematuros espontáneos antes de la semana 28 (Yoon et al. 2000; Yoon et al.

2001) y alrededor del 65% de los partos antes de la semana 37 de gestación (Üstün

et al. 2001) presentaron evidencia de inflamación intrauterina (definida como

presencia de corioamnionitis histológica).

Las infecciones provocan parto prematuro debido a la inducción de un

proceso inflamatorio. Los microorganismos y sus productos son reconocidos por los

receptores de reconocimiento de patrones, como los receptores de la familia Toll

(TLR), a través de los cuales se induce la producción de quimioquinas, citoquinas,

prostaglandinas y proteasas que activan la vía común del parto (Romero et al.

2014).

Dentro de los procesos patológicos asociados al parto prematuro, los

procesos de infección/inflamación durante la gestación son la únicos que afirman

causalidad dado que se conocen muchos los mecanismos moleculares involucrados

en el mismo (Morrison & Cushman 2007; Kemp 2014; Prince et al. 2014).

Vías de infección intrauterina

Las posibles vías de infección son cuatro y se pueden observar en la Figura 3.

La primera es la vía ascendente desde la vagina, la segunda la vía retrógrada desde

la cavidad peritoneal a través de las trompas de Falopio. La tercera es la vía

hematógena a través de la placenta y la cuarta es por procedimientos invasivos

como la amniocentesis o la toma de muestras percutáneas de sangre fetal del

cordón umbilical o de las vellosidades coriónicas (Goldenberg et al. 2008).

Introducción

6

Normalmente las bacterias que se encuentran en el útero asociadas al parto

prematuro son de origen vaginal. Raramente se encuentran bacterias provenientes

de otros lugares como la boca y se cree que éstas llegan tanto sea por la vía

hematógena como por contacto orogenital. Aunque no han sido estudiadas

extensivamente las infecciones intrauterinas virales o por hongos, éstas podrían ser

probables, o podrían contribuir a exacerbar las consecuencias de las infecciones

bacterianas (Racicot et al. 2013; Payne & Bayatibojakhi 2014)

Potenciales sitios de infección-inflamación dentro del útero

Si la mayoría de las bacterias que se encuentran en el útero asociadas al

parto prematuro son de origen vaginal, el mecanismo de infección más probable es

que las bacterias asciendan por la vagina hasta el cérvix uterino. El paso al espacio

corio-decidual ocurriría según los factores de virulencia propios de las bacterias y de

la respuesta inmune materna, y de producirse se generaría la inducción de una

respuesta inflamatoria.

Si la infección avanza, una posibilidad sería que las bacterias se propaguen a

través de la placenta y luego mediante el cordón umbilical las bacterias llegarían al

Figura 3. Vías de infección. I: Vía ascendente desde la vagina. II: Vía retrógrada desde la cavidad peritoneal a través de las Trompas de Falopio. III: Vía hematógena a través de la placenta. IV: Procedimientos invasivos.

Introducción

7

feto produciendo una respuesta inflamatoria fetal. Otra posibilidad, sería que las

bacterias accedan a la cavidad amniótica mediante el pasaje a través de las

membranas fetales (corion y amnios). Una vez que las bacterias están en la cavidad

amniótica podrían ingresar al feto mediante la deglución, Figura 4

Figura 4.Potenciales sitios de infección-inflamación dentro del útero.

Una hipótesis alternativa propone que en la mayoría de los casos las

bacterias no acceden a la cavidad amniótica y/o al feto, sino que permanecen en el

espacio corio-decidual y la placenta, provocando una respuesta inflamatoria

circunscripta a dichos tejidos. Sucesivamente, los mediadores inflamatorios

(citoquinas y quimioquinas) llegarían a la circulación fetal y evocarían la respuesta

fetal (Goldenberg et al. 2000; Elovitz & Mrinalini 2004).

La respuesta inflamatoria fetal se asocia al inicio del trabajo de parto antes

de término y a la morbilidad a corto y largo plazo, vinculada a leucomalacia

periventricular, displasia broncopulmonar y parálisis cerebral (Bo Hyun Yoon et al.

1996; Yoon et al. 1999; B H Yoon et al. 2000).

Infección versus inflamación

Las infecciones son, con frecuencia, difíciles de detectar debido a dos

limitaciones. Una relacionada a las técnicas de cultivo de microorganismos, que sólo

pueden detectar al 1 % de los microorganismos, del resto se desconocen las

condiciones óptimas de crecimiento (un cultivo positivo asegura la presencia de

microorganismos pero no al revés). Sin embargo, esta dificultad en los últimos años

ha comenzado a ser sorteada con el desarrollo de técnicas de biología molecular. A

través de sondas específicas o de PCR se puede revelar la presencia de la subunidad

16S del ribosoma bacteriano. La otra limitación es en cuanto a la obtención de la

muestra, ya que una extracción de líquido amniótico requiere amniocentesis y por

ello un riesgo para el embarazo.

Introducción

8

Debido a que la infección es la principal causa de inflamación, normalmente

se considera que las mujeres que presentan un cuadro inflamatorio también

presentan un cuadro infeccioso (Romero et al. 2006).

Ventaja evolutiva del parto prematuro inducido por infección

El comienzo del trabajo de parto antes de tiempo puede considerarse como

un mecanismo de defensa de la madre contra la infección uterina, a través del cual

la madre elimina tejidos infectados como incluyendo al feto y así podría mantener

su éxito (fitness) reproductivo. Cuando el feto está maduro, el comienzo del trabajo

de parto antes de tiempo puede también tener un valor para su supervivencia ya

que le permitiría al feto escapar de un ambiente intrauterino hostil. Entonces, si las

manifestaciones clínicas son adaptativas, el tratamiento con tocolíticos o el cerclaje

del cérvix estarían actuando sobre los síntomas y no sobre los procesos patológicos

que estarían causando el inicio del trabajo de parto antes de tiempo (Romero et al.

2006).

Intervenciones terapéuticas para el parto prematuro

Las intervenciones para reducir la morbimortalidad asociada al parto

prematuro pueden ser primarias, secundarias o terciarias. Las primarias están

dirigidas a todas las mujeres antes o durante el embarazo para prevenir o reducir el

riesgo de parto prematuro. Las secundarias están dirigidas a mujeres con factores

de riesgo para prevenir o reducir su incidencia. Por último, las terciarias están

dirigidas a mujeres luego de que el trabajo de parto haya comenzado y cuyo objetivo

es retrasarlo y/o mejorar las consecuencias sobre los bebés nacidos antes de

término.

Con respecto a las intervenciones secundarias y terciarias habría que

considerar el equilibrio entre el intento de prolongar la gestación para promover la

maduración fetal y la exposición del feto a un ambiente intrauterino subóptimo o

incluso peligroso.

Intervenciones primarias

La prevención primaria está dirigida a todas las mujeres en edad

reproductiva y es una estrategia que surge a raíz de las limitaciones de las

intervenciones secundarias y terciarias. Hay dos tipos de intervenciones primarias, la

prevención primaria pre-concepcional y la prevención primaria durante la

gestación.

Introducción

9

La prevención primaria pre-concepcional consiste en intervenciones

educativas públicas (Anon 2005a) y en políticas públicas y profesionales, ya que se

ha observado que las mujeres que planifican sus embarazos y comienzan con el

consumo de suplementos nutricionales antes de la concepción tienen un menor

riesgo de parto prematuro (Anon 2005b).

La prevención primaria durante la gestación está dirigida a todas las mujeres

embarazadas y consiste en el consumo de suplementos nutricionales durante la

gestación. Si bien esta conducta preventiva no altera la tasa de partos prematuros, sí

reduce la morbilidad fetal (Hofmeyr et al. 2006; Rumbold et al. 2006). A su vez, el

abandono del cigarrillo durante la gestación se ha visto que reduce el bajo peso al

nacer y la incidencia del parto prematuro (Lumley et al. 2009). Asimismo, la

importancia de los controles prenatales se basa en identificar a las mujeres de riesgo

(Papiernik 2007).

Cabe remarcar que más del 50% de los partos prematuros surgen de

embarazos sin ningún factor de riesgo aparente, y por lo tanto de ello se desprende

que los factores de riesgo considerados son limitados. Sería útil identificar nuevos

factores de riesgo para así poder reconocer a las mujeres con bajo riesgo que hasta

ahora son aparentemente sanas (Iams et al. 1998). La combinación de marcadores

de parto prematuro en suero, la presencia de fibronectina fetal en el cérvix y la

vagina, y la medición de la longitud del cérvix por ecografía abdominal muestran un

valor predictivo positivo para reconocer a las mujeres con bajo riesgo de parto

prematuro (Goldenberg et al. 2001).

Intervenciones secundarias

La prevención secundaria está dirigida a mujeres con un riesgo de parto

prematuro evidente basado en su historia obstétrica o en factores de riesgo

presentes. Hay dos tipos de intervenciones secundarias, la pre- y la post-

concepcional.

Por un lado, la intervención secundaria pre-concepcional se basa en la

historia obstétrica de haber tenido un parto prematuro previo. Éste, es un factor de

riesgo muy importante y a su vez, cuanto más temprano en la gestación haya sido el

parto prematuro anterior es mayor el riesgo de recurrencia (Mercer et al. 1999). De

esto se desprende la importancia de definir a qué se considera parto prematuro

(Mazaki-Tovi et al. 2007). El límite superior está establecido por el parto que ocurre

antes de que se haya cumplido la semana 37 de gestación y el límite inferior por

aquel que ocurre a partir de la semana 18 de gestación. Un parto previo a que se

haya completado la semana 17 de gestación no confiere riesgo de un próximo parto

prematuro (Iams et al. 1998). Asimismo, cuantos más partos prematuros haya

tenido una mujer en sus embarazos previos el riesgo parto prematuro se incrementa

(Mercer et al. 1999). El conocimiento de este tipo riesgo, permitiría identificar

Introducción

10

oportunidades para tratar de disminuirlo aunque por el momento no se cuenta con

herramientas para hacerlo. La intervención secundaria pre-concepcional se basa en

factores de riesgo presentes que son identificados en la consulta, como la diabetes,

el peso corporal, el asma y patologías asociadas a la presión sanguínea, los cuales

predicen alrededor del 40% de los partos prematuros (Haas et al. 2005).

En cuanto a la intervención secundaria post-concepcional, los suplementos

nutricionales mostraron una reducción significativa en la incidencia de partos

prematuros (Olsen et al. 1992; Olsen et al. 2000).

Asimismo, han sido poco exitosos los intentos de evitar el parto con

antibióticos, progesterona o el cerclaje del cérvix. Esto ha generado mucha

controversia ya que no en todos los casos el tratamiento es efectivo.

Intervenciones terciarias

Los tratamientos para arrestar el trabajo de parto prematuro una vez que

éste ya comenzó no son suficientes para permitir que el embarazo llegue a término

y que culmine el crecimiento y la maduración del feto dentro del útero. Sin

embargo, el tratamiento puede retrasar el parto el tiempo necesario para que se

puedan realizar intervenciones que reduzcan la morbimortalidad neonatal. También

se trata de transferir a la mujer embarazada con trabajo de parto prematuro

(especialmente si no ha cumplido la semana 32 de gestación) a un centro de

atención equipado para el cuidado de bebés prematuros (Warner et al. 2004; Phibbs

et al. 2007).

A todas las mujeres con amenaza de parto prematuro se les administran

antibióticos para prevenir infecciones neonatales, ya que los bebés prematuros

tienen mayor riesgo de contraer infecciones (Schrag et al. 2002).

La administración prenatal de corticoides a la madre reduce las dificultades

respiratorias, la hemorragia intraventricular, la enterocolitis necrotizante y el ductus

arterioso persistente. Los glucocorticoides actúan en el desarrollo fetal promoviendo

la maduración sobre el crecimiento. En los pulmones los corticoides promueven la

síntesis de surfactantes, incrementan la distensibilidad pulmonar, reducen la

permeabilidad vascular y generan una mejor respuesta al tratamiento postnatal con

surfactantes (Roberts & Dalziel 2006; Wapner et al. 2006).

Los tocolíticos son drogas que se usan para prolongar la gestación en

mujeres con riesgo de parto prematuro con trabajo de parto activo. Pueden retrasar

el inicio del parto de 2 a 7 días. Este tiempo permite transferir el caso a una unidad

especial y administrar los corticoides para reducir la morbimortalidad neonatal (Iams

et al. 2008).

Introducción

11

Las intervenciones que intentan reducir la incidencia de parto prematuro

son limitadas, lo que sí se ha logrado hasta ahora es que la tasa de parto

prematuro se mantenga y la mortalidad perinatal disminuya. El uso prenatal de

corticoides y antibióticos y el postnatal de surfactantes, los avances en las técnicas

de resucitación en los recién nacidos, el mejor entendimiento del uso de

respiradores y el manejo de fluidos, así como el progreso en técnicas quirúrgicas y

anestésicas, y el uso apropiado de antibióticos tienen un rol muy importante en el

aumento de la tasa de supervivencia de los nacidos prematuros.

Mortalidad y secuelas desde la infancia a la adultez de los nacidos prematuros

El parto prematuro ha representado un problema de salud pública desde el

siglo pasado, pero es en los últimos años cuando se ha incrementado su incidencia.

Antes de la década del ’70 se consideraba inviable a un feto menor de 28 semanas.

Si bien se reportaba ocasionalmente sobrevida, la mortalidad para ese grupo era

mayor al 90%. Los avances en el cuidado de los bebés prematuros y la tecnología

han ido aumentando gradualmente la sobrevida de los mismos. En la actualidad, el

límite de viabilidad aceptada en la mayor parte de los países desarrollados es la

semana 24. La disminución del límite de viabilidad lleva a aumentar el porcentaje de

partos prematuros. Cada vez más se programan partos antes de término cuando

está en riesgo la vida de la madre y/o del feto, teniendo en cuenta que los medios

diagnósticos perinatales hoy son mucho más avanzados que hace 20 años. Producto

de estas intervenciones se ha disminuido la mortalidad intrauterina y la mayoría de

los niños que antes morían in utero ahora nacen pretérmino. El desarrollo de la

ventilación mecánica en los años ’60 y el uso de corticoides prenatales en los años

’70 cambiaron la historia natural de la evolución del síndrome de dificultad

respiratoria, causa principal de mortalidad en esa época para la prematurez (Hislop

et al. 1987; Roberts & Dalziel 2006). En los ’90, el empleo rutinario de surfactantes

para los prematuros con este síndrome mejoró su sobrevida, pero aumentó o

mantuvo estable el porcentaje de prematuros con displasia broncopulmonar (Soll

1998; Doyle 2004). En la actualidad, se están usando medidas ventilatorias menos

agresivas para tratar de disminuir su incidencia.

Por consiguiente, la tasa de supervivencia de los nacidos prematuros se ha

incrementado en los últimos años debido a los avances tecnológicos. Estos niños no

sólo tienen mayor riesgo de desarrollar complicaciones en la unidad neonatal sino

también a largo plazo. La morbilidad asociada a la prematurez está inversamente

relacionada con el tiempo de gestación y no hay tiempo de gestación donde los

nacidos prematuros queden exentos de complicaciones. Como la tasa de mortalidad

ha disminuido, el enfoque en las intervenciones perinatales está puesto en

desarrollar estrategias para reducir la morbilidad a largo plazo, especialmente en

Introducción

12

prevenir las lesiones en el cerebro. Además, hay interés en identificar los riesgos,

especialmente los cardiovasculares y metabólicos que experimentan los

sobrevivientes prematuros (Saigal & Doyle 2008).

Hay un debate sobre si el incremento de los costos del cuidado neonatal y la

carga social y económica de las discapacidades son justificados para infantes de

viabilidad límite. Los sistemas de salud cada vez incrementan más la cantidad de

nacidos prematuros y por lo tanto es necesario ser conscientes de los efectos a largo

plazo que esto trae aparejado con respecto a las discapacidades y problemas de

salud de los sobrevivientes, sus familias y la sociedad (Glass et al. 2015).

En nuestros días, la tasa de mortalidad de los nacidos prematuros está

íntimamente relacionada con la calidad de los cuidados neonatales recibidos

(Cifuentes et al. 2002). Comparado con los nacidos a término, a los prematuros les

cuesta más conservar el calor y tienen dificultades respiratorias ya que los

pulmones no han terminado de desarrollarse. A veces, pueden respirar de forma

autónoma pero padecen apnea. A su vez, tienen mayor probabilidad de sufrir

hipoglucemia, convulsiones, ictericia y kernicterus. También son frecuentes las

dificultades en la alimentación (la coordinación del reflejo de succión y deglución no

está del todo desarrollada) y la leucomalacia periventricular ya que tienen mayor

riesgo de sufrir hemorragias cerebrales durante el parto y en los días

inmediatamente posteriores a éste. Además, padecen lesiones cerebrales debido a

la falta de oxígeno. Tanto las hemorragias como la falta de oxígeno en el cerebro

pueden provocar parálisis cerebral, retraso en el desarrollo y problemas de

aprendizaje. Son usuales también las retinopatías que conducen a deficiencias

visuales o ceguera. Asimismo, poseen un mayor riesgo a sufrir infecciones (Wang et

al. 2004; Raju 2006; Kinney 2006; Escobar et al. 2006). Además, tienen mayor riesgo

de sufrir secuelas en el neurodesarrollo. Éstas incluyen, parálisis cerebral, retardo

mental y discapacidades visuales y auditivas (Rijken et al. 2003; Mikkola et al. 2005).

Los nacidos prematuros poseen también una mayor prevalencia de disfunciones

neuromotoras (Goyen et al. 1998; Hadders-Algra 2002; Davis et al. 2007). Cabe

destacar que los nacidos prematuros presentan una menor tasa de crecimiento

durante su infancia y acercándose la adolescencia alcanzan un peso normal (Ford et

al. 2000; Wood et al. 2003). Este retraso inicial seguido de un crecimiento acelerado

les confiere a los nacidos prematuros un mayor riesgo de enfermedades metabólicas

en el adulto como la diabetes tipo II y/o enfermedades cardiovasculares (Barker

1995).

No hay duda que el tiempo de gestación o grado de prematuridad ejerce la

mayor influencia en las secuelas del parto prematuro, no habiendo tiempo de

gestación que escape a la morbilidad. Más allá de las mejoras en los cuidados

intensivos de neonatología que aumentaron considerablemente la sobrevida de

los nacidos prematuros y les otorgan mejores condiciones para toda su vida, sin

lugar a duda son necesarias nuevas estrategias de prevención y reducción del

Introducción

13

parto prematuro para reducir la morbimortalidad fetal y como consecuencia

mejorar la salud de los nacidos prematuros para toda su vida.

Introducción

14

Modelando el parto prematuro inducido por inflamación

Al modelar patologías en animales de experimentación, se busca que éstos

presenten características similares a casos clínicos en términos de su etiología, vías

bioquímicas, sintomatología y tratamiento (McKinney & Bunney 1969). De esta

manera, la construcción de un modelo surge a partir de bases teóricas de su etiología y

se busca que recree la mayor cantidad de características clínicas posibles. Por

consiguiente, mediante hallazgos empíricos se busca predecir aspectos desconocidos

del desorden y estudiar respuestas farmacológicas para posibles nuevas terapias

clínicas.

Construcción de un modelo de parto prematuro inducido por inflamación

Como se mencionó anteriormente las infecciones intrauterinas durante la

gestación son la principal causa de parto prematuro debido a la inducción de un

proceso inflamatorio (Goldenberg et al. 2000). Los microorganismos y sus productos

son reconocidos por los receptores de reconocimiento de patrones, como los

receptores de la familia Toll (TLR), que inducen la producción de quimioquinas,

citoquinas, prostaglandinas y proteasas activando la vía común del parto (Romero et

al. 2014). En particular, el lipopolisacárido (LPS) es un importante factor de virulencia

de las bacterias Gram negativas que es reconocido por el receptor TLR-4 y es utilizado

en modelos de diversas patologías reproductivas por su capacidad de ser un potente

inflamógeno.

En el laboratorio hemos desarrollado un modelo murino de parto prematuro

inducido por LPS que consiste en la administración de la endotoxina en el día 15 de

gestación, lo que produce 100% de parto prematuro durante la tarde-noche de ese

mismo día (Cella et al. 2010). Este modelo cuenta con la ventaja de que el parto

prematuro ocurre en una ventana temporal pequeña y presenta una reproducibilidad

del 100%. En otros modelos el parto ocurre a lo largo de 2-3 días y/o no logran un

porcentaje tan alto de parto prematuro (Elovitz & Mrinalini 2004).

Aspectos del parto prematuro inducido por inflamación en el modelo utilizado

Las hembras preñadas de día 15 de gestación que reciben LPS presentan los

síntomas típicos de una inflamación sistémica como disminución de la ingesta de

alimento, inactividad, postura agachada, piloerección, diarrea. A su vez, hemos

observado que el LPS produce un aumento local de factores proinflamatorios como

prostaglandinas y óxido nítrico en el útero (Cella et al. 2010).

Introducción

15

Validez predictiva del modelo del modelo utilizado

Este modelo, además de permitirnos seguir investigando nuevos mecanismos

implicados en el desencadenamiento del parto prematuro, fue utilizado para

determinar la capacidad de la melatonina en retrasar o prevenir el parto prematuro.

Además este modelo no sólo nos permitió investigar las consecuencias del LPS en el

cerebro fetal y el posible efecto neuroprotector de la melatonina, sino también los

posibles efectos sobre el crecimiento y comportamiento de las crías.

Introducción

16

LPS, inflamación, parto prematuro y daño en el cerebro fetal

Lipopolisacárido

Las bacterias Gram negativas además de tener una capa de peptidoglicano, su

pared celular posee en una capa adicional. De hecho, esta capa representa una

segunda bicapa lipídica que consta de fosfolípidos, polisacáridos y proteínas. Los

lípidos y polisacáridos forman los lipopolisacáridos o LPS. Los lipopolisacáridos están

formados básicamente por tres dominios estructurales: el polisacárido, el núcleo y el

lípido A anclado a la membrana externa (Płóciennikowska et al. 2015), Figura 5.

Figura 5. Estructura del lipopolisacárido.

Una propiedad biológica importante de la membrana externa es que presenta

un efecto tóxico en sus hospedadores. No es necesario que el organismo sea

patógeno, ya que el LPS de algunas bacterias no patógenas también presenta

propiedades tóxicas que se asocian en particular con el lípido A. El LPS o también

llamado endotoxina no sólo puede causar una variedad de efectos fisiológicos como

fiebre, diarrea y vómitos sino también a dosis altas puede provocar un cuadro

inflamatorio sistémico, a menudo mortal, denominado shock séptico (Madigan et al.

2004; Fainboim & Geffner 2005). Cabe resaltar que la utilización de LPS es una de las

estrategias más comunes para estudiar fenómenos inflamatorios.

Introducción

17

LPS, estrés nitro-oxidativo y respuesta inflamatoria

El reconocimiento del LPS por el TLR-4 (toll-like receptor 4) induce estrés nitro-

oxidativo que es el resultado de un desequilibrio del sistema nitro-oxidante/anti-nitro-

oxidante; es decir, un exceso de nitro-oxidantes y/o depleción de anti-nitro-oxidantes.

Se cree que este desempeña un rol esencial en la patogénesis de muchas

enfermedades inflamatorias, no sólo a través de efectos perjudiciales directos, sino

también por su participación en los mecanismos moleculares que regulan la

inflamación. De esta manera, al producirse estrés nitro-oxidativo; las moléculas

reactivas actúan como segundos mensajeros y promueven la expresión de genes

implicados en los procesos inflamatorios (Song et al. 2007).

El NF-κB (nuclear factor kappa B) es un factor de transcripción fundamental,

implicado en regular positivamente genes inflamatorios en respuesta a cambios del

estado de óxido-reducción celular. Luego de la activación del proceso nitro-oxidativo,

el factor I-κB, el inhibidor de κB, es fosforilado y NF-κB se transloca al núcleo (Wang et

al. 2002). Una vez allí, está imposibilitado de iniciar la expresión de genes

proinflamatorios ya que el ADN está estrechamente compactado. Se requiere la

remodelación de la cromatina para permitir el acceso del NF-κB y de toda la

maquinaria transcripcional para así generar una respuesta inflamatoria. Tanto la

activación de las acetiltransferasas de histonas (HAT), como la inactivación de las

deacetilasas de histonas (HDAC) producen la acetilación de histonas que tiene como

consecuencia la apertura de los nucleosomas. Los factores de transcripción como NF-

κB y la proteína activadora AP-1 utilizan una variedad de coactivadores que tienen

actividad intrínseca HAT tales como CBP/p300 que producen la acetilación de las

histonas H3 y H4 (Perkins et al. 1997; Qin 2005; Qin et al. 2006; Kaminski & Stavnezer

2007; Schaafsma et al. 2015). Como consecuencia, el NF-κB promueve la expresión de

genes proinflamatorios a través de modificaciones en las histonas que coordinan los

cambios entre la heterocromatina (fuertemente empaquetada/inaccesible para la

transcripción) y la eucromatina (ligeramente empaquetada/accesible para la

transcripción). Su acción nuclear implica modificaciones post-traduccionales de

algunas de sus subunidades así como de las histonas que rodean los genes que modula

(Chen & Greene 2004).

Se ha descripto que el LPS activa HDAC, resultando en la desacetilación de las

histonas H3 y H4 promoviendo el silenciamiento de ciertos genes (Xing et al. 2015).

Recientemente en un modelo de inflamación del sistema nervioso central inducida por

LPS, se ha demostrado que la endotoxina mediante la activación de NF-κB produce la

acetilación de la H3 del promotor de IL-1β aumentando la expresión de esta

interleuquina (Schaafsma et al. 2015).

La activación del factor de transcripción NF-κB induce una variedad de

procesos epigenéticos como modificaciones de la acetilación de histonas y metilación

del ADN, llevando eventualmente a un aumento de la expresión de genes

Introducción

18

inflamatorios y una disminución de la expresión de genes anti-inflamatorios (Adcock

et al. 2005). La activación de NF-κB, induce la transcripción de genes pro-

inflamatorios que incluyen citoquinas (TNF-α, interleuquinas), quimioquinas,

moléculas de adhesión y enzimas inflamatorias. Con respecto a las enzimas

inflamatorias, tanto la inflamación local como la sistémica son asociadas con la

inducción de la expresión de la óxido nítrico sintasa inducible (NOSi) y la ciclo-

oxigenasa 2 (COX-2) que producen grandes cantidades de NO y prostaglandinas

respectivamente (Tomlinson et al. 1994; Salvemini 2001), Figura 6 A su vez el factor de

transcripción NF-κB, activa vías de señalización que coordinan la respuesta inmune

innata y adaptativa (Karin 2006).

Figura 6. Generación de especies reactivas de nitrógeno y oxígeno por LPS. La

endotoxina produce aumento de moléculas reactivas como el óxido nítrico (NO•) que

al reaccionar con el anión superóxido (O2-•) forma el peroxinitrito (ONOO-). El NO•

puede ser reducido a peróxido de hidrógeno (H2O2), y consecuentemente a radical

hidroxilo (OH-•). Tanto el ONOO- como el OH-• son compuestos altamente reactivos

que producen estrés nitro-oxidativo. Ésto conduce a la la activación del factor de

transcripción NF-κB que activa la transcripción de genes como el de citoquinas pro-

inflamatorias, NOSi y COX-2 (Korkmaz et al. 2012 modificado).

Introducción

19

Respuesta inflamatoria: citoquinas

A pocas horas de haberse iniciado un proceso infeccioso, se incrementan los

niveles de las citoquinas TNF-α, IL-1 e IL-6 que median el conjunto de acciones que

producen el desarrollo de un cuadro inflamatorio agudo local y sistémico. Las

acciones inflamatorias locales se ejercen sobre distintas poblaciones celulares en el

entorno inmediato del foco infeccioso y, dentro de las acciones inflamatorias

sistémicas, cabe resaltar la que se ejerce a nivel hipotalámico que induce el

incremento en la temperatura corporal mediado por la PGE2.

Las citoquinas comprenden un grupo heterogéneo de moléculas de bajo peso

molecular que modulan el sistema inmune. Son producidas y secretadas por diversos

tipos celulares, pertenecientes o no al sistema inmune y median su actividad a través

de la interacción con receptores específicos de alta afinidad, pudiendo actuar de

manera autócrina, parácrina y endócrina. Las acciones de las citoquinas suelen ser

pleiotrópicas y redundantes y en este sentido, suelen observarse efectos sinérgicos y

también efectos antagónicos entre ellas. Además, las citoquinas participan en

diferentes mecanismos efectores e inmunorreguladores, propios de la inmunidad

tanto innata como adaptativa.

El TNF-α pertenece a una familia integrada por 19 proteínas que participan en

diversas respuestas biológicas y compromete al menos a 29 receptores diferentes. El

TNF-α es producido fundamentalmente por macrófagos y ejerce múltiples actividades

conducentes a la exacerbación de la respuesta inflamatoria (Fainboim & Geffner

2005).

La IL-1 es producida en grandes cantidades por macrófagos y queratinocitos.

Se han identificado dos genes que codifican productos con similar actividad biológica:

IL-1α e IL-1β. La producción de IL-1α predomina en los queratinocitos y la de IL-1β en

los macrófagos. Al igual que TNF-α, tiene también actividad pro-inflamatoria

(Fainboim & Geffner 2005).

LPS y la respuesta inflamatoria de las citoquinas

Como se mencionó anteriormente, una vez que el LPS es reconocido por el

receptor TLR-4, este complejo desencadena una cascada de señalización que conduce

a la activación del NF-κB que induce la producción de citoquinas proinflamatorias

como TNF-α e IL-1β (Płóciennikowska et al. 2015; Navarrete et al. 2015).

Se ha demostrado que el LPS administrado de forma intraperitoneal a ratones

de la cepa BALB/c, produce un aumento en la producción de TNF-α e IL-1β por parte

de los macrófagos intraperitoneales (Liao & Lin 2015). Se ha demostrado también que

el LPS administrado por la misma vía incrementa la expresión del ARNm de TNF-α e IL-

Introducción

20

1β en distintos órganos, inclusive en el cerebro con una dosis que no perturba la

barrera hematoencefálica (Pitossi et al. 1997).

Citoquinas, parto prematuro y daño en el cerebro fetal

Como ya se mencionó, las infecciones intrauterinas durante la gestación son la

principal causa de parto prematuro. Al inducirse la respuesta inflamatoria, se produce

la activación de los macrófagos y la producción de citoquinas proinflamatorias, como

IL-1β y TNF-α, lo que genera un aumento en los niveles de prostaglandinas, la ruptura

de membranas, la maduración del cérvix y la estimulación de la contractilidad uterina

(Smaill 1996; Goldenberg et al. 2000; Ravanos et al. 2015). No sólo estas citoquinas

han sido asociadas a las infecciones prenatales intrauterinas y a los nacimientos

prematuros sino también a las infecciones neonatales y al daño cerebral neonatal. En

un modelo donde el LPS es administrado a ratas preñadas en distintos días de

gestación, se ha comprobado que la activación inmune prenatal tiene efectos a corto

y/o largo plazo sobre diversas fases de la neurogénesis en el giro dentado del

hipocampo de la descendencia. Se postula que la presencia en el plasma materno de

las principales citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6 podrían ser las

causantes del déficit en la neurogénesis provocados por el LPS (Cui et al. 2009).

Estímulos proinflamatorios recibidos por la hembra gestante durante el período

prenatal reportan un aumento agudo en la expresión basal de estas citoquinas en el

cerebro fetal (Cai et al. 2000; Meyer et al. 2006b). Tanto sea porque la infección

bacteriana llega al feto o por la capacidad de las citoquinas de atravesar la placenta y

la barrera hematoencefálica, se ha demostrado que las citoquinas pro-inflamatorias

producen estrés nitro-oxidativo y lesiones en la sustancia blanca neonatal (Dammann

& Leviton 1997; Døllner et al. 2002; Adams Waldorf & McAdams 2013; Kitanishi et al.

2014).

Introducción

21

Respuesta inflamatoria: óxido nítrico

El óxido nítrico (NO: nitric oxide) es una molécula gaseosa que presenta varias

características peculiares. Tiene una vida media corta (menor a los 30 segundos), llega

a los sitios de acción principalmente por difusión a través de las membranas celulares,

posee un electrón desapareado que la convierte en una molécula altamente reactiva y

su acción biológica está directamente relacionada con su reactividad química (Butler et

al. 1998). Es producida por diversos tipos celulares, como por ejemplo macrófagos,

células epiteliales y del músculo liso, fibroblastos y neuronas, entre otras. A su vez, una

gran variedad de evidencias experimentales demuestran de manera concluyente que

el NO desempeña un rol relevante en la fisiología del sistema nervioso, del sistema

cardiovascular y del sistema inmune (Ignarro et al. 1990; Bredt et al. 1991; Brenman &

Bredt 1996; Stuehr 1999; Bishop & Anderson 2005)

Esta molécula es sintetizada por una familia de tres enzimas llamadas óxido

nítrico sintasa (NOS: Nitric Oxide Synthase): la NOS endontelial (NOSe), la NOS

neuronal (NOSn) y la NOS inducible (NOSi). Las diversas isoformas de la NOS están

codificadas por genes distintos y difieren tanto en su estructura como en los

mecanismos regulatorios de su actividad (Bredt & Snyder 1994; Khatsenko & Kikkawa

1997). Las isoformas neuronal y endotelial son dependientes de calcio/calmodulina,

se localizan en el citosol y se activan en respuesta a un aumento en la concentración

de calcio intracelular. En cambio la isoforma inducible es regulada por endotoxinas y

citoquinas proinflamatorias, entre otros estímulos, y cataliza la síntesis de altas

concentraciones de NO.

En un comienzo, fueron divididas en constitutivas (NOSe y NOSn) e inducible

(NOSi). Sin embargo, actualmente se sabe que la expresión de la NOSe y la NOSn

también puede ser inducida y que en algunos tejidos la NOSi parece expresarse

constitutivamente (Baylis et al. 1999; Alderton et al. 2001). Otra clasificación se basa

en su dependencia al calcio. Tanto la actividad catalítica de la NOSe como de la NOSn

son dependientes de calcio/calmodulina mientras que la NOSi está unida fuertemente

a calmodulina, siendo relativamente independiente de calcio (Förstermann et al. 1991;

Alderton et al. 2001)

Los sustratos de estas enzimas son el aminoácido L-arginina, el oxígeno

molecular y la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH). Actúan

convirtiendo la L-arginina en L-citrulina y NO en cantidades equimolares, Figura 7.

Introducción

22

Figura 7. Biosíntesis del NO e isoformas de la NOS (Wolfson 2014).

La primer isoforma descripta fue la NOSn (NOS I) en cerebro, de allí la

nomenclatura “n” de neuronal, pero luego, fue encontrada en diferentes tejidos

incluyendo los reproductivos femeninos (Ali et al. 1997). La NOSi (NOS II) fue

descubierta inicialmente en macrófagos y se la nombró como la isoforma inducible

debido a que es activada por productos bacterianos como el LPS, citoquinas (TNF-α, IL-

1α, IL-1β e IL-6) y otros mediadores inflamatorios (Lowenstein et al. 1993).

Recientemente en un modelo in vitro se ha demostrado que el LPS aumenta la

expresión de NOSi a través de la acetilación de histonas (Choi et al. 2015). Se sabe que

una vez activada, genera NO en grandes cantidades y por largos períodos (Alderton et

al. 2001; Pacher et al. 2007). La NOSe (NOS III) se identificó por primera vez en el

endotelio de los vasos sanguíneos y luego en pulmón e hígado (Pollock et al. 1991;

Springall et al. 1992). Es una proteína asociada generalmente a la membrana de células

endoteliales. También se ha postulado la existencia de una cuarta isoforma llamada

NOS mitocondrial (Brookes 2004; Yao et al. 2010).

El NO, a través de la activación de una guanilato ciclasa soluble (GCs), produce

la formación de guanosina monofosfato cíclico (GMPc), un segundo mensajero. Si bien

las guanilato ciclasas (GC) pertenecen a una gran familia de proteínas, sólo las

isoformas solubles que contienen un grupo hemo son blanco de la activación por NO.

Esto se debe a que el NO tiene una alta afinidad y reactividad por el complejo de hierro

reducido (Fe2+) que conforma al hemo. La unión del NO a este grupo modifica su

conformación, alterando la actividad de la enzima (Ignarro 1991). De esta manera, la

GCs es activada por el NO, produciendo GMPc a partir de guanosina trifosfato (GTP). La

actividad del segundo mensajero GMPc finaliza por la rápida conversión a GMP

catalizada por varias fosfodiesterasas (Ignarro 1991).

Los múltiples efectos del NO pueden ser producidos en forma directa o por la

combinación con especies reactivas de oxígeno (ROS) para formar especies reactivas

de gran poder oxidativo (Grisham et al. 1999). Cabe aclarar que la formación de ROS,

es decir, radicales libres y otras moléculas que pueden convertirse en radicales libres o

Introducción

23

que son oxidantes fuertes, es una consecuencia insoslayable del metabolismo celular.

El O2 tiene un rol central en la célula como aceptor final de la cadena de transporte de

electrones a través de la cual se transforma en H2O, pero una pequeña proporción del

O2 no se reduce completamente, generando ROS. De esta forma, el oxígeno puede

reducirse sucesivamente a anión superóxido (O2-•) al incorporar un electrón, a

peróxido de hidrógeno (H2O2) al aceptar dos electrones y a radical hidroxilo (OH-•) al

aceptar tres electrones. Dentro de las especies reactivas de nitrógeno (RNS) no sólo

cabe resaltar al óxido nítrico (NO•), sino también al peroxinitrito (ONOO-) (Belforte

2011). El peroxinitrito es una molécula con una potente actividad citotóxica y pro-

inflamatoria (Beckman et al. 1990; Salvemini et al. 1998; Misko et al. 1998; Virág et al.

2002), (figura 6).

El NO posee múltiples funciones y participa tanto en procesos fisiológicos como

patológicos (Beckman 1996). Por un lado, puede actuar como secuestrador de

radicales libres e inactivar al radical superóxido, previniendo la citotoxicidad celular

(Cooke & Tsao 1993). En otras circunstancias, el NO reacciona con el anión superóxido

y genera el radical peroxinitrito (ONOO-), una potente molécula que produce un alto

nivel de citotoxicidad (Beckman & Crow 1993).

Los radicales libres pueden provocar modificaciones estructurales irreversibles

en moléculas de gran relevancia biológica como lípidos, proteínas o ácidos nucleicos.

Estos cambios provocan respuestas que van desde modulaciones sutiles de la

señalización celular a un excesivo daño oxidativo que lleva a la célula a morir por

necrosis o apoptosis (Pacher et al. 2007).

En respuesta a una infección bacteriana y a una gran variedad de mediadores

extracelulares, incluyendo a las endotoxinas y citoquinas inflamatorias, la vía del NF-

κB representa una de las más relevantes en la señalización que media la inducción de

la expresión de NOSi (Mollace et al. 2005). La regulación de la NOSi está altamente

asociada a la respuesta inflamatoria y las altas concentraciones de NO que produce

actúan como una molécula citostática y citotóxica (Stefano & Kream 2011). Los

factores que parecen regular los niveles de NO incluyen el tipo estímulo, el tipo de

tejido, el nivel y la duración de la inducción de la expresión de la NOSi y

probablemente el estado redox celular (Cuzzocrea & Reiter 2002).

Introducción

24

LPS y la respuesta inflamatoria del NO

El reconocimiento del LPS por el TLR-4 activa la vía del NF-κB que aumenta la

expresión de NOSi y los niveles de NO (Stefano & Kream 2011; Schaafsma et al. 2015;

Lee et al. 2015). Se ha demostrado también que el NO producido por la NOSn tiene un

papel fundamental en la transcripción de genes inflamatorios mediados por TLR-4,

regulando la intensidad y duración de la respuesta inmune (Baig et al. 2015).

Las funciones regulatorias del NO durante la inflamación están bien estudiadas.

Produce vasodilatación, conduce a un aumento en la permeabilidad vascular con la

consiguiente formación de edema e inhibe la agregación plaquetaria (Schmidt &

Walter 1994). A su vez, el NO participa como un agente proinflamatorio promoviendo

el aumento en la producción de citoquinas, la expresión de moléculas de adhesión de

leucocitos y la infiltración de neutrófilos en los tejidos durante la inflamación aguda o

crónica (Cuzzocrea, Mazzon, et al. 2000; Hierholzer et al. 1998; McInnes et al. 1998;

Cuzzocrea et al. 1998).

Como se mencionó anteriormente, también durante el proceso inflamatorio se

producen en abundancia ROS que favorecen la producción de peroxinitrito (ONOO-)

(Angele et al. 1998). Mientras que el ONOO- inactiva muchas enzimas, también

aumenta la actividad catalítica de otras, como por ejemplo de la COX-2 (Cuzzocrea &

Reiter 2002; Aisemberg et al. 2007), (figura 6).

NO, parto prematuro y daño en el cerebro fetal

El NO cumple importantes funciones durante la preñez (Sladek & Roberts

1996). Se ha informado que la expresión basal de la NOSi en el útero y la producción

de NO se asocia con el mantenimiento de la quiescencia del órgano, necesaria para

que la gestación llegue a término (Izumi & Garfield 1995; Dong et al. 1996; Farina et al.

2001). En nuestro laboratorio, se evaluó la producción uterina de NO en el último

tercio de la gestación, desde el día 13 al 19, para inferir sus niveles durante la etapa

final de la gestación normal hasta el parto a término. Encontramos que en la cepa

BALB/c, la producción uterina de NO permanece constante entre los días 13-16 y

disminuye significativamente en los días 18 y 19 (Cella et al. 2010). Sólo la expresión de

la NOSi uterina disminuyó gradualmente conforme se acerca el momento del parto,

mientras que no se hallaron variaciones en la expresión de las NOSn y NOSe en el

tejido (Cella 2007). Estos resultados son coincidentes con los que postulan que la

disminución de la síntesis de NO y de la expresión de la NOSi preceden al inicio del

parto, sugiriendo un papel protector de NO durante la preñez (Yallampalli et al. 1993).

Existen numerosos antecedentes que demuestran un aumento en la

concentración de NO mediado por la expresión exacerbada de la NOSi en procesos

inflamatorios y de sepsis (Mollace et al. 2005). En nuestro modelo de parto prematuro

Introducción

25

inducido por LPS, a diferencia de lo que ocurre en el parto a término, observamos un

aumento en la actividad de la NOS, antes del inicio del parto, que es acompañado por

un aumento en la expresión proteica de la enzima NOSi uterina. Al igual que en el

parto a término, en el modelo de parto prematuro inducido por LPS no se hallaron

variaciones en la expresión de las NOSn y NOSe uterinas (Cella et al. 2010).

Estos resultados sugieren que la isoforma NOSi es la principal responsable de

las variaciones en la producción de NO observadas tanto en el parto a término como

en el parto prematuro. Pero mientras que en el parto a término la caída de la

producción de NO y del nivel proteico de la NOSi favorecen las contracciones uterinas,

en el modelo de parto prematuro se observa el efecto contrario. A su vez, la

administración de aminoguanidina (AG), un inhibidor selectivo de la actividad de la

NOSi, revierte el parto prematuro inducido por LPS en un 45% de los casos y retrasa

alrededor de 20 horas el parto en otro 40 % (Cella et al. 2010). En conjunto, estos

datos sugieren que el NO producido por la NOSi cumple un rol significativo en el

proceso de parto prematuro inducido por el LPS.

Aunque la NOSi es una fuente bien establecida de óxido nítrico durante la

inflamación del sistema nervioso central, menos se sabe acerca de la participación de

las otras isoformas en el proceso inflamatorio. Czapski y colaboradores estudiaron de

forma comparativa la expresión y actividad de las diversas isoformas de las NOS en el

cerebro de ratón, en un modelo de inflamación sistémica inducida por la

administración intraperitoneal de LPS y los resultados indican que las tres isoformas

contribuyen al aumento en los niveles de NO (Czapski et al. 2007). Asimismo, se

observó que el LPS aumenta la expresión tanto de NOSi como de la NOSn en el cerebro

de ratas y ratones, cambios que fueron asociados a daño en la sustancia blanca (Zhou

et al. 2005; Yao et al. 2010). A su vez, se observó que la inyección

intracerebroventricular de inhibidores tanto de la NOSn como de la NOSi atenúan la

fiebre inducida por LPS en ratas (Soszynski & Chelminiak 2007).

Introducción

26

Respuesta inflamatoria: prostaglandinas

Casi todas las células, exceptuando los glóbulos rojos, producen

prostaglandinas, potentes mensajeros lipídicos involucrados tanto en procesos

fisiológicos como patológicos. Las prostaglandinas, al igual que los tromboxanos y los

leucotrienos, se denominan genéricamente eicosanoides. La palabra eicosanoide

proviene de vocablos griegos: eicosa (veinte) y eidos (forma). Todos ellos son derivados

de ácidos grasos de 20 carbonos, sintetizados por las células animales a partir de

ácidos grasos esenciales provenientes de la dieta, como lo son el ácido linoleico, el

ácido γ-linolénico o el ácido araquidónico. En particular nuestra dieta es rica en ácido

araquidónico (AA), siendo éste el precursor lipídico más abundante. EL AA se

encuentra unido a fosfolípidos de membrana, con lo cual debe ser liberado por

fosfolipasas movilizadoras que lo hacen accesible a las enzimas metabolizantes. Una

vez liberado el AA libre puede seguir dos vías separadas, la vía metabólica cíclica que

da lugar a las prostaglandinas y los tromboxanos o la vía metabólica lineal, a través de

la cual se forman otros derivados del AA, como los leucotrienos. La vía metabólica

cíclica está a cargo de un complejo enzimático llamado sintasa de prostaglandina H

(PGH) o ciclo-oxigenasa (COX) (Gimeno et al. 1985). Una vez que el AA es liberado de

los fosfolípidos de la membrana celular por la fosfolipasa A2 (PLA2), las ciclo-

oxigenasas por dos pasos de conversión lo metabolizan a la prostaglandina H2 (PGH2).

Como la PGH2 es un intermediario inestable, es convertida rápidamente por las

sintasas de prostaglandinas en metabolitos que son relativamente más estables, entre

ellos la prostaglandina E2 (PGE2) y la prostaglandina F2α (PGF2α). En ciertos tejidos, la

PGE2 puede ser convertida en prostaglandina PGF2α por acción de la 9-ceto-reductasa,

en una reacción reversible (Gimeno et al. 1985), Figura . Las prostaglandinas producen

su acción al unirse a receptores celulares específicos de membrana o intracelulares.

Las enzimas limitantes en la vía de síntesis de las prostaglandinas son las ciclo-

oxigenasas. Hasta el momento se han identificado dos isoformas, COX-1 y COX-2. Cada

una es codificada por un gen distinto, siendo similares en su estructura aminoacídica

(Lin et al. 1989; Tsai et al. 1991).

Introducción

27

Figura 8. Transformación del AA en PGE2 y PGF2α (Bariani 2012 modificado).

Las prostaglandinas se sintetizan a demanda al liberarse el AA frente a

estímulos específicos y tienen acción evanescente ya que son rápidamente

catabolizadas principalmente en el pulmón. Por lo tanto, los niveles de prostaglandinas

están determinados por un balance entre los procesos de síntesis y degradación donde

ambos procesos son de corta duración.

Con respecto a las ciclo-oxigenasas, la COX-1 fue la primera isoforma

identificada, presenta localización generalizada y si bien se expresa constitutivamente

en la mayoría de las células de mamíferos, sus niveles pueden ser regulados (Wu 1995;

Dong & Yallampalli 1996). Es una de las principales enzimas encargadas de la

protección de las mucosas y del mantenimiento de la homeostasis celular normal

(Whittle et al. 1980; Wu 1995). En cambio, la COX-2 está selectivamente distribuida,

expresándose principalmente en células endoteliales, del músculo liso y en macrófagos

y su expresión se induce a partir de estímulos como LPS, citoquinas y hormonas, entre

otros (Salvemini et al. 1993). Esta isoforma es relevante en los procesos de ovulación,

parto e inflamación (Xie et al. 1992). Cabe resaltar que las prostaglandinas son

importantes en la regulación varios procesos reproductivos femeninos como la

menstruación, la ovulación, la implantación, el mantenimiento de la preñez y el inicio

del parto (J. A. Arosh et al. 2004; J A Arosh et al. 2004; Brosin 1968). Los ratones

deficientes en COX-1, presentan retraso o dificultades al momento del parto, fenotipo

que se revierte administrando PGF2α. En cambio, los ratones deficientes en COX-2 son

infértiles ya que casi ningún ovocito es fertilizado y en el caso de que ocurra

fertilización, no hay implantación (Lim et al. 1997; Lim et al. 1999; Davis et al. 1999).

También las prostaglandinas tienen un papel fundamental en el proceso

inflamatorio, en especial con el inicio del trabajo de parto. La presencia de citoquinas

Introducción

28

y estrógenos promueven la producción de prostaglandinas en las células del

miometrio, la unidad fetoplacentaria (PGE2) y sobre todo por parte de la decidua

materna (PGF2α) en momentos cercanos al parto. La PGE2 promueve principalmente la

maduración cervical y favorece la rotura espontánea de las membranas fetales. La

PGF2α parece actuar principalmente sobre el miometrio, aumentando su

contractilidad. Estos eventos ejercen una acción de retroalimentación positiva,

estimulando aún más la liberación de la hormona liberadora de corticotropina o CRH

(en sus siglas en inglés) por parte de la placenta, que produce un aumento de la

concentración intraamniótica de cortisol, prostaglandinas y metaloproteinasas, que

finalmente conducen a la activación de las membranas fetales y al inicio del parto

(Petraglia et al. 1991; Sun et al. 2006; Ravanos et al. 2015). Asimismo, por sus

propiedades uterotónicas y por la regulación positiva que ejercen sobre la expresión

de los receptores de oxitocina, las prostaglandinas son utilizadas terapéuticamente

para inducir el parto y por la misma razón, tanto la PGE2 como la PGF2α, pueden ser

abortivas en las primeras semanas de embarazo (Katzung 1992; Aisemberg et al. 2007).

LPS y la respuesta inflamatoria de las prostaglandinas

Como mencionamos anteriormente, la unión del LPS a su receptor TLR-4 activa

la vía del NF-κB que además de inducir la NOSi también promueve el aumento de COX-

2 y el consecuente incremento en los niveles de PGE2 y PGF2α (Thiex et al. 2010; Lee et

al. 2015; Joung et al. 2015). La COX-2 es una enzima de reconocida participación tanto

en el inicio como en la resolución de la respuesta inflamatoria. En un estadio temprano

sintetiza PGE2 y tardíamente prostaglandinas antiinflamatorias como PGD2 y 15-deoxi-

Δ12-14-PGJ2 (Wallace et al. 1998; Gilroy et al. 1999). A pesar del rol primario que

parece desarrollar la COX-2 en este contexto, se ha demostrado que prostanoides

sintetizados por la COX-1 también están involucrados (Wallace et al. 1998; Langenbach

et al. 1999).

Las prostaglandinas son consideradas potentes mediadores de la inflamación.

En enfermedades causadas por infección o inflamación, suceden un conjunto de

respuestas que incluyen fiebre, anorexia, somnolencia, hiperalgesia y secreción

elevada de corticoides, todas ellas mediadas por las prostaglandinas que actúan sobre

el cerebro (Saper et al. 2012). Por ejemplo, en modelos animales de inflamación

sistémica inducidos por la administración de LPS o IL-1β, se ha visto un aumento en los

niveles de COX- 2 y de PGE2 en las células endoteliales y macrófagos perivasculares del

cerebro. A su vez, se ha demostrado que no sólo la PGE2 sintetizada en el cerebro, sino

también la producida en la periferia son importantes en la respuesta febril (Furuyashiki

& Narumiya 2011; Poon et al. 2015).

En lo que respecta a la síntesis y liberación de óxido nítrico y prostaglandinas,

cabe destacar que comparten una serie de similitudes. Por un lado, en circunstancias

normales las isoformas constitutivas de las enzimas (NOSe, NOSn y COX-1) se

Introducción

29

encuentran en prácticamente todos los órganos y regulan importantes procesos

fisiológicos como por ejemplo, la actividad antiplaquetaria, la vasodilatación y la

citoprotección. Por otro lado, en la inflamación las isoformas inducibles de estas

enzimas (NOSi y COX-2) se expresan en ciertas células, resultando en la producción de

grandes cantidades de óxido nítrico y prostaglandinas. A su vez, es importante

señalar que existe interacción molecular entre las vías metabólicas del NO y de las

prostaglandinas (Mollace et al. 2005). Estudios realizados en nuestro laboratorio

indican que el NO estimula la motilidad uterina vía PGE2 y que el aumento en la

síntesis de prostaglandinas inducido por IL-1 e EGF es mediado por NO en el útero de

rata (Franchi et al. 1994; Franchi et al. 1998; Ribeiro et al. 1999; Farina et al. 2000). En

nuestro modelo de parto prematuro observamos un efecto dual del NO sobre la

síntesis uterina de prostaglandinas. Bajas concentraciones de NO reducen los niveles

de PGE2 y PGF2α, y en cambio a altas concentraciones de NO se observa un aumento en

los niveles de prostaglandinas (Cella et al. 2010).

Prostaglandinas y parto prematuro

Tanto la PGE2 como la PGF2α, cumplen importantes funciones durante la preñez

y son las responsables del desencadenamiento de las contracciones uterinas

necesarias para la expulsión fetal (Romero et al. 1994; Bukowski et al. 2001). Se ha

informado aumento en la expresión de COX-2 y de la producción de PGE2 y PGF2α

uterinas hacia el final de la preñez (Vane & Williams 1973; Gu et al. 1990). En nuestro

laboratorio también evaluamos la participación del sistema COX/PG en el último tercio

de la preñez normal en ratones BALB/c. La producción uterina de PGE2 y PGF2α

aumenta y alcanza los máximos niveles en los momentos previos al parto (Cella et al.

2010). Sólo la expresión de la COX-2 uterina aumentó gradualmente en concordancia

con el aumento de PG, mientras que no se hallaron variaciones en la expresión de

COX-1 en el mismo tejido (Cella 2007). Estos resultados son coincidentes con los que

postulan que un aumento en la expresión de la COX-2 y en los niveles de PGE2 y PGF2α

preceden el inicio del parto (Mogami et al. 2013). Reafirmando esto, en el laboratorio

hemos observado que al tratar a las hembras preñadas en el último día de la gestación

con indometacina (un inhibidor no selectivo de las ciclo-oxigenasas) o con meloxicam

(un inhibidor selectivo de la COX-2), hay un retraso en el inicio del parto acompañado

de una disminución en los niveles proteicos COX-2. Estos resultados sugieren que las

prostaglandinas producidas por el útero serían esenciales para el desencadenamiento

del parto a término (Cella 2007).

Como se mencionó anteriormente, existen numerosos antecedentes que

demuestran que el aumento en la concentración de prostaglandinas mediado por la

expresión exacerbada de la COX-2 es clave en los procesos inflamatorios y de sepsis

(Mollace et al. 2005). En nuestro modelo de parto prematuro inducido por LPS, al

Introducción

30

igual que en el parto a término, se observa un incremento en la producción uterina de

PGE2 y PGF2α previo al inicio del parto, que es acompañado por un aumento en la

expresión proteica de la COX-2 uterina. Al igual que en el parto a término, en nuestro

modelo de parto prematuro no se hallaron variaciones en la expresión uterina de COX-

1. Estos resultados sugieren que la isoforma COX-2 es la principal responsable de las

variaciones en los niveles de las PGE2 y PGF2α, observadas tanto en el parto a término

como en el parto prematuro inducido por LPS siendo las responsables de las

contracciones uterinas. A su vez, la administración de meloxicam, un inhibidor

selectivo de COX-2, revierte el parto prematuro inducido por LPS en un 90% de los

casos (Cella et al. 2010). En conjunto, estos datos sugieren que las PGE2 y PGF2α

producidas por la COX-2 serían cruciales también para el desencadenamiento del parto

prematuro inducido por el LPS.

Introducción

31

Consecuencias de la inflamación prenatal sobre las crías

La infección y la inflamación intrauterina son factores de riesgo de daño

cerebral en el recién nacido, independientemente de su edad gestacional. La

activación del sistema inmune materno induce una respuesta inflamatoria fetal

mediada por citoquinas que se ha implicado no sólo en el desarrollo de la leucomalacia

periventricular y la parálisis cerebral, sino también en un espectro de trastornos del

neurodesarrollo que incluyen al autismo y a la esquizofrenia (B H Yoon et al. 2000;

Vargas et al. 2005; Patterson 2009).

Han sido descritas diferentes infecciones uterinas, sus influencias en el

neurodesarrollo fetal y sus consecuencias a corto y largo plazo. La infección bacteriana

comienza con una cascada inflamatoria que resulta en lesiones en los pulmones y el

cerebro fetal debidas a un aumento en los niveles de citoquinas y del estrés nitro-

oxidativo (Burd, Chai, Gonzalez, Ofori, Monnerie, Peter D. Le Roux, et al. 2009; Adams

Waldorf & McAdams 2013). Dicho en otras palabras, la desregulación inmune en el

cerebro fetal durante el desarrollo parece ser el enlace entre la inflamación

intrauterina y los trastornos neuroconductuales asociados (Patterson 2009). El feto se

verá afectado de manera diferencial por esta exposición, dependiendo de la fase

gestacional en la que ocurra. Una vez que alcanzan el cerebro fetal, las citoquinas

afectan los procesos de desarrollo del sistema nervioso central en curso y por ello el

patrón preciso de las consecuencias en el adulto estará determinado por el momento

en el que ocurre la inflamación, su naturaleza y su intensidad (Depino 2015).

Los estudios realizados en animales donde se modela inflamación durante la

gestación han tenido un papel clave en la elucidación de los mecanismos implicados en

las lesiones cerebrales fetales que producen activación microglial, neurotoxicidad,

déficit motores y anormalidades en el comportamiento en las crías (Meyer et al.

2006a; Saadani-Makki et al. 2008; Burd, Chai, Gonzalez, Ofori, Monnerie, Peter D Le

Roux, et al. 2009; Burd et al. 2010). Se ha demostrado fehacientemente la causalidad

del momento gestacional en que el animal recibe el desafío inmunológico y la

respuesta observada en cuanto al desarrollo neurológico del feto (Meyer et al. 2006a).

Por lo tanto, una mejor comprensión de los mecanismos de la lesión cerebral

perinatal permitiría postular agentes neuroprotectores novedosos para terapias

destinadas a disminuir las secuelas en los fetos y neonatos (Burd et al. 2012).

Inflamación prenatal, modificaciones epigenéticas y consecuencias en la descendencia

Los cambios epigenéticos constituyen un mecanismo regulatorio de la

expresión de genes (Probst et al. 2009). Estos cambios están dados principalmente por

el grado de metilación del ADN, diversas modificaciones post-traduccionales de

histonas (acetilación, metilación y fosforilación) y el remodelamiento de la cromatina

(Portela & Esteller 2010). Estas modificaciones regulan el grado de compactación de la

Introducción

32

cromatina y en consecuencia la accesibilidad de la maquinaria de transcripción al ADN

(Blaze & Roth 2013). Para el correcto desarrollo y funcionamiento de las neuronas se

requieren la expresión regulada de un gran número de genes, siendo las

modificaciones epigenéticas la forma fundamental en que éstas adaptan su respuesta

transcripcional frente a las señales ambientales (Riccio 2010).

Estímulos recibidos durante el desarrollo, como la inflamación prenatal,

pueden provocar modificaciones epigenéticas en múltiples tejidos, incluyendo el

cerebro, que pueden traer aparejadas consecuencias a corto y a largo plazo (Borrelli

et al. 2008; Hirabayashi & Gotoh 2010; Riccio 2010; Monk et al. 2012; Benoit et al.

2015).

Introducción

33

Melatonina

La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina) es una indolamina lipofílica que

es segregada principalmente por la glándula pineal durante la noche (Figura gura 9).

Los efectos de la glándula pineal y la melatonina fueron inicialmente definidos en

términos de la fisiología endocrina, particularmente en relación con la

neuroendocrinología del eje reproductivo (Reiter 1980). Con el tiempo, las acciones

de la melatonina trascendieron por sus efectos a nivel celular en una gran variedad

de células y tejidos que no se consideraban endócrinos (Reiter 1991).

Esta hormona neuroendócrina tiene múltiples funciones. Principalmente

regula el ritmo circadiano, es un modulador endócrino y del sistema inmune, tiene

efecto cito-protector, secuestra radicales libres y directa e indirectamente es un

antioxidante (Tamura et al. 2008).

Figura 9. Estructura química de la melatonina

Los niveles de melatonina materna en plasma se encuentran elevados

durante el embarazo, siendo máximos a fines de la gestación (Nakamura et al. 2001;

Voiculescu et al. 2014). Se cree que esta hormona es esencial para que un embarazo

sea exitoso, ya que contribuye al mantenimiento de la preñez estimulando la

producción de progesterona e inhibiendo la síntesis de prostaglandinas y la

contractilidad uterina. A su vez, una desregulación de la vía de la melatonina

parecería estar relacionada con diversas patologías de la reproducción (Tamura et

al. 2008).

Esta indolamina tiene la capacidad de atravesar todas las barreras

morfofisiológicas, como por ejemplo la placenta y la barrera hematoencefálica

(Okatani et al. 1998; Okatani et al. 2000), (fFigura 10). Por consiguiente, la

melatonina materna ingresa fácil y rápidamente a la circulación fetal y le provee

información del fotoperíodo al feto. Es así como la información recibida por la

madre, tiene un rol en sincronizar la fisiología fetal (Reppert 1985). Luego del

nacimiento, el neonato no produce melatonina hasta el segundo-cuarto mes de vida

Introducción

34

dando lugar a una ausencia transitoria de la misma (Tauman et al. 2002; Jimenez-

Jorge et al. 2007).

Figura 10. La melatonina es capaz de atravesar la

placenta la barrera hemato-encefálica (Reiter et al. 2009)

Muchas de las acciones de la melatonina están mediadas por la interacción

con sus receptores de membrana acoplados a proteína G tipo 1 y tipo 2 (MT1 y MT2,

respectivamente) o indirectamente a través de los receptores nucleares huérfanos

de la familia RORα/RZR (del inglés retinoid orphan receptors/retinoid Z receptors),

aunque existen controversias con respecto a si la hormona realmente se une a éstos

últimos (Slominski et al. 2012). También se une a la quinona reductasa II, definida

como el receptor MT3. Los receptores de melatonina están ampliamente

distribuidos en el organismo. Múltiples evidencias demuestran que la melatonina

siendo una molécula altamente lipofílica podría participar en funciones

pleiotrópicas no mediadas por receptor. En este contexto, actuaría como

antioxidante confiriéndole protección a la célula frente a los radicales libres (Reiter

1995; Reiter et al. 1997; Korkmaz et al. 2012).

En el miometrio humano se han detectado los receptores MT1 y MT2, cuyos

niveles de expresión difieren entre mujeres embarazadas y no embarazadas

(Schlabritz-Loutsevitch et al. 2003). Hasta el momento, en el miometrio de ratón sólo

se ha descrito el receptor MT2 (He et al. 2015).

Los receptores MT1 y MT2 también se expresan en diversas partes del sistema

nervioso central tanto en el humano como en el ratón (núcleo supraquiasmático,

hipocampo, la corteza cerebelosa, la corteza prefrontal, los ganglios basales, entre

otros) (Imbesi et al. 2006; Pandi-Perumal et al. 2008). Hasta el momento en el cerebro

fetal de humano y de rata sólo se ha detectado la expresión del receptor MT1 (Thomas

et al. 2002; Johnston et al. 2006). Pero, teniendo en cuenta su alta lipofilicidad así

como su capacidad para atravesar fácilmente la barrera hematoencefálica, la

Introducción

35

melatonina podría llegar a ser una molécula eficaz e importante en el sistema de

defensa antioxidante, especialmente a nivel del sistema nervioso central (Reiter 1995).

La melatonina, una molécula anti-oxidante y anti-inflamatoria

La melatonina es un antioxidante de amplio espectro cuya potencia se

relaciona directamente con su capacidad combinada de secuestrar radicales libres,

de incrementar la actividad y/o expresión de enzimas antioxidantes y de reducir la

pérdida de electrones de la cadena de transporte electrónico mitocondrial (Reiter et

al. 2003; Rodriguez et al. 2004; León et al. 2005; Hardeland 2008). No sólo la

melatonina endógena, en concentraciones fisiológicas, contribuye a la capacidad

antioxidante del organismo, sino también la exógena, en concentraciones

farmacológicas, confiere protección contra el daño por radicales libres (Reiter et al.

1999). La melatonina fue comparada contra antioxidantes clásicos en diversos

modelos donde se producen masivamente radicales libres y resultó ser equivalente

o en algunos casos más efectiva en otorgar protección o reducir los niveles de

radicales libres (Cadenas & Barja 1999; Hsu et al. 2000; Montilla et al. 2001; Jou et

al. 2004; Martínez-Cruz et al. 2006).

Como se mencionó anteriormente, el estrés nitro-oxidativo es el resultado

de un desequilibrio del sistema nitro-oxidante/anti-nitro-oxidante, es decir, un

exceso de nitro-oxidantes y/o depleción de anti-nitro-oxidantes. Éste se cree que

desempeña un rol esencial en la patogénesis de muchas enfermedades

inflamatorias, no sólo a través de efectos perjudiciales directos, sino también por su

participación en los mecanismos moleculares que regulan la inflamación. Una gran

cantidad de estudios experimentales han documentado que la melatonina ejerce

importantes acciones antiinflamatorias. Por un lado, por su eficacia en bloquear el

estrés nitro-oxidativo y por otro lado, por su capacidad de modular distintos

factores involucrados en la respuesta inmune (Korkmaz et al. 2012).

Con respecto a la eficacia en bloquear el estrés nitro-oxidativo, fue

demostrado que la melatonina y sus metabolitos son importantes secuestradores de

especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno (Barlow-Walden et al. 1995; Pablos et

al. 1995; Pablos et al. 1998; Blanchard et al. 2000; Turjanski et al. 2001; Hardeland

2005; Winiarska et al. 2006). Asimismo, es un potente inhibidor del sistema

nitrérgico dado que a concentraciones fisiológicas inhibe tanto el influjo de L-

arginina, sustrato en la síntesis de NO, como la actividad de NOS (Sáenz et al. 2002).

La melatonina también aumenta la actividad y los niveles de ARNm de enzimas anti-

oxidantes tanto en condiciones fisiológicas como ante elevados niveles de estrés

oxidativo (Rodriguez et al. 2004; Tomás-Zapico & Coto-Montes 2005). Los

Introducción

36

mecanismos precisos por los cuales la melatonina estimula las enzimas anti-

oxidantes quedan aún por esclarecerse, pero uno de los mecanismos propuestos

sería mediante el factor nuclear eritroide 2 (Nrf2), (Korkmaz et al. 2012; Santofimia-

Castaño et al. 2015). El Nrf2 es un factor de transcripción implicado en regular

positivamente genes antioxidantes en respuesta a cambios en el estado de óxido-

reducción celular (Li et al. 2009). La melatonina mediante modificaciones

epigenéticas estaría incrementando la expresión de Nrf2 (Jung et al. 2010). Por lo

tanto, se postula que existe una regulación diferencial de la expresión de

determinados genes por parte de la melatonina en condiciones de estrés nitro-

oxidativo. Algunas de las acciones antioxidantes de la melatonina se esquematizan

en la figura 11.

Varios estudios indican que la melatonina tiene múltiples vías para llevar a

cabo sus acciones anti-inflamatorias, por ejemplo inhibiendo la liberación de

citoquinas pro-inflamatorias, como TNF-α e IL-1β (Cuzzocrea, Costantino, et al. 2000;

Cuzzocrea et al. 2001). Las acciones genómicas de la melatonina se expandieron en

cuanto se demostraron sus acciones sobre el NF-κB. La activación de este factor de

transcripción induce una variedad de procesos epigenéticos, como modificaciones

de la acetilación de histonas y metilación del ADN, llevando eventualmente a un

aumento de la expresión de genes inflamatorios y/o a una disminución de la

expresión de genes anti-inflamatorios (Adcock et al. 2005). La melatonina al

bloquear la interacción del NF-κB con el ADN (Mohan et al. 1995; Chuang et al.

1996), en parte ,inhibiría la expresión de citoquinas pro-inflamatorias como TNF-á e

IL-1β (Sasaki et al. 2002; Li et al. 2005) y de enzimas pro-inflamatorias como COX-2 e

iNOS (Dong et al. 2003; Deng et al. 2006). Varios trabajos muestran efectos

antiinflamatorios de la melatonina a través de la inhibición selectiva de la NOSi y la

COX-2 (Brzozowska et al. 2002) como consecuencia de la supresión de la activación

del NF-κB (Mohan et al. 1995; Esposito et al. 2008) y/o la expresión de p300-HAT

dentro del núcleo (Deng et al. 2006). Por ejemplo, Jung y colaboradores

demostraron que la melatonina reduce los niveles elevados de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-

8 y NOSi mediante la inhibición de NF-kB (Jung et al. 2010). Asimismo, Negi y

colaboradores informaron que la melatonina disminuye la neuroinflamación y el

estrés oxidativo en un modelo de neuropatía diabética a través de la inhibición del

NF-κ B y mediante una reducción significativa en la expresión de NOSi, COX-2, IL-6 y

TNF-α en los nervios ciáticos (Negi et al. 2011). Otro trabajo, utilizando la línea

celular VSM CRL1999 estimulada con LPS, demostró que la incubación con

melatonina inhibe significativamente la expresión de TNF-α, IL-1β, COX-2, NOSi y la

producción de PGE2 y NO de forma dosis dependiente. En este caso, la melatonina

bloqueó la unión del NF-κB a los promotores y suprimió la actividad HAT de p300 y

con ello la acetilación del NF-kB. Es importante destacar que la melatonina no inhibe

las isoformas constitutivas de las NOS ni la COX-1. Estos resultados suman evidencias

al hecho de que la melatonina suprime mediadores pro-inflamatorios, vía NF-kB y

Introducción

37

p300, y sugieren a la homona como un potencial candidato para el tratamiento de

trastornos pro-inflamatorios (Shi et al. 2012).

Surge la posibilidad de que no sólo la melatonina disminuya la capacidad de

unión del NF-κB al ADN sino que también influya sobre sus niveles de expresión. Lo

que se postula es que la melatonina mediante modificaciones epigenéticas estaría

disminuyendo la expresión de este factor de transcripción (Tripathi & Jena 2010).

Algunas de las acciones antiinflamatorias de la melatonina se esquematizan en la

Figura 11.

Figura 11. Acciones anti-oxidantes y anti-inflamatorias de la melatonina. La melatonina exhibe su potencial beneficioso en una variedad de formas: i) Secuestra especies reactivas de nitrógeno y junto con sus metabolitos secuestran especies reactivas de oxígeno. ii) Induce la expresión de genes de enzimas anti-oxidantes mediante modificaciones epigenéticas que incrementan la expresión de Nrf2. iii) Suprime la expresión de genes pro-inflamatorios a través de la disminución de la capacidad de unión al ADN del NF-κB y mediante modificaciones epigenéticas que disminuyen su expresión.

Introducción

38

La melatonina como fármaco

Son múltiples los usos farmacológicos de la melatonina, en parte porque

esta indolamina es una molécula inusual por su inocuidad, con ausencia de

toxicidad a concentraciones excepcionalmente altas (≤ 200 mg/kg por día) incluso

durante la gestación (Jahnke et al. 1999). Para prevenir patologías reproductivas

donde se producen elevados niveles de estrés oxidativo, se necesitan dosis

farmacológicas de antioxidantes que tengan un perfil de baja toxicidad. Hasta el

momento, en humanos la melatonina ha sido probada en mujeres con restricción

del crecimiento intrauterino y preclampsia con el objetivo de proteger a la placenta,

al feto y a la madre de los daños ocasionados por el estrés oxidativo (Alers et al.

2013; Hobson et al. 2013).

Entre los usos farmacológicos de la melatonina, cabe destacar su efecto

neuroprotector en el cerebro fetal y del adulto. Su eficacia neuroprotectora sobre el

cerebro fetal y neonatal se informó en muchos modelos animales (Voiculescu et al.

2014). Por ejemplo, en modelos de hipoxia fetal en ovejas, la melatonina redujo la

inflamación y la muerte celular en el cerebro fetal, administrándola en el momento

en que produce la hipoxia o inclusive 10 minutos después (Welin et al. 2007).

Asimismo, el tratamiento con melatonina antes o durante un episodio de hipoxia

disminuyó el estrés oxidativo y la formación de radicales hidroxilo, redujo la

peroxidación lipídica y la muerte celular en el cerebro fetal y por último, evitó la

pérdida de integridad de la barrera hematoencefálica y la astrogliosis (Yawno et al.

2013). En lo que respecta a la eficacia neonatal, en un pequeño ensayo clínico, la

melatonina administrada por vía oral a bebés que habían sufrido asfixia al nacer

redujo significativamente el estrés oxidativo en sangre. A su vez, 3 de 10 bebés que

no recibieron el tratamiento con melatonina murieron, mientras que no se

registraron muertes en el grupo que recibió el tratamiento con la hormona (Fulia et

al. 2001). También se ha demostrado que su administración reduce las lesiones en

modelos de isquemia cerebral y accidente cerebrovascular en animales adultos

(Macleod et al. 2005).

Como se mencionó anteriormente, el aumento de la supervivencia de los

nacidos prematuros debido a los avances en la atención neonatal, ha dado lugar a un

mayor número de niños en situación de riesgo de contraer displasia broncopulmonar,

también llamada enfermedad pulmonar crónica (EPC). En un ensayo clínico con recién

nacidos prematuros de 32 semanas de gestación con síndrome de dificultad

respiratoria neonatal, se observó que la melatonina redujo los niveles de citoquinas

proinflamatorias (IL-6/IL-8/TNF-α) y los niveles de nitritos/nitratos en suero. Los

neonatos que recibieron placebo y desarrollaron EPC, presentaron niveles de IL-6/IL-

8/TNF- α y valores de nitritos/nitratos mucho más altos que los que no lo

desarrollaron e incluso algunos murieron. Dentro del grupo que recibió melatonina no

Introducción

39

hubo casos EPC, ni muertes, ni ningún efecto adverso del tratamiento (Gitto et al.

2004).

La melatonina como fármaco epigenético

Básicamente los procesos epigenéticos son controlados temporal y

espacialmente e influyen en la expresión de todo el genoma, especialmente el de los

mamíferos. Al menos un 10% de todos los genes expresados en cualquier tejido, están

regulados circadianamente a través de mecanismos epigenéticos (Masri & Sassone-

Corsi 2010). La mayoría de los genes para cambiar el estado de su expresión sufren

modificaciones epigenéticas tales como modificaciones en las histonas, y/o

metilaciones de DNA, y/o remodelamiento de la cromatina (Portela & Esteller 2010;

Korkmaz et al. 2012). Por ello, hoy en día la regulación epigenética es considerada un

proceso de regulación fundamental de la expresión o supresión génica y la melatonina

formaría parte de la misma. Pruebas recientes indican nuevas funciones de la

melatonina en la modulación de genes a través de mecanismos epigenéticos

regulando a las HDAC y la acetilación de H3 (Sharma et al. 2008; Jung-Hynes et al.

2010; Korkmaz et al. 2012; Shi et al. 2012). La regulación de genes por parte de la

melatonina es compleja ya que induce la expresión de genes anti-oxidantes e inhibe

la expresión de genes pro-inflamatorios en una misma célula. Es por eso que la

melatonina podría ser considerada un orquestador antioxidante y anti-inflamatorio

frente al estrés nitro-oxidativo y a la inflamación, mediante su acción epigenética

(Korkmaz et al. 2012). Por lo tanto, se postula a la melatonina como un fármaco

epigenético.

Los bebés prematuros reciben al nacer glucocorticoides para estimular la

maduración pulmonar, sin embargo éstos, mediante modificaciones epigenéticas,

producen hipertensión en la vida adulta. Wu y colaboradores encontraron en un

modelo murino que, tanto la melatonina como un inhibidor de las HDAC, la

tricostatina A, previenen la hipertensión programada por glucocorticoides. Dado los

efectos protectores similares de la melatonina y la tricostatina A, la melatonina

podría estar ejerciendo su efecto mediante la inhibición de las HDAC (Wu et al. 2014).

Introducción

40

La tricostatina, un inhibidor de las HDAC

La tricostatina A (TSA) es un producto natural aislado de Streptomyces

hygroscopicus, que fue desarrollado originalmente como un antifúngico (Tsuji et al.

1976). Su función como inhibidor de las HDAC fue descrita por primera vez en 1990 y

hoy en día es considerado un inhibidor de HDAC de amplio espectro (Yoshidas et al.

1990), figura 12.

Figura 12. Estructura química de la tricostatina A

Esta droga tiene altos niveles de toxicidad basal, posiblemente debido a su

potente inhibición no selectiva y se utiliza a menudo como un compuesto de

referencia para la inhibición de HDAC en investigación. Sin embargo, en cultivos de

neuronas corticales, se ha demostrado que la TSA aumenta la viabilidad y la expresión

de la HSP70, una chaperona neuro-protectora y anti-inflamatoria (Jeong et al. 2003;

Marinova et al. 2009). A su vez, se ha demostrado que en cultivos primarios de

microglía fetal humana tratados con LPS, la TSA reduce la expresión de numerosas

citoquinas pro-inflamatorias (Suh et al. 2010). Asimismo, Xing y colaboradores

demostraron recientemente que el LPS en fibroblastos de pulmón, vía TLR-4, produce

la activación de las HDAC, lo que conlleva a la desacetilación de las H3 y H4. El efecto

final es la disminución en la expresión del antígeno de diferenciación de los timocitos

1, efecto que fue revertido por la incubación con TSA (Xing et al. 2015). También, cabe

resaltar que en un modelo murino de artritis, la TSA promueve la acetilación de Nrf2

aumentando la expresión de enzimas anti-oxidantes que proporcionan protección

contra el estrés nitro-oxidativo y el daño tisular. A su vez, reduce la expresión de

citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α, IL-1β e IL-6 (Cai et al. 2015).

Estudios fármaco-cinéticos sugieren que cuando se administra periféricamente

TSA, se absorbe, se metaboliza rápidamente y cruza la barrera hemato-encefálica

(Sanderson et al. 2004; Chuang et al. 2009). Una serie de estudios muestran un efecto

anti-inflamatorio y neuro-protector por parte de la TSA tanto en modelos in vitro

como in vivo de accidente cerebro-vascular por isquemia (Meisel et al. 2006; Kim et al.

2007; Fleiss et al. 2012; Wang et al. 2012). Hoy en día, algunos resultados ponen en

evidencia el uso potencial de la TSA en la prevención de enfermedades

neurodegenerativas relacionadas con la inflamación, tales como la enfermedad de

Parkinson (Chen et al. 2007; Harrison & Dexter 2013).

Introducción

41

Animales de experimentación

Características generales

Los animales de experimentación tienen cualidades que permiten modelar

enfermedades que afectan al hombre y a especies productivas y domésticas de su

interés. Los animales de laboratorio son reproducidos y mantenidos en un entorno

controlado, poseen claros antecedentes genéticos y se les realiza controles

microbiológicos sistemáticamente.

Alrededor del 90% de los animales utilizados en investigación son roedores,

principalmente ratones y ratas. Este trabajo se llevó a cabo utilizando ratones de la

cepa albina BALB/c perteneciente a la especie Mus musculus. Son variadas las

características que han hecho del género Mus un modelo biológico muy utilizado en

investigación. Primero, su pequeño tamaño que permite su fácil manipulación.

Segundo, poseen requerimientos mínimos de espacio y alimentación como también

de temperatura y humedad para su mantenimiento y reproducción. Tercero, se

reproducen durante todo el año, los períodos de gestación y destete son breves, las

camadas numerosas y son lo suficientemente longevos (viven en promedio

alrededor de 24 meses). Son mamíferos euterianos como el hombre, comparten el

99% de su genoma y su sistema inmune es similar.

Características reproductivas

El ciclo reproductivo del ratón es estral. Lo más característico de este tipo de

ciclo es la manifestación de receptividad sexual por parte de las hembras por

períodos limitados. La ovulación es un proceso espontáneo y predecible ya que el

estro conductual coincide con el pico preovulatorio de hormona luteinizante. Las

hembras son poliéstricas continuas, esto significa que presentan ciclos consecutivos

durante todo el año que sólo son interrumpidos por períodos gestacionales.

El ciclo está dividido en 4 fases: proestro, estro, metaestro y diestro, que

duran entre 4 y 5 días. El estro también suele llamarse fase de “celo” y se define

como el periodo de receptividad sexual, al final del cual se produce la ovulación. El

metaestro o fase luteínica se corresponde con el desarrollo inicial del cuerpo lúteo

que pasa a ser activo durante el diestro. El período de crecimiento folicular, que se

inicia con la regresión del cuerpo lúteo y culmina con la aparición del estro, se

denomina proestro. Cada fase del ciclo puede ser identificada mediante un

extendido vaginal, según el aspecto del epitelio que se descama. Los ciclos son

dependientes de los niveles de hormonas circulantes y por ello son muy sensibles a

los cambios ambientales de temperatura, humedad y luz-oscuridad.

Tanto las hembras como los machos son sexualmente maduros a los 50-60

días de edad. La cópula, que se produce durante el estro, puede comprobarse al día

siguiente por la presencia de un tapón vaginal. El mismo consiste en una sustancia

Introducción

42

viscosa del eyaculado que solidifica en la vagina y dura aproximadamente 12 horas.

Este tapón actúa principalmente como barrera mecánica que ayuda a que el

esperma permanezca dentro.

En la cepa utilizada, BALB/c, la gestación tiene una duración de 19 días y al

final de la cual nacen entre 8 y 10 crías. Una vez que las crías han nacido, la hembra

devora la placenta, ayudando la salida de la cría del saco amniótico y estimulando la

eliminación de líquido de sus vías respiratorias. La hembra realiza la construcción del

nido, cuida que las crías permanezcan en él otorgándoles calor ya que todavía no

tienen bien desarrollada la termorregulación, las alimenta, las limpia, las atiende y

las defiende. Durante el período de lactancia ocurre el desarrollo del pelaje, la

erupción de los dientes, la apertura del conducto auditivo externo y de los ojos.

Entre los días 13 y 14 comienzan a ingerir alimento sólido y agua del bebedero y se

los desteta a los 21 días de edad.

Introducción

43

Tejidos en estudio

El útero

Anatómicamente, el útero murino es un órgano bicórneo que comienza en el

oviducto y recorre la cavidad abdominal dorsal (Neal & Rand 1943). Consiste en dos

largos cuernos, que se unen sólo externamente hacia el final ya que, aunque parecen

estar unidos, se mantienen separados por un septo medio. Cada uno de ellos

desemboca por sus respectivos conductos cervicales en el extremo superior de la

vagina (figura 13).

Figura 13. Sistema urogenital del ratón (Neal & Rand 1943).

Histológicamente, el útero está constituido por tres capas de tejido

diferentes (figura 14). El endometrio (túnica mucosa), el miometrio (túnica

muscular) y el perimetrio o epimetrio (serosa).

Introducción

44

Figura 14. Corte transversal de útero de ratón (Bariani 2012).

La capa más interna o la expuesta a la luz uterina es el endometrio (túnica

mucosa). Está constituida por un epitelio cilíndrico y una lámina propia donde se

encuentran las glándulas tubulares helicoidales. El endometrio sufre variaciones

cíclicas. En fase de reposo o anestro, presenta una morfología más estrecha, con un

epitelio cilíndrico bajo y la lámina propia con glándulas tubulares helicoidales cortas

e inactivas. En cambio en la fase proliferativa o estro, el epitelio es cilíndrico alto, la

lámina propia se encuentra más irrigada con más glándulas tubulares helicoidales

más activas. También se observa invasión leucocitaria.

El miometrio (túnica muscular) está compuesta por músculo liso dispuesto

en una capa circular interna y una longitudinal externa.

El perimetrio o epimetrio (serosa) es la cubierta peritoneal del útero. Está

constituida por un epitelio simple y tejido conectivo.

El cerebro fetal

Tradicionalmente se ha divido al sistema nervioso en dos partes: el sistema

nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP). El sistema nervioso

central está compuesto por el encéfalo (cerebro) y la médula espinal. El tejido

nervioso está compuesto por neuronas y en mucho mayor número por las células

gliales. En el SNC las células gliales comprenden a los astrocitos, los

oligodendrocitos, la microglía y las células ependimarias.

Si observásemos un cerebro en estado fresco su apariencia externa sería de

color gris e internamente de color blanco. La llamada sustancia gris se debe a la

prevalencia de somas neuronales que contienen los citocromos mitocondriales,

mientras que la sustancia blanca está compuesta mayoritariamente por los axones

neuronales recubiertos de mielina (la mielina le otorga el color blanquecino) (figura

15).

Introducción

45

Figura 15. Corte de cerebro humano que permite la visualización de la

materia gris y blanca (A.D.A.M. 2014)

El cerebro está rodeado por tres capas de tejido conectivo que en conjunto

reciben el nombre de meninges:

La duramadre, es la capa más externa compuesta de tejido conectivo denso

modelado con vasos sanguíneos.

El aracnoides es la capa media que emite trabéculas hacia la piamadre, es

avascular y está compuesta por tejido conectivo laxo.

La piamadre es la capa más interna de tejido conectivo laxo en contacto con

el cerebro que presenta gran vascularización.

Por otro lado, la barrera hematoencefálica es una barrera que impide la

afluencia de la mayoría de los compuestos desde la sangre al cerebro. Las células

endoteliales de los capilares a través de uniones estrechas, forman una barrera de

difusión que excluye selectivamente a la mayoría de las sustancias transportadas por

la sangre impidiendo su ingreso al cerebro. Es una barrera selectiva donde además

participan las células gliales que permite sólo el ingreso de ciertas moléculas. La

barrera hematoencefálica se desarrolla y madura durante la vida fetal y al momento

del nacimiento ya está formada. En el caso de los bebes nacidos prematuros ésta no

ha terminado de desarrollarse y por ello tienen mayor riesgo de presentar

hemorragia intraventricular (Ballabh et al. 2004). En el ratón la formación de la

barrera hematoencefálica ocurre entre los días 11 y 17 de gestación (Abbott et al.

2010) y en la rata se ha visto que permanece inmadura hasta los 13-14 días

postnatales (Xu et al. 1993; Xu & Ling 1994).

Hipótesis y objetivos

Hipótesis y objetivos

46

Hipótesis y objetivos

La hipótesis central de este proyecto es que los mecanismos involucrados en la

inducción de parto prematuro son también responsables de una de las consecuencias

centrales de esta disfunción, como son las alteraciones del feto a nivel del sistema

nervioso central. Por lo tanto, los tratamientos que retrasan la inducción del parto

pretérmino podrían resultar en una terapéutica eficaz para evitar las disfunciones del

cerebro fetal. Considerando que hasta el momento no se dispone de recursos terapéuticos

efectivos en este sentido, los resultados de este proyecto podrían tener una potencialidad

clínica de consideración.

En base a estos antecedentes el objetivo general del presente trabajo es:

Estudiar si la melatonina, conocida por actividad antioxidante y anti-

inflamatoria, es capaz de prevenir del parto prematuro y disminuir las secuelas en

el neuro-desarrollo de los recién nacidos. Además, se propone elucidar los

mecanismos de acción involucrados en los mismos.

Los objetivos específicos en un modelo murino de parto prematuro inducido por

LPS son:

1- Determinar si el tratamiento con melatonina puede retrasar o prevenir el parto

prematuro.

2- Investigar los mecanismos implicados en el desencadenamiento del parto

prematuro inducido por LPS y su posible prevención por la melatonina.

3- Analizar las consecuencias de la administración de LPS en el día 15 de preñez en

el cerebro fetal y el posible efecto de la melatonina sobre el mismo.

4- En caso de que la melatonina revierta el parto prematuro inducido por LPS

estudiar si las crías provenientes de hembras tratadas con melatonina y LPS tienen un

crecimiento y un comportamiento normal.

Materiales y métodos

Materiales y métodos

47

Materiales y métodos

Animales

Animales de la cepa BALB/c fueron comprados en el Centro de Medicina

Comparada (Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral, Universidad Nacional del

Litoral–CONICET). En nuestro bioterio, se mantuvieron en condiciones controladas de

temperatura (23-25) ºC y luminosidad (200 lux), bajo un ciclo de 12 horas de luz/12

horas de oscuridad (7:00:19:00 horas), con agua y alimento ad libitum.

Hembras nulíparas de entre 8 y 12 semanas de edad (25-30 gr de peso), se

aparearon con machos adultos fértiles de la misma cepa. La cópula se comprueba por

la presencia de un tapón vaginal que es observado por la mañana del día siguiente, ya

que la cópula suele ocurrir durante la noche. La presencia de tapón es considerado

como el día 0 de gestación. Bajo nuestras condiciones de cuidado, la probabilidad de

dejar de descendencia partir de la presencia de tapón que tiene esta cepa es de un

50%. La gestación normal tiene una duración de 18-19 días, ya que el parto suele

ocurrir durante la noche del día 18 y la madrugada del día 19 de gestación.

Los animales fueron sacrificados en una cámara con saturación de dióxido

carbono, cumpliendo con todos los criterios para minimizar el sufrimiento animal. Los

procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de

Animales del Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFyBo) y por el Comité

Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (CICUAL) de la

Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires.

Tratamientos

Hembras preñadas fueron asignadas a uno de los cuatro tratamientos al azar

(figura 16):

En el día 14 de gestación, fueron anestesiadas con clorhidrato de ketamina

(110 mg/kg) y clorhidrato de xilazina (10 mg/kg). En el pliegue de la nuca, se les

implantó subcutáneamente una pastilla de melatonina de 25 mg con 3%

peso/volumen de aceite vegetal, de 4 mm de diámetro y 3 mm altura, comprimida con

un punch metálico. El control respectivo fue simular la cirugía sin implantación de

pastilla. Cabe aclarar que en estudios preliminares se encontró que el procedimiento

quirúrgico en comparación con los animales intactos, no afecta el tiempo de gestación

ni el número de crías.

Materiales y métodos

48

En el día 15 de gestación, las hembras recibieron dos dosis separadas por 3

horas de vehículo o LPS. La primera de 10 µg (0,26 mg/kg en 100 µl de solución

fisiológica estéril) a las 10.00 horas y la segunda de 20 µg (0.52 mg/kg en 100 µl de

solución fisiológica estéril) a las 13.00 horas. Para la administración intra-peritoneal de

vehículo o LPS, los animales fueron restringidos de forma manual sin anestesia.

Así quedan definidos cuatro tratamientos esquematizados en las figura 16 y

17:

1. Control (C)= simulación de la cirugía + vehículo

2. Melatonina (M)= melatonina + vehículo

3. LPS= simulación de la cirugía + LPS

4. Melatonina + LPS (M+LPS)= melatonina + LPS

Tratamientos

Día 14 de gestación

Simulación de la cirugía

Pastilla de melatonina

Día

15

de

gest

ació

n

Vehículo Simulación

de la cirugía +

Vehículo

Pastilla de melatonina

+ vehículo

LPS

Simulación de la cirugía

+ LPS

Pastilla de melatonina

+ LPS

Figura 16. Tratamientos.

Materiales y métodos

49

Figura 17. Esquema de tratamientos. El día cero de gestación (D0) queda

definido por la presencia del tapón vaginal. En el día 14 de gestación (D14), las

hembras preñadas son operadas donde se les coloca un pellet subcutáneo de

melatonina (25 mg) o se les hace la simulación de la cirugía sin colocación de pellet.

Al día siguiente, en el día 15 de gestación (D15), se les administra 2 dosis de LPS (10

µg y 20 µg) o de vehículo. Así quedan definidos cuatro tratamientos: control,

melatonina, LPS y melatonina+LPS. El parto queda definido con la expulsión de la

primera cría, donde el parto a término ocurre durante la noche del día 18 y la

madrugada del 19.

A algunos grupos de animales, se les dejó que completen la gestación para

determinar el porcentaje de parto prematuro, el porcentaje de parto a término y la

cantidad de crías viables por madre. Cabe aclarar que el momento del parto queda

definido con la expulsión de la primera cría y el parto a término ocurre durante la

noche del día 18 y la madrugada del 19. A su vez, se dejaron crecer a las crías

provenientes de las hembras tratadas para evaluar el peso y parámetros de

desarrollo durante el período de lactancia. Además las crías machos adultas fueron

posteriormente evaluadas en test comportamentales.

Otros grupos de hembras fueron sacrificados en el día 15 de gestación, para

extraer el útero y los cerebros fetales. Para ello, se extrajeron los cuernos uterinos, se

los separó de la placenta, las membranas fetales, el feto y la decidua. Se los lavó con

LPS

Materiales y métodos

50

PBS y por último fueron escindidos cada dos unidades feto-placentarias, que

aproximadamente pesan 100 mg. Mientras tanto, las unidades feto-placentarias

fueron puestas en PBS hasta comenzar con la extracción de los cerebros fetales. Para

la misma, los fetos fueron decapitados de a uno y se procedió a la disección de la

calota para exponer el encéfalo sobre una superficie refrigerada. Se extrajeron tanto el

cerebro como el cerebelo y luego se escindieron entre sí, recolectando sólo el cerebro

fetal. Cabe aclarar que se guardaron cada 4 o 6 unidades según la técnica a realizar,

alcanzando 100 mg y 150 mg de tejido respectivamente.

La eutanasia se llevó a cabo a las 2 o 5 horas post la segunda inyección de

vehículo o LPS, a las 15 y 18 hs respectivamente, según el ensayo a realizar. Para la

medición de los niveles de TNF-α y los distintos niveles de ARNm, los animales fueron

sacrificados a las 2 horas. En cambio, para la medición de los niveles proteicos, niveles

de prostaglandinas, actividad NOS, actividad HAT e histología fueron sacrificados a las

5 horas. Para la medición de los niveles de TNF-α, de los niveles proteicos, niveles de

prostaglandinas, actividad NOS y actividad HAT el tejido recolectado se congeló a -

80ºC hasta su uso. En cambio, para la medición de los distintos niveles de ARNm el

tejido recolectado fue puesto en TRIZOL® y se congeló a -80ºC hasta su uso. Por otro

lado, para realizar cortes histológicos el tejido recolectado fue fijado en

paraformaldehído al 4% y dejado a temperatura ambiente durante 18 horas.

Materiales y métodos

51

Evaluación del desarrollo físico en las crías y del comportamiento en los adultos

La evaluación del desarrollo físico en las crías y del comportamiento en los

adultos provenientes de hembras tratadas durante su gestación, se realizó con el

fin de determinar los efectos que estos tratamientos pueden tener sobre la

descendencia en dos etapas distintas.

Desarrollo físico en las crías

Para evaluar si las crías donde la melatonina revirtió el parto prematuro

inducido por LPS crecían de la misma manera que las crías provenientes de hembras

control, el peso y diferentes parámetros de desarrollo fueron registrados durante el

período de lactancia. Los parámetros de desarrollo físico aparecen normalmente en un

margen de edad concreta y por lo tanto la presencia o ausencia de los mismos deben

ser evaluados en determinados días, considerando al día 0 el día de su nacimiento

(Feria et al. 2003).

A hembras que recibieron el tratamiento control, melatonina o melatonina +

LPS y en éste último caso, sólo aquellas en las cuales la melatonina revirtió el parto

prematuro, se las dejó que culminen la gestación (19 días) y el período de lactancia (22

días) para evaluar los posibles efectos de la exposición prenatal de melatonina y del

LPS.

Las crías fueron pesadas los días 1, 8, 15 y 22 de vida. A su vez fueron

evaluadas, la separación del pabellón auricular entre los días 2-4, la erupción de los

dientes entre los días 7-10 y la apertura ocular entre los días 12-16. Para ello, se

utilizaron tres crías machos y tres crías hembras de cada camada elegidas al azar.

Es importante mencionar que tanto en el tratamiento con LPS, que produce

100% de parto prematuro, como en el de melatonina+LPS, en los casos en que la

melatonina no revirtió el parto prematuro, las crías nacen prematuras y no

sobreviven fuera del útero. Por lo tanto, no se contó con las crías correspondientes

para realizar estas determinaciones.

Comportamiento en los adultos

Se realizó el test de campo abierto, el test de laberinto elevado en cruz y el

test de evitación inhibitoria. Los test comportamentales sólo se llevaron a cabo con

las crías machos en el período de adultez, con el fin de evitar el efecto hormonal del

ciclo estral de las hembras y los cambios hormonales que ocurren durante el período

juvenil (Meziane et al. 2007).

Luego del destete fueron retiradas la madre y las crías hembras de las jaulas,

dejando sólo a las crías machos. Por camada, se eligieron 2 machos al azar y a ellos se

Materiales y métodos

52

les realizaron los tres test comportamentales mencionados. El diseño de

pseudorréplica utilizado sirve para controlar mejor la variabilidad que aporta la

hembra tratada y así disminuir la cantidad de réplicas. Cabe aclarar que la unidad

experimental es la hembra tratada en los días 14 y 15 de gestación, o lo que es lo

mismo, la camada proveniente de la misma. Los machos adultos que fueron utilizados

en los test de comportamiento fueron de 90 días de edad (3 meses).

El orden de los test fue diseñado con el criterio de comenzar con el menos

invasivo y finalizar con el más invasivo (Crawley 2007). A su vez, resultados de Paylor y

colaboradores indican que el intervalo entre la mayoría de los test puede ser tan poco

como 1 o 2 días, sin un efecto significativo sobre los mismos (Paylor et al. 2006). En

efecto, a un mismo animal se le realizaron los tres test comportamentales

comenzando por el menos invasivo hasta llegar al más invasivo a lo largo de cuatro

días en el siguiente orden:

Primer día: día 1 del test de campo abierto

Segundo día: día 2 del test de campo abierto

Tercer día: test de laberinto elevado en cruz + día 1 del test de evitación inhibitoria

Cuarto día: día 2 del test de evitación inhibitoria.

Los ratones fueron trasladados a la sala de comportamiento a las 11.00 horas,

donde se bajó la intensidad lumínica y se encendió un ruido blanco de fondo. Se los

dejó durante 2 horas para habituarlos antes de comenzar los test que se llevaron a

cabo entre las 13.00 y las 16.00 horas. El orden de jaulas para la realización de los test

fue establecido al azar. Cada animal fue retirado, evaluado y una vez testeado fue

devuelto a su jaula original. Todos los dispositivos utilizados en los diversos test fueron

limpiados con etanol 70% entre animales.

Test de campo abierto

Este ensayo permite evaluar la actividad exploratoria, los niveles de

comportamiento asociado a la ansiedad y la memoria de habituación (Prut &

Belzung 2003; Depino 2015). El ensayo consiste en exponer al animal a un ambiente

amplio y novedoso. Los roedores normalmente pasan una cantidad de tiempo

significativamente mayor explorando la periferia, por lo general en contacto con las

paredes (tigmotaxis) (File 1980; Prut & Belzung 2003).

Dentro de los parámetros asociados a actividad exploratoria se evalúa la

actividad horizontal, correspondiente a la cantidad de líneas cruzadas por el animal

durante su desplazamiento y la actividad vertical, cuantificando el número de

eventos en los cuales el animal se eleva en sus dos patas traseras (rearing).

Materiales y métodos

53

En cuanto a los parámetros vinculados a niveles de comportamiento

asociado a la ansiedad, éstos se basan en la distinción entre el tiempo de

permanencia en el centro y en la periferia. Se han sugerido al menos dos factores

que influyen en el comportamiento relacionado con la ansiedad. El primero es el

aislamiento social que resulta de la separación física de sus compañeros de jaula

cuando se realiza la prueba. La segunda es el estrés resultante por estar en un

ambiente nuevo iluminado. Se evalúa el tiempo que tarda en pasar por primera vez

al cuadrante central (latencia al centro) y el número de entradas al mismo (Bailey &

Crawley 2009). Mayor tiempo explorando la periferia es un indicador de niveles

mayores de comportamiento asociado a la ansiedad.

Por último, con el objetivo de estudiar la memoria de habituación se vuelve

a exponer al animal al mismo ambiente 24 horas después. Se espera que disminuya

la actividad exploratoria, tanto sea la actividad horizontal como la vertical y que

aumente la actividad de aseo (grooming).

Para llevar a cabo este test, se utilizó un dispositivo de policloruro de vinilo de

42x35x15 cm dividido uniformemente en 30 cuadrados de 7 cm de lado, resultando en

una grilla de 6x5 cuadrados, similar al que se puede observar el la figura 18 (Frisch et

al. 2005). El centro fue considerado de 2X1 cuadrados. Se colocó al animal en el

mismo y se registró con una cámara de filmación 5 minutos de ensayo. Se repitió el

procedimiento a las 24 horas. Se evaluaron las líneas cruzadas, el número de eventos

en los cuales el animal se eleva en sus dos patas traseras ya sea apoyando o no sus

patas delanteras en la pared, la latencia al centro, el número de entradas al mismo y la

actividad de aseo.

Figura 18. Dispositivo utilizado en el test de campo abierto a modo de esquema, la grilla no corresponde a la utilizada (Maur 2015).

Materiales y métodos

54

Test de laberinto elevado en cruz

Este ensayo permite evaluar niveles de comportamiento asociado a la

ansiedad (Hogg 1996; Rodgers & Dalvi 1997; Hava et al. 2006). El test se basa en la

tendencia natural de los ratones para explorar nuevos ambientes y a su vez en la

aversión innata por los lugares abiertos y luminosos, probablemente como una

respuesta adaptativa a reducir el riesgo de depredación. Junto con el test de campo

abierto, se explota este conflicto: el de explorar y evitar una potencial amenaza. El

ratón puede pasar tiempo tanto en los brazos abiertos más iluminados (sin

protección) como en los brazos cerrados menos iluminados (más protegidos), ambos

elevados del suelo. Los ratones tienden a evitar los brazos abiertos, prefiriendo los

espacios más cerrados oscuros. Mayor tiempo explorando los brazos cerrados es un

indicador de niveles mayores de comportamiento asociado a la ansiedad (Bailey &

Crawley 2009).

Para realizar este test se utilizó un laberinto de madera de color negro de

cuatro brazos perpendiculares ubicado a 50 cm de altura. Dos de los brazos están

abiertos, sin paredes que los limiten. Los otros dos brazos constan de paredes que se

elevan hasta 30 cm. Cada brazo tiene una longitud de 50 cm y un ancho de 10 cm

(figura 19), (Pellow et al. 1985). Se colocó al animal en la zona central del laberinto,

mirando hacia un brazo abierto. El ensayo tuvo una duración de 5 minutos y se registró

con una cámara de filmación. El número de entradas y el tiempo, en los brazos

abiertos y cerrados, se registraron y se cuantificaron manualmente.

Figura 19. Dispositivo utilizado en el test de laberinto elevado en cruz (Maur 2015).

Materiales y métodos

55

Test de evitación inhibitoria

Este test se fundamenta en un modelo de condicionamiento clásico y es

empleado con el fin de evaluar memoria asociativa (Mohammadipour et al. 2014). El

dispositivo que se utiliza consta de dos compartimentos, uno iluminado y otro

oscuro (figura 20). El ratón colocado en el compartimiento iluminado tiende a pasar

al oscuro o más protegido. Allí recibe una descarga eléctrica plantar que actúa como

un estímulo aversivo. Una segunda exposición del animal al mismo entorno o

contexto, provocará un recuerdo o evocación de dicho estímulo aversivo y el hecho

de permanecer en el compartimento iluminado le permitiría evitarlo. Por lo tanto,

un aumento del tiempo de permanencia en el compartimento iluminado o la

evitación a ingresar al compartimento asociado al evento aversivo, indica un mayor

grado de memoria asociativa (Crawley 2007).

El dispositivo utilizado consiste en una caja acrílica de 60x60x37 cm, dividida

dos compartimentos de iguales dimensiones (figura 20). El compartimento iluminado

consta de una superficie lisa de policloruro de vinilo de color blanco y se encuentra

iluminado por una lámpara colocada a 85 cm de altura. El compartimento oscuro

presenta una superficie de barras de acero inoxidable paralelas de 3 mm de espesor,

separadas cada 1 cm que conducen la corriente eléctrica. En el compartimento oscuro

sólo penetra la luz proveniente del espacio iluminado (Palumbo et al. 2007). La

división entre los compartimentos es fija desde el extremo superior hasta 9 cm de la

superficie y movible en el extremo inferior restante. El test consta de tres etapas:

- Pre-entrenamiento: se coloca al animal 30 segundos en el compartimiento

iluminado y a continuación 30 segundos en el compartimiento oscuro. En ambos

casos sin acceso al otro sector.

- Entrenamiento: 30 minutos más tarde, se coloca al animal en el

compartimiento iluminado. Cuando el ratón pasa al compartimento oscuro, se cierra

el acceso entre ambos, se le aplica una descarga eléctrica plantar de durante 3

segundos y se lo deja 10 segundos más en ese compartimento. Lo que se registra es

el tiempo que el animal tarda en pasar del compartimento iluminado al oscuro (t1).

- Testeo: a las 24 horas, se vuelve a colocar al animal en el compartimiento

iluminado y se registra el tiempo que tarda en pasar al compartimiento oscuro (t2)

con un máximo de 300 s.

Materiales y métodos

56

Figura 20. Dispositivo utilizado en el test de evitación inhibitoria (Maur 2015).

Descarga eléctrica plantar

0,5 mA

Materiales y métodos

57

Ensayos con tricostatina

Para evaluar si las modificaciones epigenéticas involucradas en el daño en el

cerebro fetal estaban también estaban involucradas en el desencadenamiento del

parto prematuro, se utilizó como herramienta farmacológica a un inhibidor de las

histonas deacetilasas (HDAC): la tricostatina (TSA).

En el día 15 de gestación, las hembras recibieron dos dosis de vehículo o de

tricostatina y otras dos dosis de vehículo o de LPS. En todos los casos la vía de

administración fue la intra-peritoneal (Figura 21).

- La primer dosis de tricostatina se administró a las 8.00 horas y la segunda a las 10.00

horas junto con la primera inyección de LPS. La concentración administrada en ambas

ocasiones fue de 350 uM (97,45 µg/kg en 35 µl de etanol + 65 µl de solución fisiológica

estéril). El control respectivo fue inyectar el vehículo correspondiente (35 µl de etanol

+ 65 µl de solución fisiológica estéril).

- El LPS se administró de la misma manera que antes.

Así quedan definidos cuatro tratamientos:

1. Control (C)= vehículo de la TSA (35% de etanol en SF) + SF

2. Tricostatina (TSA)= tricostatina + SF

3. LPS= vehículo de la TSA (35% de etanol en SF)+ LPS

4. Tricostatina + LPS (TSA+LPS)= tricostatina + LPS

Tratamientos

Día 15 de gestación 8.00 y 10.00 hs

Vehículo (35% ETOH)

Tricostatina

Día

15

de

gest

ació

n

10

.00

y 1

3.0

0 h

s

Vehículo

(SF)

35% ETOH + SF

Tricostatina + SF

LPS

35% ETOH +

LPS

Tricostatina +

LPS

Figura 21. Grupos experimentales para los ensayos con TSA

para

parapara

Materiales y métodos

58

Técnicas

ELISA de TNF-α

Para medir los niveles de TNF-α uterinos, las hembras preñadas de día 15

fueron sacrificadas 2 horas después de la segunda inyección de vehículo o LPS de los

cuatro grupos experimentales. Por cada hembra se recolectó un fragmento uterino de

100 mg que se lo congeló a -80ºC hasta su uso.

El día del ensayo, se homogeneizó el tejido en un potter de vidrio conteniendo

120 µl de buffer PBS (10% suero fetal bovino) y 20 µl de cóctel de inhibidores de

proteasas. Las muestras fueron purificadas por centrifugación durante 20 minutos a

13.000 rpm a 4°C. Los niveles de TNF-α fueron determinados a partir de los

sobrenadantes mediante un Kit de ELISA para TNF-α de ratón (Mono/Mono) de BD

Biosciences, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de la

citoquina fue determinada por la medición de la absorbancia a 490 nm y la

extrapolación sobre una curva estándar. Los valores fueron relativizados a la

concentración de proteínas y fueron expresados en pg/mg proteína.

RT-PCR

Para medir los niveles de ARNm (IL-1 β, NOSn y NOSi) en los cerebros fetales,

las hembras preñadas de día 15 fueron sacrificadas a las 2 horas luego de la segunda

inyección de vehículo o LPS de los cuatro grupos experimentales. Por cada hembra se

recolectaron 4 cerebros fetales en 1 ml de Quick-ZOL y se los congeló a -80ºC hasta el

día del ensayo.

La extracción del ARN total fue realizada según las instrucciones del fabricante.

Su cuantificación se realizó midiendo la absorbancia a 260 nm y su pureza por medio

de la relación entre la absorbancia a 260 nm y a 280 nm.

El ARN (8 μg) fue tratado con DNAasa y para obtener el ADN complementario

(ADNc) se realizó una transcripción inversa utilizando la enzima M-MLV (Moloney

Murine Leukemia Virus reverse transcriptase) y cebadores aleatorios (random primers),

en presencia de inhibidor de ribonucleasas.

Para la reacción en cadena de la polimerasa se utilizaron cebadores (primers)

específicos diseñados con el programa Primer-Blast

(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) sobre la base genética de Mus musculus

(Tabla 1).

Materiales y métodos

59

Gen Sentido Secuencia Producto

IL-1 β Sentido 5'-GCAACTGTTCCTGAACTC-3′ 382 pb

Anti-sentido 5′-CTCGGAGCCTGTAGTGCA-3′

NOSn Sentido 5´-AGCACCTACCAGCTCAAGGA–3´ 209pb

Anti-sentido 5´-ATAGTGATGGCCGACCTGAG–3´

NOSi Sentido 5´-CACCTTGGAGTTCACCCAGT–3´ 170 pb

Anti-sentido 5´-ACCACTCGTACTTGGGATGC–3´

Actina Sentido 5´-TGTTACCAACTG GGACGACA–3´ 392 pb

Anti-sentido 5´-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG–3´

Tabla 1. Secuencias y tamaño del producto final de los cebadores utilizados.

La reacción fue llevada a cabo utilizando los ADNc previamente obtenidos por

transcripción reversa (4 µg), desoxiribonucleótidos trifosfatos (dNTP), Taq DNA

polimerasa (2,5 U), MgCl2 (1,5 mM) y los cebadores correspondientes (0,5 μM).

Las condiciones adecuadas de hibridación y extensión fueron puestas a punto

para cada reacción. En cada experimento se realizaron controles negativos sin ADNc.

Los programas utilizados fueron los siguientes:

IL-1 β: 94°C 3 min. + (94°C 30 seg. + 55°C 1 min. + 72°C 1 min.) x 35 + 72°C 5 min.

NOSn: 94°C 3 min. + (94°C 30 seg. + 60°C 1 min. + 72°C 1 min.) x 35 + 72°C 5 min.

NOSn: 94°C 3 min. + (94°C 30 seg. + 60°C 1 min. + 72°C 1 min.) x 35 + 72°C 5 min.

Actina: 94°C 3 min. + (94°C 40 seg. + 57°C 30 seg. + 72°C 1 min.) x 30 + 72°C 5 min.

Los productos obtenidos luego de la amplificación, fueron sembrados en geles

de agarosa al 2% en buffer TAE conteniendo bromuro de etidio (1 mg/ml) y separados

mediante una corrida electroforética a 110 V en buffer TAE en paralelo con un

marcador de pares de bases. Una vez finalizada la corrida electroforética las bandas

fueron visualizadas bajo luz UV mediante el uso de un transiluminador. Los geles

fueron fotografiados con una cámara digital y la intensidad de las bandas se cuantificó

utilizando el programa Image J (software de libre acceso, NIH). Las bandas

correspondientes a cada ARNm se normalizaron contra la banda correspondiente a la

actina de la misma muestra. Los pesos moleculares de las bandas fueron determinados

de acuerdo a los pesos moleculares de los marcadores de peso molecular utilizados.

Materiales y métodos

60

Western blot

Para medir los niveles proteicos de COX-2 y NOSi uterinos, y la acetilación total

de la histona 3 (AcH3total) en el cerebro fetal, las hembras preñadas de día 15 fueron

sacrificadas a las 5 horas luego de la segunda inyección de vehículo o LPS de los cuatro

grupos experimentales. Por cada hembra se recolectó un fragmento uterino de

aproximadamente 100 mg y 6 cerebros fetales que fueron congelados a -80ºC hasta el

día del ensayo.

Cabe aclarar que para la medición de los niveles de proteínas uterinas, se

utilizaron las proteínas totales. En cambio, para la determinación en los cerebros

fetales de AcH3, una proteína nuclear, se separaron las fracciones citoplasmática y

nuclear y sólo se usó esta última.

Los fragmentos uterinos, fueron homogeneizados en un homogenizador Ultra-

Turrax con 500 µl de buffer de homogenización, se sonicaron y centrifugaron a 5000

rpm por 10 minutos a 4 ºC. Al separar los sobrenadantes, se tomó una alícuota para

cuantificar las proteínas por el método de Bradford (Bradford 1976). Luego se

prepararon las muestras para su posterior separación electroforética. Se colocaron 100

µg de proteínas en buffer muestra con 5% de β-mercaptoetanol para un volumen final

de 10 µl y se lo hirvió durante 5 minutos.

A los cerebros fetales se les agregó 200 µl de un buffer de homogeneización

distinto que favorece la extracción de la cromatina. Las muestras fueron

homogeneizadas en un potter de vidrio e incubadas 20 minutos en hielo. Luego fueron

centrifugadas durante 10 minutos a 13.000 rpm a 4°C y se descartó el sobrenadante.

Para extraer las proteínas nucleares el pellet fue resuspendido en 200 µl de HCl 0,2N e

incubado otros 20 minutos en hielo, pero esta vez se los fue vortexeando cada 3

minutos. Se sonicaron con el objetivo de incrementar la extracción proteica nuclear y

se las centrifugó nuevamente durante 10 minutos a 13.000 rpm a 4°C. Ahora en este

caso, el sobrenadante contiene las proteínas nucleares. El mismo fue removido y

neutralizado con 150 µl de Tris-base 1 M (pH=8). Se tomó una alícuota para cuantificar

las proteínas por el método de Bradford (Bradford 1976). Para poder llevar a cabo la

separación electroforética, se colocaron 50 µg de proteínas en buffer muestra con un

5% de β-mercaptoetanol en un volumen final de 20 ul para luego ser desnaturalizadas

a 100°C durante 5 minutos.

La separación electroforética se realizó en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

según la técnica descripta por Laemmli (Laemmli 1970). Las muestras y el marcador de

peso molecular fueron sembrados en geles de poliacrilamida, con un gel concentrador

del 4% y un gel separador de distinto porcentaje dependiendo del peso molecular de la

proteína a detectar. En el caso de COX-2 y NOSi se realizó un gel en gradiente de (6-12)

% y para la AcH3total de (6-20) %. La electroforesis se llevó a cabo a temperatura

Materiales y métodos

61

ambiente con buffer de corrida, primero a un voltaje constante de 50 V para que se

concentre la muestra y luego a 100 V para que se separen las proteínas.

Una vez finalizada la corrida las proteínas fueron transferidas a una membrana

de nitrocelulosa de 0,45 μm utilizando el sistema de transferencia húmedo Mini-

Protean III (Bio-Rad) a voltaje constante, ya sea en hielo durante 90 minutos a 100 V o

a 4°C durante 18 horas a 30 V. Para verificar que la transferencia se haya realizado

correctamente se tiñeron las membranas con Rojo Ponceau S, un colorante reversible.

Luego fueron lavadas con solución de lavado (T-PBS) e incubadas en solución de

bloqueo (PBS con 5% de leche en polvo descremada) durante 1 h a temperatura

ambiente. Luego se realizaron 3 lavados de 10 minutos con T-PBS.

Para la detección inmunológica se incubaron las membranas con diluciones

óptimas de los anticuerpos primarios durante 24 horas. Todos los anticuerpos

primarios utilizados fueron policlonales y tanto el anti-COX-2 como el anti-NOSi fueron

utilizados en una dilución 1:200, y el anti-AcH3total en una dilución 1:3000. Se lavaron

las membranas con T-PBS y se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario

(1:5000), a temperatura ambiente. Como control de carga se utilizó a la proteína

actina, con una dilución de su anticuerpo de 1:4000. Todos los anticuerpos utilizados

fueron preparados en PBS. El anticuerpo secundario usado fue un anticuerpo anti-

conejo, conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP). Posteriormente a los lavados,

las membranas se revelaron por quimioluminiscencia utilizando un sistema de

adquisición de imágenes (ImageQuant).

Las bandas obtenidas se identificaron mediante marcador de peso molecular y

se verificó su peso molecular por su valor de relación de frentes (Rf: distancia recorrida

en mm por la proteína a determinar/distancia recorrida en mm por la proteína patrón)

aplicando una regresión logarítmica. Las bandas correspondientes a cada proteína se

normalizaron contra la banda correspondiente a la actina (42 KDa). Los resultados se

expresaron como densidad óptica relativa a la actina.

Radioinmunoensayo de prostaglandinas

Mediante la técnica de radioinmunoensayo, RIA según su abreviatura del inglés

radio-immuno-assay, se determinaron los niveles de PGE2 y PGF2α en el útero (Jaffe &

Behrman 1974).

Hembras preñadas de día 15 fueron sacrificadas 5 horas después de la segunda

inyección de vehículo o LPS de los cuatro grupos experimentales. Por cada hembra se

recolectó un fragmento uterino de aproximadamente 100 mg que se congeló a -80ºC.

El día del ensayo, se pesaron los fragmentos y se incubaron en 2 ml de buffer

KRB durante 90 minutos (con recambio del buffer a los 30 minutos) en un baño a 37ºC

Materiales y métodos

62

en atmósfera de carbógeno. Se descartó el tejido y se acidificó hasta pH=3 con HCl 1 N,

para luego agregar la fase orgánica, 2 ml de acetato de estilo, que extrae las

prostaglandinas. Se recogió la fase orgánica y se repitió el proceso de extracción 2

veces más. El volumen de acetato que contiene las prostaglandinas se evaporó en

estufa de vacío. Las muestras y todos los reactivos fueron reconstituidos en buffer RIA

de prostaglandinas. Se preparó una solución madre del estándar respectivo (8000

pg/ml) a partir de la cual se hicieron diluciones seriadas al medio hasta llegar a 7.5

pg/ml para la curva de calibración. En tubos de propileno se colocaron 0.1 ml de los

estándares o de la muestra con el antisuero correspondiente (anti-PGE2 o anti-PGF2α) y

se incubaron por 30 minutos a 4ºC, posteriormente se agregó la prostaglandina

marcada durante 1 hora y finalmente una suspensión de carbón activado (1%) -

dextran (0.1%), que separa la PG unida de la libre. Las muestras se centrifugaron a

2000 x g durante 15 minutos a 4ºC y el sobrenadante se volcó en viales conteniendo 1

ml de líquido de centelleo para muestras acuosas. La radioactividad se midió en

contador de centelleo beta. Luego de una transformación logarítmica los datos se

expresaron como pg de PGE2 o PGF2α /mg de tejido. El método tiene una reactividad

cruzada menor al 0.1% y una sensibilidad de 5 pg/tubo con una Ka= 1.5 x 1010 l/mol.

Actividad de las NOS medida por radioconversión

La técnica se basa en la radioconversión de [14C]-L-arginina y O2 a [14C]-L-

citrulina y NO. Puesto que la citrulina es producida en cantidades equimolares al NO

(Bredt & Snyder 1989).

Para medir la actividad de la sintasa de óxido nítrico uterina, las hembras

preñadas de día 15 fueron sacrificadas a las 5 horas luego de la segunda inyección de

vehículo o LPS de los cuatro grupos experimentales. Por cada hembra se recolectó un

fragmento uterino de aproximadamente 100 mg que se congeló a -80ºC.

El día del ensayo, los fragmentos fueron pesados y homogeneizados en un

homogenizador Ultra-Turrax con 500 µl de buffer HEPES completo. Posteriormente, los

tejidos fueron incubados con [14C]-L-arginina 10 µM (0.3 µCi) durante 15 minutos, en

un baño a 37ºC con agitación constante y atmósfera de carbógeno. Finalizada la

incubación, cada muestra fue centrifugada a 7800 g durante 10 minutos. El

sobrenadante fue sometido a cromatografía de intercambio iónico, para separar la

[14C]-L-citrulina formada de la [14C]-L-arginina, utilizando columnas DOWEX AG50W-X8

(forma aniónica Na+). La [14C]-L-arginina queda adsorbida, mientras que la [14C]-L-

citrulina es eluída. Se colectó el eluído y se les agregó líquido de centelleo para

muestras acuosas. La radioactividad se midió en contador de centelleo beta. Se

adicionó un tubo de radioactividad inespecífica conteniendo solamente 500µl de

buffer HEPES completo y [14C]-L-arginina. La actividad de la enzima se expresó como

Materiales y métodos

63

fentomoles de citrulina radioactiva producidos por mg de peso de tejido en 15 minutos

(fmol [14C]-citrulina/mg tejido/15 min.).

Actividad de las HAT medida por ensayo colorimétrico

Para medir la actividad de las histonas acetil-transferasa en los cerebros fetales,

hembras preñadas de día 15 fueron sacrificadas a las 5 luego de la segunda inyección

de vehículo o LPS de los cuatro grupos experimentales. Por cada hembra se

recolectaron 6 cerebros fetales y se los congeló a -80ºC hasta el día del ensayo.

El día del ensayo, se procedió a extraer las proteínas nucleares como se hizo

para el western blot de acetilación total de la histona 3 en el cerebro fetal pero con

otro buffer de homogeneización.

La actividad de las HAT fue determinada a partir de 50 µg de proteína

proveniente de los extractos nucleares mediante un Kit de actividad de HAT de Sigma-

Aldrich, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad HAT fue

determinada por la medición de la absorbancia a 440 nm a las 3 horas. Los valores

fueron relativizados a la concentración de proteínas y fueron expresados en nmol/ µg

proteínas nucleares/min.

Histología

Para estudiar el posible daño en los cerebros fetales debido al LPS, como la

posible reversión del mismo por el tratamiento con melatonina, hembras preñadas de

día 15 fueron sacrificadas a las 5 horas luego de la segunda inyección de vehículo o LPS

de los cuatro grupos experimentales. Por cada hembra se recolectaron 2 cerebros

fetales y fueron fijados con paraformaldehído al 4% en buffer fosfato 0,1 M durante 18

horas a temperatura ambiente. Luego, el tejido se deshidrató mediante sucesivos

pasajes en alcoholes, desde 70% hasta 100%. Posteriormente, se incluyeron en

parafina y se realizaron cortes en micrótomo de 5 µm de espesor. Finalmente se

procedió a desparafinar e hidratar, para así proceder con la coloración de

hematoxilina-eosina.

Se observaron los cortes con un microscopio Nikon Eclipse 200 (NY, USA) para

denotar la conservación o daño histológico de la sustancia gris y blanca, como así

también de las estructuras meníngeas. A su vez, se observó la presencia de infiltración

de células del sistema inmune.

Materiales y métodos

64

Análisis estadísticos

La unidad experimental siempre es la hembra preñada y según la variable

respuesta, se utilizaron distintos diseños experimentales y modelos estadísticos.

Dentro de los modelos estadísticos utilizados, se encuentran:

-Diseño completamente aleatorizado: los tratamientos son asignados al azar a las

hembras preñadas y por lo tanto las muestras son independientes entre sí.

-Diseño anidado: como obtener submuestras es menos costoso que incrementar la

cantidad de hembras preñadas, se utilizaron 3 crías machos y 3 crías hembras por

camada para estudiar los parámetros de crecimiento y se utilizaron 2 crías machos por

hembra preñada para los test comportamentales. Cabe resaltar que, el submuestreo

no incrementa el número de réplicas, el número de réplicas sigue siendo el número de

hembras preñadas por tratamiento y no el número de crías testeadas.

-Diseño de medidas repetidas en el tiempo: se utiliza cuando una misma unidad

experimental es sometida a mediciones sucesivas a lo largo del tiempo, permitiendo

así un mejor control del error ya que se estudian patrones individuales de cambio y su

variación entre los diferentes tratamientos.

Los modelos estadísticos utilizados fueron cuatro:

1. ANOVA de 2 factores con interacción: uno de los factores es la melatonina y el

otro el LPS. Los tratamientos quedan determinados por la combinación de los

niveles de los factores utilizados (control, melatonina, LPS, melatonina + LPS),

(figura 16). Con este modelo estadístico van a ser analizadas todas las

variables respuesta medidas en los úteros y los cerebros fetales provenientes

de hembras preñadas de día 15 (figura 22).

2. ANOVA de 1 factor: con este modelo estadístico va a ser analizado el tamaño

de la camada por hembra (las crías que nacen vivas y a término), (figura 22).

Como las hembras que recibieron LPS tienen parto prematuro en el 100% de

los casos, no es posible utilizar el modelo estadístico anterior. El factor

tratamiento en este caso tiene 3 niveles (control, melatonina y

melatonina+LPS).

3. ANOVA de 2 factores anidado: al igual que el modelo anterior (ANOVA de 1

factor) se encuentra el factor tratamiento (control, melatonina y

melatonina+LPS) y se agrega otro factor que es la hembra anidada al

tratamiento, porque por cada hembra va a haber más de una medición. Con

este modelo estadístico van a ser analizados los parámetros de crecimiento

de las crías durante el período de lactancia (se utilizan 3 crías machos y 3 crías

hembras por camada) y las variables respuesta medidas en los test

Materiales y métodos

65

comportamentales a un único tiempo (se utilizan dos crías machos por cada

hembra), figura 22.

4. ANOVA de medidas repetidas anidado de 4 factores: al igual que el modelo

anterior (ANOVA de 2 factores anidado), se encuentran el factor tratamiento

(control, melatonina y melatonina+LPS) y el factor hembra anidada al

tratamiento y además se agrega el factor cría que está anidada a la hembra y el

factor tiempo. Con este modelo estadístico van a ser analizados los pesos de

las crías durante el período de lactancia (se utilizan 3 crías machos y 3 crías

hembras por camada) y las variables respuesta medidas en los test

comportamentales a más de un tiempo (figura 22).

Figura 22. Modelos estadísticos: 1) Anova de 2 factores con interacción: con este modelo estadístico van a ser analizadas todas las variables respuesta medidas a partir de los úteros y los cerebros fetales provenientes de hembras preñadas de día 15; 2) Anova de 1 factor: con este modelo estadístico va a ser analizado el tamaño de la camada por hembra que nacen vivas a término; 3) Anova de 2 factores anidado: con este modelo estadístico van a ser analizados los parámetros de crecimiento de las crías durante el período de lactancia y las variables respuesta medidas en los test comportamentales a un único tiempo; 4) Anova de medidas repetidas anidado de 4 factores: con este modelo estadístico van a ser analizados los pesos de las crías durante el período de lactancia y las variables respuesta medidas en los test comportamentales a más de un tiempo.

Cabe aclarar que el diseño experimental y los modelos estadísticos utilizados

con el tratamiento con tricostatina son los mismos que los usados para la melatonina.

Materiales y métodos

66

En todos los casos se utilizó estadística paramétrica y para que las conclusiones

del análisis de la varianza (ANOVA) sean válidas, al realizar el diseño experimental se

tuvo en cuenta que se cumplan los supuestos de manera que las muestras sean

aleatorias y las observaciones independientes. Además se pusieron a prueba los

supuestos de distribución normal de la variable respuesta en cada tratamiento e igual

variabilidad entre los tratamientos. Los supuestos de normalidad y homogeneidad de

varianza se estudiaron mediante Shapiro-Wilks y la prueba de Levene,

respectivamente. En el caso del diseño de medidas repetidas, además se puso a

prueba el supuesto de esfericidad, mediante la prueba de esfericidad de Mauchly. En

caso de falta de normalidad, heterocedasticidad o esfericidad se corrigieron los datos

mediante transformaciones monotónicas. Las comparaciones se efectuaron utilizando

la prueba de Tukey y se consideraron significativas aquellas pruebas con p<0.05, donde

se las denotó con distintas letras. A su vez, antes de verificar los supuestos del modelo

se recurrieron a herramientas gráficas para visualizar el efecto de los tratamientos, su

variabilidad y los posibles outliers.

Cabe aclarar que todos los estudios fueron experimentales y la cantidad de

réplicas fue calculada a priori para cada variable respuesta y para ello se tuvo en

cuenta: el número de tratamientos, la varianza común dentro de los tratamientos, la

magnitud del efecto que se quiere detectar entre los tratamientos, el nivel de

significación que en todos los casos fue de 0.05 y la potencia que nunca fue menor del

80%.

Los análisis estadísticos y los cálculos del tamaño muestral fueron efectuados

utilizando el programa estadístico Infostat, FCA, Universidad de Córdoba, Argentina.

Materiales y métodos

67

Drogas y reactivos

El lipopolisacárido (LPS) de Escherichia coli 055:B5, la melatonina, la

tricostatina, el kit para la medición de la actividad de las HAT (número de catálogo

EPI001) y los antisueros de PGE2 y PGF2α fueron obtenidos de Sigma-Aldrich Co. El kit

de ELISA para la medición de TNF-α de ratón (número de catálogo 555268) fue

obtenido de BD Biosciences Pharmingen.

El líquido de centelleo para muestras acuosas (Optiphase HiSafe) y el material

radioactivo utilizado ([5,6,8,9,11,12,14,15(n)–3H]-prostaglandina F2α (160 Ci/mmol, 200

μCi/ml), [5,6,8,9,11,12,14,15(n)–3H]–prostaglandina E2 (130 Ci/mmol, 100 μCi/ml), L-

[U-14C]-arginina (360 mCi/mmol, 50 μCi/ml)) fue obtenido de Perkin Elmer.

Los reactivos para western blot fueron suministrados por Sigma y Bio-Rad, sólo

el marcador de peso molecular fue obtenido de GE Healtcare.

El Quick-ZOL fue adquirido de Kalium Technologies y los reactivos utilizados

para la retro-transcripción (RT) del ARNm (H2O ultrapura, DNAasa, Buffer DNAsa,

cebadores random, Buffer Tris 5X, DTT) fueron adquiridas en Invitrogen, mientras que

el Inhibidor de RNAsas y los dNTPs fueron suministrados por Genbiotech. La

transcriptasa reversa M-MLV, el Green GoTaq Reaction Buffer 5X y la DNA polimerasa

GoTaq utilizados en PCR son de Promega y el marcador de peso molecular para PCR

fue proporcionado por Biodynamics.

El suero fetal bovino fue provisto por Internegocios (Internegocios SA,

Mercedes, Bs.As., Argentina).

Los anticuerpos anti-COX 1 y anti-COX 2 fueron adquiridos de Cayman Chemical

Company, el anticuerpo anti-actina fue suministrado por Sigma Chemical Company, el

anticuerpo anti-AcH3total por Abcam y por último el anticuerpo secundario conjugado

a peroxidasa de rábano picante (HRP) fue Sigma-Aldrich Co.

Todos los reactivos utilizados fueron de grado analítico.

Materiales y métodos

68

Soluciones y buffers

- Buffer fosfato (PBS)= NaCl 136,9 mM + KCl 2,68 mM + KH2PO4 1,47 mM +

Na2HPO4•7H2O 8 mM.

- T-PBS (solución de lavado western blot) = PBS + Tween 20 (0,1%).

- Cóctel de inhibidores (ELISA y western blot)= PBS + EDTA 1 mM + aprotinina 2 μg/ml

+ leupeptina 20 μM + DTT 5 mM + STY 2 mM + ácido caproico 1 mM + benzamidina 2

mM.

- Buffer muestra (western blot) = Azul de bromofenol 0,3% (p/v) + Tris 0,5 M (pH=6,8)

+ SDS 1% (p/v) + β-mercaptoetanol 5% (v/v) + glicerol 10% (v/v).

- Buffer de homogenización (fragmentos uterinos, western blot)= Azida sódica 0,02%

(p/v) + SDS 0,1% (p/v) + Deoxicolato 0,5% (p/v) + Nonidet P40 1% (v/v) + cóctel de

inhibidores 1X en PBS.

- Buffer de homogenización (cerebros fetales, western blot)= Hepes 10 mM + KCl 0,4

mM + cóctel de inhibidores 1X + DTT 10 uM + Leupeptina 10 uM + PMSF 0,2% (v/v) +

TSA 5 uM + Butirato de Na 5 mM.

- Buffer de corrida (western blot)= Tris base 123,8 mM (pH=8,3) + glicina 0,96 M + SDS

17,3 mM.

- Buffer de transferencia (western blot)= Tris base 25 mM (pH=8,1-8,4) + glicina 192

mM + metanol 20% (v/v).

- Rojo Ponceau S (western blot)= Rojo Ponceau S (ácido 3-hidroxi-4-[2-sulfo-4-(4-

sulfofenilazo) fenilazo]-2,7-naftalenodisulfónico) 0,5% (p/v) + ácido acético 1% (v/v)

- ECL (solución de revelado de western blot)= solución A (4,4 ul de Ácido Cumárico + 10

ul de Luminol + 100 ul de Tris pH 8,8 + 885,6 ul de H2O bidestilada) + solución B (100 ul

Tris 1,5 M pH 8,8 + 2 ul H2O2 + 900 ul H2O bidestilada).

- Buffer TAE 50X (PCR)= Tris base 24,2 g + ácido acético glacial 5,7 ml + EDTA 1,861 g,

sel levar a 100 ml con H2O bidestilada.

Materiales y métodos

69

– Buffer KRB <Krebs – Ringer – Bicarbonato> (RIA)= NaCl 118 mM + KCl 4,7 mM + KH2PO4 1,18 mM + MgSO4•7H2O 1,22 mM + NaHCO3 25 mM + glucosa 11,1 mM.

- Buffer RIA= K2HPO4•3H2O 7.3 mM + KH2PO4 2.7 mM + NaCl 154 mM + albúmina

bovina 7.1 mM + azida sódica 15.4 mM (pH=7,4). - HEPES completo (actividad NOS)= HEPES 20,14 mM pH=7,4 + CaCl2 0.45 mM + DTT

2.5 mM + NADPH 0.5mM + valina 25mM (inhibidor de las arginasas).

- Buffer de homogenización (cerebros fetales, actividad HAT)= Tris-Base 50 mM pH=8

+ NaCl 150 mM, se lleva a pH=7,4 con HCl. Luego se le agrega Nonidet P40 1% +

Deoxicolato de Na 0,5% + SDS 0,1% e inhibidor de proteasas 1X.

- Buffer fosfato 0,1 M (histología)= NaH2PO4•H2O 0,046 M + Na2HPO4•7H2O 0,154 M.

Resultados

Resultados

70

Resultados

1. Efecto de la melatonina sobre el desencadenamiento del parto prematuro

Porcentaje de parto prematuro, parto a término y tamaño de la camada

Como se mencionó anteriormente las infecciones intrauterinas durante la

gestación son la principal causa de parto prematuro, puesto que éstas inducen un

proceso inflamatorio. En el laboratorio, hemos desarrollado un modelo murino de

parto prematuro inducido por LPS que consiste en la administración de la endotoxina

en el día 15 de gestación que produce 100% de parto prematuro durante la tarde-

noche de ese mismo día. En el desarrollo de esta tesis, este modelo fue utilizado para

evaluar el posible efecto protector de la melatonina sobre el desencadenamiento del

parto prematuro inducido por LPS.

En la tabla 2 se muestra el efecto del tratamiento con melatonina y LPS sobre

el porcentaje de parto a término, parto prematuro y el número de crías viables, es

decir nacidas a término. El parto en los animales control ocurre durante la noche del

día 18 y el tratamiento con LPS produce 100% de parto prematuro durante la noche

del día 15. Asimismo, la melatonina que no altera en sí misma la duración del

embarazo, sí impidió el parto prematuro inducido por LPS en el 50% de los casos. A su

vez, no hubo diferencias en el número de crías viables por camada entre los animales

control, los tratados con melatonina y los tratados con LPS en presencia de melatonina

donde se revirtió el parto prematuro. Cabe aclarar que el momento del parto queda

definido con la expulsión de la primera cría y que las crías nacidas prematuras no

sobreviven fuera del útero, por ello no hay crías viables cuando las hembras se tratan

con LPS.

% Parto prematuro % Parto a término Crías viables/madre

Control 0 100 10 ± 1

Melatonina 0 100 9 ± 2

LPS 100 0 -

Melatonina+LPS 50 50 8 ± 2

Tabla 2. Efecto de la melatonina y el LPS sobre el parto. Porcentajes de parto

prematuro, parto a término y tamaño de la camada. Media ± E.E. (n = 10, P> 0,05).

Resultados

71

Dilatación del cérvix

Dentro de los eventos anatómicos y fisiológicos que ocurren previos al

momento del parto, se encuentra la dilatación del cérvix. Un examen macroscópico,

antes del momento del parto, mostró que las hembras tratadas con LPS presentaban

una mayor apertura del cérvix con presencia de sangre, en comparación con el

cuello uterino cerrado observado en animales controles, tratados con melatonina o

tratados con LPS en presencia de melatonina (figura 23A).

Figura 23. Efecto de la melatonina y el LPS sobre la dilatación del cérvix y la

morfología uterina. Fotografía representativa de la dilatación del cérvix uterino (A) y

del útero (B) a las 5 horas post la segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro

grupos experimentales.

Resultados

72

2. Mecanismos implicados en el desencadenamiento del parto prematuro

inducido por LPS y la reversión por la melatonina

Morfología del útero

El útero gestante murino tiene una morfología que en la literatura se denomina

frecuentemente como “collar de perlas”. Esto se debe a que en promedio suelen tener

alrededor de 10 sacos gestacionales, que contienen al embrión, a las membranas

fetales y a la placenta formando en conjunto una estructura de aspecto redondeado.

Los sacos, ubicados uno al lado de otro a lo largo de los cuernos uterinos, presentan un

aspecto similar al de un collar.

Se realizó un examen macroscópico uterino y se observó que los úteros

provenientes de hembras tratadas con LPS estaban menos irrigados y con los

intersitios menos definidos, encontrándose los sacos gestacionales próximos al cérvix.

En cambio, los provenientes de animales controles, tratados con melatonina o tratados

con LPS en presencia de melatonina mostraron mayor irrigación, intersitios bien

definidos y los sacos gestacionales más distanciados del cérvix (figura 23B).

Respuesta inflamatoria

Como ya mencionamos en la introducción, el LPS es un potente inflamógeno

que produce un aumento en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α y

la inducción de la expresión de NOSi y COX-2, que a su vez producen grandes

cantidades de NO y prostaglandinas respectivamente. En nuestro modelo de parto

prematuro inducido por LPS, ha sido demostrado que el aumento en los niveles de

óxido nítrico y prostaglandinas son fundamentales para el desencadenamiento del

parto prematuro (Cella et al. 2010).

Citoquinas

Con el objetivo de seguir dilucidando los mecanismos implicados en el

desencadenamiento del parto prematuro inducido por LPS y la reversión por la

melatonina, fue medida por un lado la producción de la citoquina proinflamatoria TNF-

α. Para ello, un grupo de hembras preñadas fueron sacrificadas 2 horas después de la

última inyección de vehículo o LPS y se evaluaron los niveles de TNF-α uterinos

mediante ELISA. Los niveles de TNF-α aumentaron significativamente en los animales

tratados con LPS, mientras que la melatonina previno significativamente el efecto de

LPS (figura 24).

Resultados

73

Figura 24. Efecto de la melatonina y el LPS sobre los niveles de TNF-α uterinos. Se

evaluó por ELISA los niveles de TNF-α en fragmentos uterinos 2 horas después de la

segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro grupos experimentales. Media±E.E.

(n=9). Diferentes letras denotan diferencias significativas mediante la prueba de Tukey

(p<0,05), A≠B.

Óxido nítrico

El NO tiene importantes funciones durante la preñez y niveles elevados están

asociados a patologías de la preñez y pérdida del embarazo. En nuestro modelo de

parto prematuro inducido por LPS, ha sido descrito tanto un aumento en la actividad

uterina de la NOS como un aumento en la expresión de NOSi (Cella et al. 2010). Con el

objetivo de dilucidar si estas dos variables estaban involucradas en los mecanismos

implicados en la reversión del parto prematuro por la melatonina, hembras preñadas

fueron sacrificadas 5 horas después de la última inyección de vehículo o LPS. La

melatonina, que no tiene un efecto per se, revirtió totalmente el aumento inducido

por LPS tanto en la actividad de la NOS como en la expresión de NOSi (figura 25 A y B,

respectivamente).En la figura 25 C se muestra un gel representativo de western blot

donde puede observarse la expresión de NOSi (130 KDa) y de actina (42 KDa.)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

C M LPS M + LPS

Niv

ele

s d

e T

NFα

(pg/

mg

pro

teín

a)

AA

A

B

Resultados

74

Figura 25. Efecto de la melatonina y el LPS sobre el sistema del óxido nítrico uterino.

Se midió la actividad de NOS uterina (A), como así también por western blot los niveles

de NOSi (B) en fragmentos uterinos 5 horas después de la segunda inyección de

vehículo o LPS en los cuatro grupos experimentales. Actividad de NOS: Media±E.E.

(n=6). Western blot: Media±E.E. (n=7). Diferentes letras denotan diferencias

significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B.C. Gel representativo de

western blot.

A

B

C

Resultados

75

Prostaglandinas

La PGE2 y la PGF2α son potentes estimuladores de la contractilidad

miometrial durante el parto y están estrechamente asociadas al desarrollo de la

respuesta inflamatoria. En nuestro modelo de parto prematuro inducido por LPS, ha

sido descrito tanto un aumento de ambas prostaglandinas como un aumento en la

expresión de COX-2 en el útero (Cella et al. 2010). Con el objetivo de dilucidar si

estas tres variables estaban involucradas en los mecanismos implicados en la

reversión del parto prematuro por la melatonina, hembras preñadas fueron

sacrificadas 5 horas después de la última inyección de vehículo o LPS. Como se

muestra en la figura 26 A y B, la melatonina previno significativamente el aumento

inducido por LPS de los niveles de la PGE2 y la PGF2α uterinas. Al mismo tiempo, la

melatonina redujo significativamente el efecto del LPS en la expresión uterina de

COX-2 (figura26 C). En la figura 26 D se muestra un gel representativo de western

blot donde puede observarse la expresión de COX-2 (72 KDa) y de actina (42 KDa.)

Resultados

76

Figura 26. Efecto de la melatonina y el LPS sobre los niveles de prostaglandinas

uterinas. Se midió por RIA la producción de PGE2 (A) y PGF2α (B), como así también

por western blot los niveles proteicos de COX-2 (C) en fragmentos uterinos 5 horas

después de la segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro grupos

experimentales. RIA: Media±E.E. (n=8). Western blot: Media±E.E. (n=5). Diferentes

letras denotan diferencias significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B≠C.

D. Gel representativo del western blot.

A

B

C

D

Resultados

77

3. Consecuencias de la administración de LPS en el día 15 de preñez en el

cerebro fetal y el posible efecto de la melatonina sobre el mismo

Evaluación macroscópica del feto

Como los nacidos prematuros presentan múltiples secuelas especialmente a

nivel del SNC, estudiamos a nivel macroscópico el estado de la cría en los cuatro

grupos experimentales, 5 horas post la segunda dosis de LPS o vehículo. Los fetos

provenientes de hembras tratadas con LPS mostraron daño generalizado, siendo el

más relevante la falta de irrigación cerebral. La melatonina previno tanto el daño

generalizado, como la falta de irrigación cerebral inducida por LPS y los fetos

mostraron un aspecto similar a los controles (figura 27).

Figura 27. Efecto a nivel macroscópico de la melatonina y el LPS sobre los fetos de día

15 de gestación. Fotografía representativa de los fetos de día 15 de gestación a las 5

horas post la segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro grupos experimentales.

Histología del cerebro fetal

A continuación se realizaron cortes histológicos y la tinción de hematoxilina-

eosina de los cerebros fetales con el fin de evaluar las consecuencias del LPS y el efecto

protector de la melatonina a este nivel. En los cerebros de crías provenientes de

madres control o tratadas con melatonina, se observó una estructura conservada

tanto en el parénquima cerebral, como así también en las estructuras meníngeas

(figuras 28 y 29). En cambio el tratamiento con el LPS, produce una desorganización

del parénquima cerebral y una gran infiltración linfocitaria tanto en el parénquima

como en las estructuras meníngeas (figuras 28 y 29). El tratamiento con melatonina,

Resultados

78

previno el daño producido por la endotoxina ya que se observó una estructura

conservada y una leve infiltración leucocitaria sólo en las meninges (figuras 28 y 29).

.

Figura 28. Efecto a nivel histológico de la melatonina y el LPS sobre los cerebros

fetales de 15 días de gestación. Fotografías representativas de cortes histológicos con

la tinción de hematoxilina-eosina de cerebros de fetos de día 15 de gestación a las 5

horas post la segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro grupos

experimentales(n=7).

Resultados

79

Figura 29. Efecto a nivel histológico de la melatonina y el LPS sobre los cerebros

fetales de 15 días de gestación. Fotografías representativas a mayor aumento de los

cerebros de los fetos de día 15 de gestación a las 5 horas post la segunda inyección de

vehículo o LPS en los cuatro grupos experimentales. Se puede observar el parénquima,

las meninges (barras negras) y a los leucocitos infiltrados (flechas blancas) (n=7).

Respuesta inflamatoria

Como se mencionó en la introducción, no sólo las citoquinas han sido asociadas

a las infecciones prenatales intrauterinas y a los nacimientos prematuros sino también

a las infecciones neonatales y daño cerebral neonatal. Tanto sea porque la infección

bacteriana llega al feto o por la capacidad de las citoquinas de atravesar la placenta y

la barrera hematoencefálica, se ha demostrado que las citoquinas proinflamatorias

producen estrés nitro-oxidativo y lesiones en la sustancia blanca neonatal. De esta

manera, la activación inmune prenatal puede tener efectos sobre diversas fases de la

neurogénesis de la descendencia trayendo consecuencias a corto y/o largo plazo(Cui et

al. 2009; Meyer et al. 2009).

Resultados

80

Citoquinas

Para establecer los mecanismos inflamatorios asociados a la síntesis y secreción

de citoquinas involucrados en el daño en el cerebro fetal y el efecto protector de la

melatonina, decidimos evaluar los niveles de ARNm de la citoquina IL-1β. Para ello,

hembras preñadas fueron sacrificadas 2 horas después de la última inyección de

vehículo o LPS. Los niveles de ARNm de IL-1β aumentaron significativamente en los

cerebros de fetos provenientes de hembras tratadas con LPS, mientras que la

melatonina previno significativamente este efecto (figura 30).

Figura 30. Efecto de la melatonina y el LPS sobre los niveles de IL-1β en el cerebro

fetal. Se evaluó por RT-PCR los niveles de ARNm de IL-1β en el cerebro fetal 2 horas

después de la segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro grupos

experimentales. Media±E.E. (n=10). Diferentes letras denotan diferencias

significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B.

Óxido nítrico

Para seguir estableciendo los mecanismos inflamatorios involucrados a nivel del

sistema nervioso fetal y el efecto protector de la melatonina, decidimos evaluar los

niveles de ARNm de las isoformas neuronal (NOSn) e inducible (NOSi) de la óxido

nítrico sintasa. Para ello, hembras preñadas fueron sacrificadas 2 horas después de la

última inyección de vehículo o LPS. Los niveles de ARNm de ambas isoformas

aumentaron significativamente en los cerebros de fetos provenientes de hembras

tratadas con LPS, mientras que la melatonina previno significativamente este efecto

(figura 31).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

C M LPS M + LPS

Niv

ele

s d

e A

RN

m IL

-1β

/act

ina

(u

.a.)

A

AA

B

Resultados

81

Figura 31. Efecto de la melatonina y el LPS sobre el sistema del óxido nítrico en el

cerebro fetal. Se evaluó por RT-PCR los niveles de ARNm de NOSn (A) y NOSi (B) en

el cerebro fetal 2horas después de la segunda inyección de vehículo o LPS en los

cuatro grupos experimentales. Media±E.E. (n=10). Diferentes letras denotan

diferencias significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B.

A

B

Resultados

82

Modificaciones epigenéticas

En lo que respecta a la inflamación prenatal, se sabe que puede provocar

modificaciones epigenéticas en múltiples tejidos, incluyendo el cerebro, que

pueden traer aparejadas consecuencias a corto y a largo plazo. Dentro de las

modificaciones epigenéticas se encuentra la acetilación/desacetilación de histonas

que regulan el grado de compactación de la cromatina y en consecuencia la

accesibilidad de la maquinaria transcripcional al ADN.

A fin de evaluar posibles cambios inducidos por el tratamiento con LPS en el

patrón de acetilación de histonas y el efecto de la melatonina sobre el mismo en el

cerebro fetal, se evaluó la acetilación de la histona 3 (AcH3) total mediante western

blot. Se sacrificaron hembras preñadas 5 horas después de la última inyección de

vehículo o LPS. La acetilación total de la histona 3 aumentó significativamente en los

cerebros de fetos provenientes de hembras tratadas con LPS, mientras que la

melatonina previno significativamente este efecto (figura 32 A). En la figura 32 B se

muestra un gel representativo de western blot donde puede observarse la

expresión de la histona 3 acetilada (17 KDa) y de actina (42 KDa).

Al mismo tiempo se evaluó la actividad de las histonas acetil-transferasas

(HAT) mediante un ensayo colorimétrico donde la actividad de las HAT aumentó

significativamente en los cerebros de fetos provenientes de hembras tratadas con

LPS, mientras que la melatonina previno significativamente este efecto (figura 32 C).

Resultados

83

Figura 32. Efecto de la melatonina y el LPS sobre la acetilación de histonas y la

actividad de las histonas acetil-transferasas en el cerebro fetal. Se evaluó por

western blot la acetilación de la histona 3 total (A) y por un ensayo colorimétrico la

actividad de HAT (C) en cerebro fetal, 5horas después de la segunda inyección de

vehículo o LPS en los cuatro grupos experimentales. Western blot: Media±E.E.

(n=12). Ensayo colorimétrico: Media±E.E. (n=8). Diferentes letras denotan

diferencias significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B. B. Gel

representativo de western blot.

A

B

C

Resultados

84

Mecanismos implicados en el desencadenamiento del parto prematuro y el daño en

el cerebro fetal

En resumen, el LPS en el cerebro fetal aumenta la acetilación de la histona 3 y

este aumento podría estar mediado, al menos en parte, por un aumento en la

actividad de las HAT. Por lo tanto, puede decirse que modificaciones epigenéticas

estarían involucradas en el mecanismo de daño en el cerebro fetal.

A continuación, quisimos estudiar si las vías involucradas en el daño en el

cerebro fetal lo estaban también en el desencadenamiento del parto prematuro. Para

ello, utilizamos como herramienta farmacológica a un inhibidor de las histonas

deacetilasas (HDAC): la tricostatina A (TSA). Se evaluó su efecto tanto en el

desencadenamiento del parto prematuro como en la expresión de los niveles de ARNm

de la citoquina IL-1β en el cerebro fetal, que previamente habíamos visto que sus

niveles se encontraban elevados debido al tratamiento con LPS.

En la tabla 3 se muestra el efecto de la tricostatina A y el LPS sobre el

porcentaje de parto a término, parto prematuro y el número de crías viables, es decir

nacidas a término. El parto en animales control ocurre durante la noche del día 18 y el

tratamiento con LPS produce 100% de parto prematuro durante la noche del 15.

Asimismo, la TSA que no altera la duración de la preñez por sí misma, impidió el parto

prematuro inducido por LPS en el 75% de los casos. No hubo diferencias en el número

de crías viables por camada entre los animales control y los tratados con LPS en

presencia de TSA donde se revirtió el parto prematuro. En este último caso, las madres

atendieron a sus crías de manera normal y estas crías tuvieron el mismo aspecto y se

alimentaron de la misma manera que las crías provenientes de madres control.

% Parto prematuro % Parto a término Crías viables/madre

Control 0 100 9 ± 2

TSA 0 100 8 ± 2

LPS 100 0 -

TSA+LPS 25 75 7 ± 2

Tabla 3. Efecto de la tricostatina A y el LPS sobre el parto. Porcentajes de parto

prematuro, parto a término y tamaño de la camada. Media ± EE (n = 8).

Luego, se evaluaron los niveles de ARNm de la citoquina IL-1β en el cerebro

proveniente de fetos de hembras preñadas que fueron sacrificadas 2 horas después de

la última inyección de vehículo o LPS. Los niveles de ARNm de IL-1β aumentaron

significativamente en los cerebros de fetos provenientes se hembras tratadas con LPS,

mientras que el tratamiento con TSA previno significativamente el efecto de LPS

(figura 33).

Resultados

85

Figura 33. Efecto de la tricostatina A y el LPS sobre los niveles de IL-1β en el

cerebro fetal. Se evaluó por RT-PCR los niveles de ARNm de la IL-1β en cerebro fetal

2 horas después de la segunda inyección de vehículo o LPS en los cuatro grupos

experimentales. Media±E.E. (n=10). Diferentes letras denotan diferencias

significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

C TSA LPS TSA + LPS

Niv

ele

s d

e A

RN

m I

L-1β

/act

ina

(u

.a.)

A

A

A

B

Resultados

86

4. Crecimiento y comportamiento de las crías provenientes de hembras

tratadas con melatonina y LPS donde se revirtió el parto prematuro

Se ha descripto el efecto de diferentes infecciones uterinas y sus influencias

sobre el neurodesarrollo fetal y sus consecuencias a corto y largo plazo, debido a que

la infección bacteriana inicia una cascada inflamatoria que trae como consecuencia un

aumento en los niveles de citoquinas y de estrés nitro-oxidativo en el cerebro fetal (B

H Yoon et al. 2000; Vargas et al. 2005; Patterson 2009). Dicho en otras palabras, la

desregulación del sistema inmune en el cerebro fetal durante el desarrollo parece ser

el enlace entre la inflamación intrauterina y los trastornos conductuales asociados. A

su vez, estímulos recibidos durante el desarrollo como la inflamación prenatal, pueden

provocar modificaciones epigenéticas en múltiples tejidos, incluyendo el cerebro, que

también pueden traer aparejadas consecuencias a corto y a largo plazo (Borrelli et al.

2008; Hirabayashi & Gotoh 2010; Riccio 2010; Monk et al. 2012; Benoit et al. 2015).

Debido a ésto, quisimos estudiar si las crías provenientes de hembras donde la

melatonina revirtió el parto prematuro inducido por LPS (tabla 2), crecían y se

comportaban de la misma manera que las crías provenientes de hembras control. Es

decir, quisimos determinar si el tratamiento con melatonina y con LPS durante la

gestación producen consecuencias sobre la descendencia. Para ello, se evaluaron

crías provenientes de hembras tratadas en los días 14 y 15 de gestación en dos etapas

distintas. Por un lado, se evaluó su desarrollo físico durante el período de lactancia y

por otro lado, su comportamiento en la adultez. Es importante mencionar que tanto

en el tratamiento con LPS, que produce 100% de parto prematuro, como en el de LPS

en presencia de melatonina en los cuales no se revirtió el parto prematuro, las crías

nacen prematuras y no sobreviven fuera del útero. Por lo tanto, no se cuentan con las

crías correspondientes para evaluar su desarrollo físico, ni para realizar los ensayos

comportamentales.

Efecto del tratamiento con melatonina y LPS en el período de lactancia

Se pesaron y se analizaron diferentes parámetros de desarrollo durante el

período de lactancia. Para ello, se utilizaron tres crías machos y tres crías hembras

de cada camada.

Peso

En primer lugar, no hubo diferencias significativas en los pesos al nacer de las

crías provenientes de madres tratadas con melatonina y LPS con respecto a las crías

provenientes de madres que recibieron el tratamiento control o de melatonina. En

Resultados

87

segundo lugar, la tasa de crecimiento durante el período de lactancia no difirió entre

los 3 grupos experimentales (figura 34).

Figura 34. Efecto del tratamiento con melatonina y LPS sobre el peso de las crías

durante el período de lactancia. A las crías se las peso el día 1, 8, 15 y 22 de vida.

Media±E.E. (n=7). Sólo se observaron diferencias significativas a lo largo del tiempo,

pero no entre los tratamientos. Diferentes letras denotan diferencias significativas

mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B≠C≠D.

Parámetros de desarrollo

A su vez, se evaluaron en las crías distintos parámetros de crecimiento como la

separación del pabellón auricular entre los días 2-4, la erupción de los dientes entre los

días 7-10 y la apertura ocular entre los días 12-16. En la figura 35 se muestran crías de

8 días de vida, donde se puede observar que las provenientes de hembras tratadas con

melatonina y LPS no parecen tener diferencias físicas evidentes con respecto a las

provenientes de hembras control o tratadas con melatonina. A su vez no difirieron en

el momento en que se produjo la separación del pabellón auricular (día 4), la erupción

de los dientes (día 10) y la apertura ocular (día 14) (tabla 4).

Figura 35. Fotografía representativa de crías de 8 días de vida de los 3 grupos

experimentales.

0

2

4

6

8

10

12

14

1 8 15 22

Pes

o (

g)

Días de vida

C

M

M + LPS

A

D

C

B

Resultados

88

Separación del pabellón auricular

Erupción de los dientes

Apertura ocular

Control 4±0 10±0 14±0

Melatonina 4±0 10±0 14±0

Melatonina+LPS 4±0 10±0 14±0

Tabla 4. Efecto de la melatonina y el LPS sobre la aparición de distintos parámetros

de crecimiento durante el período de lactancia. Las crías fueron observadas durante

distintos días para determinar el momento de la separación del pabellón auricular, de

la erupción de los dientes y de la apertura ocular. Media±EE (n=10, P> 0,05).

Efecto del tratamiento con melatonina y LPS en el período de adultez

Comportamiento

Para evaluar si las crías provenientes de madres en las cuales el tratamiento

con melatonina revirtió el parto prematuro inducido por LPS tenían un

comportamiento similar al de las crías provenientes de hembras control, las crías

macho fueron evaluadas en tres test de comportamiento durante el período de

adultez. Se utilizaron dos adultos macho de 90 días de vida por madre.

Test de campo abierto

Mediante el test de campo abierto se evalúo la actividad exploratoria, los

niveles de comportamiento asociado a la ansiedad y la memoria de habituación.

Dentro de los parámetros asociados a la actividad exploratoria se evalúa la

actividad horizontal, correspondiente a las líneas cruzadas por el animal durante su

desplazamiento (figura 36 A) y la actividad vertical. En esta última se cuantifica el

número de eventos en los cuales el animal se eleva en sus dos patas traseras ya sea

apoyando o no sus patas delanteras en la pared (rearing) en el primer día del test

(figura 36 B).Los machos provenientes de hembras tratadas con melatonina y LPS

mostraron el mismo grado de actividad horizontal y vertical que las crías provenientes

de hembras control o tratadas con melatonina.

En cuanto a los parámetros vinculados a niveles de comportamiento asociado a

la ansiedad, éstos se basan en la distinción entre el centro y la periferia. Se evaluaron

el número de entradas al centro y la latencia en el primer día del test (figura 36 C y D,

respectivamente). Se observó que los machos provenientes de hembras tratadas con

Resultados

89

melatonina y LPS mostraron los mismos niveles asociados a la ansiedad que las crías

provenientes de hembras control o tratadas con melatonina.

Por último, con el objetivo de estudiar la memoria de habituación se repite el

mismo procedimiento a las 24 horas. Los machos provenientes de hembras tratadas

con melatonina y LPS mostraron el mismo grado de disminución de la actividad

exploratoria, tanto la horizontal como la vertical, que las crías provenientes de

hembras control o tratadas con melatonina (figura 36 A, B respectivamente). A su vez,

se observó el mismo grado de aumento de la actividad de aseo (grooming) en los 3

grupos experimentales (figura 36 E).

Test de laberinto elevado en cruz

El test de laberinto elevado en cruz se empleó para evaluar también los niveles

de comportamiento asociado a la ansiedad. No hubo diferencias en el número de

entradas a los brazos abiertos, ni a los brazos cerrados, ni tampoco en el tiempo de

permanencia en los mismos (figura 46, 47 y 48). Por lo tanto, puede decirse que los

machos provenientes de hembras tratadas con melatonina y LPS mostraron el mismo

grado de conducta ansiogénica que las crías provenientes de hembras control o

tratadas con melatonina.

Resultados

90

Figura 36. Efecto del tratamiento con melatonina y LPS sobre la actividad

locomotora, los niveles de comportamiento asociado a la ansiedad y la memoria de

habituación de las crías adultas. Cantidad de líneas cruzadas y de elevaciones sobre

las patas traseras (A y B respectivamente), sólo se observaron diferencias significativas

a lo largo del tiempo, pero no entre los tratamientos. Cantidad de entradas al centro y

latencia al mismo (C y D respectivamente), no se observaron diferencias significativas

entre los tratamientos. Actividad de aseo (E), sólo se observaron diferencias

significativas a lo largo del tiempo, pero no entre los tratamientos. Media±E.E. (n=14).

Diferentes letras denotan diferencias significativas mediante la prueba de Tukey

(p<0,05), A≠B.

A

B

C

D

E

Resultados

91

Figura 37. Efecto del tratamiento con melatonina y LPS sobre los niveles de

comportamiento asociado a la ansiedad de las crías adultas. Cantidad entradas a los

brazos abiertos y de entradas a los brazos cerrados (A y B respectivamente). C. Tiempo

en los brazos abiertos. Media±E.E. (n=14). No se observaron diferencias significativas

en ninguna de las variables respuesta entre los tratamientos. Mismas letras no

denotan diferencias significativas. P >0,05.

A

B

C

Resultados

92

Test de evitación inhibitoria

El test de evitación inhibitoria es utilizado para evaluar la memoria

asociativa. En la figura 38 puede observarse que no hubo diferencias significativas

entre los distintos tratamientos con respecto al tiempo transcurrido desde que los

animales fueron colocados en el compartimento claro hasta que pasaron al

compartimento oscuro en ambos días del test. Asimismo, en el segundo día de

testeo el tiempo que tardaron en pasar al compartimento oscuro fue mayor que el

registrado el primer día en todos los grupos experimentales. Por lo tanto, puede

decirse que los machos provenientes de hembras tratadas con melatonina y LPS

mostraron el mismo grado de memoria asociativa que las crías provenientes de

hembras control o tratadas con melatonina.

Figura 38. Efecto del tratamiento con melatonina y LPS sobre la memoria asociativa

de las crías adultas. Tiempo en pasar del compartimento claro al compartimento

oscuro en los dos días del test. Media±E.E. (n=14). Sólo se observaron diferencias

significativas a lo largo del tiempo, pero no entre los tratamientos. Diferentes letras

denotan diferencias significativas mediante la prueba de Tukey (p<0,05), A≠B.

0

50

100

150

200

250

300

0 1 2 3

Tiem

po

(s)

Día

C

M

M + LPS

A

B

A

A

Discusión

Discusión

93

Discusión

Las infecciones intrauterinas durante la gestación son la principal causa de

parto prematuro ya que, en general, el trabajo de parto antes de tiempo es asociado a

un proceso inflamatorio (Goldenberg et al. 2000). En el laboratorio, hemos

desarrollado un modelo murino de parto prematuro inducido por LPS que consiste en

la administración de la endotoxina en el día 15 de gestación, obteniéndose 100% de

parto prematuro durante la tarde-noche de ese mismo día (Cella et al. 2010). Además,

la administración de LPS a hembras BALB/c preñadas remeda varias características

clínicas que se observan en el parto prematuro inducido por infección en los seres

humanos: el sangrado uterino, la dilatación del cérvix y el daño fetal, especialmente a

nivel del sistema nervioso central (Rees & Inder 2005; Romero et al. 2006; Gotsch et al.

2009; Wayne State University 2014). Los presentes resultados indican que la

melatonina previene el parto prematuro inducido por LPS, permitiendo la

supervivencia de las crías y revierte las características clínicas inducidas por LPS.

Los tratamientos para detener el trabajo de parto prematuro, una vez que éste

ha comenzado, no son suficientes para permitir que el embarazo llegue a término y

que culmine el crecimiento y la maduración del feto en el útero. Para ello se utilizan los

tocolíticos, drogas que se usan para prolongar la gestación en mujeres con riesgo de

parto prematuro con trabajo de parto activo que sólo pueden retrasar el inicio del

parto de 2 a 7 días. El agente tocolítico ideal debería ser miometrio específico, fácil de

administrar, barato, eficaz en la prevención del parto prematuro y capaz de mejorar las

consecuencias neonatales, con pocos efectos secundarios maternos, fetales y

neonatales, y sin efectos adversos a largo plazo (Conde-Agudelo & Romero 2013). En la

actualidad, las drogas no esteroideas antiinflamatorias son consideradas los tocolíticos

más efectivos, pero hay precauciones con respecto a sus posibles efectos fetales y

neonatales (Giles & Bisits 2007). La melatonina, en nuestro modelo experimental

previno el parto prematuro en el 50% de las hembras tratadas con LPS, denotando un

efecto “todo o nada”. En el 50% que revierte el parto prematuro, el parto ocurre a

término durante la tarde-noche del día 19 de gestación al igual que en los animales

que no recibieron LPS. En cambio, en el otro 50%, el parto ocurre durante la tarde-

noche del día 15 de gestación al igual que en los animales que recibieron solamente

LPS. Esto podría deberse a que la concentración utilizada de LPS es muy agresiva, lo

que trae aparejada la ventaja de que produce 100% de parto prematuro en una

ventana temporal pequeña. Existe la posibilidad que modificando el método de

administración de la melatonina, por ejemplo mediante una mini bomba osmótica, la

cual permitiría una liberación repetida y continua de la droga, el porcentaje de

reversión del parto prematuro podría aumentar y también podría administrarse post

tratamiento con LPS (Theeuwes & Yum 1976; Nau 1985). Se sabe que las mujeres que

tuvieron partos prematuros previos tienen de 2 a 5 veces mayor riesgo de tener parto

Discusión

94

prematuro en su próximo embarazo (Goldenberg et al. 2008). Por lo tanto, la

melatonina podría ser de gran consideración en estas mujeres de riesgo ya que podría

ser utilizada para prevenir un parto prematuro subsiguiente.

Quedan por establecer los mecanismos involucrados en el efecto protector de

la melatonina. Muchas de las acciones de la melatonina están mediadas a través de la

interacción de los receptores tipo 1 y tipo 2 (MT1 y MT2) de membrana acoplados a

proteína G. Ha sido informada la expresión de estos receptores en el útero de roedores

durante el ciclo estral y la gestación, y en el miometrio humano (Zhao et al. 2002;

Steffens et al. 2003; Schlabritz-Loutsevitch et al. 2003). Por lo tanto, parecería

probable que los efectos de la melatonina sobre el parto prematuro inducido por LPS

puedan ser, al menos en parte, mediados por estos receptores específicos presentes

en el útero de ratón. De hecho, la melatonina previene la dilatación y el sangrado del

cuello uterino inducidos por LPS, suponiendo una acción local de la misma a nivel del

útero. Por otra parte, los úteros provenientes de ratones tratados con LPS tienen los

intersitios menos definidos y los sacos embrionarios se encuentran más cercanos al

cérvix, pudiendo ser esto considerado un paso previo a la expulsión de los fetos,

mientras que la melatonina previene este efecto de LPS también a nivel del útero.

Además de los efectos mediados por los receptores de la melatonina, han sido

reportadas una serie de acciones no mediadas por receptores. En particular, su acción

de secuestrar radicales libres. La melatonina secuestra radicales libres y es un

antioxidante de amplio espectro (Reiter, Paredes, et al. 2009). El daño debido a los

radicales libres es común durante el embarazo y tiene efectos negativos sobre la

madre, la placenta y el feto (Reiter, Tan, et al. 2009). Por lo tanto, las acciones

antioxidantes no mediadas por receptor de la melatonina también podrían ser

responsables de su efecto protector sobre el parto prematuro.

Los embarazos afectados por infección se caracterizan por niveles elevados de

citoquinas proinflamatorias, en particular TNF-α, en el suero materno, membranas

fetales, líquido amniótico y miometrio (Goldenberg et al. 2000). En nuestro modelo, la

melatonina previno el efecto del LPS sobre los niveles de TNF-α en el útero de ratón,

como anteriormente se ha descripto en macrófagos, microglía, células RAW 264.7,

suero materno y cerebro fetal en roedores (Shafer et al. 2001; Xu et al. 2007; Xia et al.

2012). A su vez, se ha observado que la melatonina previene la producción de TNF-α

inducida por hipoxia/reoxigenación en el trofoblasto velloso (Lanoix et al. 2013).

El NO tiene importantes funciones durante la preñez y niveles elevados están

asociados a patologías de la preñez y pérdida del embarazo. En el laboratorio, hemos

demostrado que el aumento de la actividad de las NOS, en nuestro modelo de parto

prematuro por LPS, se debe a un aumento de la expresión de la NOS inducible en el

útero y que este incremento está asociado al inicio del parto prematuro, ya que un

inhibidor específico lo previene (Cella et al. 2010). Nosotros observamos que la

Discusión

95

melatonina previno el aumento de la producción de NO y de los niveles de la proteína

NOSi después de la administración de LPS. Se ha mostrado de forma consistente, en

otros sistemas, que la melatonina y sus metabolitos son inhibidores eficaces de la

actividad de las NOS y potentes secuestradores de NO (Sáenz et al. 2002; Tamura et al.

2009; Nair et al. 2011). Los resultados del presente estudio son por lo tanto coherentes

con la atenuación de la inducción de NOSi por la melatonina, hecho también

demostrado en células endoteliales y placentarias de ratón (Tamura et al. 2009; Wang

et al. 2011).

Aunque las señales que comienzan el trabajo de parto prematuro no han sido

completamente dilucidadas, las prostaglandinas son consideradas un mediador clave

en el inicio y la continuidad del trabajo de parto tanto a término como prematuro. La

concentración de prostaglandinas en el líquido amniótico, en particular la PGE2 y

PGF2α, es significativamente mayor en las mujeres con trabajo de parto prematuro e

infección intraamniótica que en las mujeres con trabajo de parto prematuro sin

infección (Mazor et al. 1990). Además, las prostaglandinas son consideradas

“disparadores” del trabajo de parto ya que el útero responde contrayéndose a las

prostaglandinas exógenas tanto in vivo como in vitro (Mazor et al. 1990). El aumento

de las prostaglandinas vía COX-2, es una señal fundamental tanto en la maduración del

cuello uterino como en la estimulación de las contracciones uterinas (Challis et al.

2000). En el laboratorio, también hemos demostrado que el aumento de PGE2 y PGF2α

en nuestro modelo de parto prematuro por LPS se debe a un aumento de la expresión

de la COX-2 uterina (Cella et al. 2010). Como se muestra en el presente trabajo, la

melatonina redujo significativamente los niveles de la proteína COX-2 inducida por LPS,

así como los niveles de PGE2 y PGF2α. En concordancia, se ha demostrado que la

melatonina disminuye la actividad de COX-2 después de la oclusión de la arteria

cerebral, en células de astrocitoma de rata estimuladas con LPS, y en carcinoma

hepatocelular humano (Nair et al. 2011; Niranjan et al. 2012; Fan et al. 2013).

El NF-κB es uno de los factores de transcripción más importantes en la

regulación transcripcional de las proteínas inflamatorias (Xie et al. 1994; Ghosh et al.

1998). Una vez activado se transloca al núcleo, donde se une a sus sitios de unión en

las regiones promotoras de genes e induce la transcripción de señales

proinflamatorias, tales como TNF-α, NOSi y COX-2, entre otras. Como la melatonina

previno el aumento inducido por LPS sobre la expresión de TNF-α, NOSi y COX-2,

parece probable que la acción inhibidora de la melatonina sobre el efecto del LPS

pueda estar relacionada con la inhibición de NF-κB. Hay trabajos que han demostrado

que la melatonina previene el aumento de los niveles nucleares de NF-κB p50 y NF-κB

p65 inducidos por LPS en la retina de hámster e inhibe la expresión de NOSi mediante

la inhibición de la activación de NF-κB en macrófagos murinos immuno estimulados y

en células endoteliales (Sande et al. 2008; Gilad et al. 1998; Tamura et al. 2009). Como

ya se ha mencionado, varias investigaciones afirman que la producción de citoquinas,

Discusión

96

el aumento de NO y de prostaglandinas juegan un papel importante en el inicio del

parto prematuro. De hecho, hemos demostrado que la administración de etanercept

(anticuerpo monoclonal anti-TNF-α), de aminoguanidina (inhibidor de NOSi) o de

meloxicam (inhibidor de la COX-2) previenen el parto prematuro (Burdet et al. 2010;

Cella et al. 2010). Resultados anteriores sumados a éstos apoyan la noción de que la

disminución de la producción de citoquinas, prostaglandinas y NO o preferiblemente la

combinación de éstos, pueden ser una estrategia terapéutica para prevenir el parto

prematuro (Allport et al. 2001; Cella et al. 2010; Nakajima & Masaoka 2012). Por lo

tanto, la melatonina podría ser un recurso promisorio en la problemática de la

prevención de esta patología, ya que en nuestro modelo evitó el parto prematuro en el

50% de los casos y disminuyó los niveles de TNF-α, de prostaglandinas y de NO en

úteros de ratón provenientes de animales tratados con LPS. En consecuencia, esta

indolamina, que es segura para uso humano, podría ser considerada un nuevo agente

tocolítico.

La problemática del parto prematuro está asociada a las consecuencias clínicas

de haber nacido demasiado pronto. Aunque las tasas de supervivencia de los bebés

prematuros han aumentado en la última década, todavía las tasas de morbilidad son

muy altas. La exposición prenatal a la inflamación parecería ser un factor causal

importante de los resultados adversos, tanto en niños nacidos prematuros como a

término. Recientemente, se ha demostrado que la inflamación intrauterina,

insuficiente para provocar el parto, es suficiente para inducir daño fetal, tanto en el

período de pretérmino como a término y que la respuesta inmune materna no

parecería ser necesaria para que se produzca la respuesta inmune fetal y la lesión

cerebral posterior (Elovitz et al. 2011). Estos resultados podrían indicar que además de

la regulación de la inflamación materna, se necesitan mecanismos adicionales para

proteger a los fetos y así evitar resultados adversos a largo plazo. Asimismo, la

administración de melatonina por vía materna, que atraviesa la placenta y la barrera

hematoencefálica, podría alcanzar a los fetos y protegerlos de la inflamación (Tamura

et al. 2008; Reiter et al. 2013). Entonces, la melatonina además de prevenir el parto

prematuro podría tener la capacidad adicional de proteger a los fetos de los daños

producidos por la inflamación intrauterina. De la misma forma, el estrés oxidativo

contribuye a varias condiciones graves del recién nacido. Saugstad acuñó la frase

"enfermedades de radicales de oxígeno en neonatología" refiriéndose a que el estrés

oxidativo merece, por sus efectos y/o consecuencias, una atención particular, teniendo

en cuenta que afecta a una gran variedad de órganos en forma simultánea (Saugstad

2005). La peculiar susceptibilidad perinatal al estrés oxidativo indica que el uso

profiláctico de antioxidantes como la melatonina podría ayudar a prevenir o al menos

reducir las enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo en los recién nacidos. Sin

ir más lejos, varios estudios han probado la eficacia de la melatonina para

contrarrestar el daño oxidativo en ciertas enfermedades del recién nacido, tales como

enfermedad pulmonar crónica, lesión cerebral perinatal, enterocolitis necrotizante, y

Discusión

97

la retinopatía del prematuro, dando resultados prometedores (Gitto et al. 2013). Sin

embargo, se necesitan más estudios para confirmar estos efectos beneficiosos.

Los recién nacidos prematuros presentan una mayor vulnerabilidad a la lesión

cerebral causada por infección y/o inflamación que resulta en lesiones de la sustancia

blanca (Hagberg et al. 2002), efecto que se ha asociado a citoquinas proinflamatorias y

al estrés nitro-oxidativo (Dammann & Leviton 1997; Døllner et al. 2002; Adams

Waldorf & McAdams 2013; Kitanishi et al. 2014). Actualmente, no hay tratamiento

específico para este tipo de lesiones que puedan prevenir las discapacidades

consecuentes. Técnicas avanzadas de neuroimagenes han llevado a una mayor

comprensión de la naturaleza de las lesiones de la sustancia blanca y gris en los bebés

prematuros, pero es necesaria más investigación para poder desarrollar estrategias

terapéuticas que puedan controlar tales lesiones y preservar la integridad psicomotora

en los niños prematuros (Deng 2010). En un modelo en rata de lesión neonatal de la

sustancia blanca inducida por inflamación intrauterina, se ha demostrado que el LPS

administrado a la hembra preñada mediante la activación de NF-κB produce un

aumento de los niveles de citoquinas proinflamatorias como TNF-α, IL-6 e IL-1β, tanto

en placenta como en los cerebros fetales. Esto produce un aumento de los niveles de

apoptosis y edema cerebral que dan curso a la neuroinflamación fetal y al daño en la

sustancia blanca (Jin et al. 2015).

En nuestro modelo de parto prematuro, al estudiar el efecto del LPS a nivel

macroscópico, los fetos provenientes de hembras tratadas con LPS mostraron daños

generalizados, siendo el más relevante la falta de irrigación cerebral. Ésto se condice

con la problemática de los nacidos prematuros que tienen secuelas especialmente a

nivel del SNC (Jin et al. 2015). A nivel histológico observamos que la endotoxina

produjo una desorganización en la citoarquitectura del cerebro fetal y una gran

infiltración linfocitaria tanto en el parénquima como así también en las estructuras

meníngeas. La infiltración leucocitaria es un acontecimiento clave en los procesos

inflamatorios que en el SNC se produce a través de la barrera hematoencefálica

estimulada por la producción de quimioatractantes de la microglía (McManus et al.

1998). En otra patología reproductiva asociada a una alta tasa de morbimortalidad

perinatal y con deficiencias del desarrollo neurológico a largo plazo como la restricción

del crecimiento intrauterino, Miller y colaboradores demostraron que la

administración materna de melatonina prenatal reduce las lesiones cerebrales y el

retraso cognitivo en ovinos y, por lo tanto, la melatonina podría ser considerada como

terapia neuroprotectora en esta patología reproductiva (Miller et al. 2014). También se

demostró que la melatonina disminuyó la diseminación del daño neuronal y déficits

cognitivos en un modelo de isquemia en ratón (Beker et al. 2015). En nuestro modelo

de parto prematuro, la melatonina previno el daño generalizado fetal y

particularmente la falta de irrigación del cerebro inducida por LPS, mostrando los fetos

un aspecto similar a los controles. Tanto el parénquima cerebral como las estructuras

Discusión

98

meníngeas, presentaron una citoarquitectura conservada y se observó una leve

infiltración leucocitaria sólo en las meninges.

Como se ha mencionado varias veces, las infecciones intrauterinas durante la

gestación se caracterizan no sólo por niveles elevados de citoquinas proinflamatorias

en el líquido amniótico, miometrio, membranas fetales y suero materno sino también

en distintos tejidos fetales (Goldenberg et al. 2000). Estímulos proinflamatorios

recibidos por la hembra gestante en roedores durante el período prenatal reportan un

aumento agudo en la expresión basal de citoquinas como IL-1β en el cerebro fetal (Cai

et al. 2000; Meyer et al. 2006). Ha sido demostrado que la IL-1 es un mediador

conocido de daño neuronal tanto en modelos de isquemia como de inflamación

inducida por LPS en el cerebro neonatal y la administración de un antagonista del

mismo ha documentado efectos protectores sobre el daño celular (Loddick & Rothwell

1996; Hagberg et al. 1996; Cai et al. 2003). Asimismo, se ha demostrado que la

melatonina previne el aumento sobre los niveles IL-1β en la línea celular RAW

264.7 por LPS y en cerebro de ratón por DINP (ftalato de diisononilo) (Xia et al. 2012;

Ma et al. 2015). Siguiendo con esta línea, Wong y colaboradores mostraron que la

exposición sistémica a LPS dio lugar a una aumento de IL-1β en el cerebro de rata y la

melatonina administrada 5 minutos luego del LPS no atenuó la inducción de IL-1β en

este tejido pero sí en suero (Wong et al. 2014). En contraste, nuestro modelo de parto

prematuro el LPS produjo un aumento en la expresión de ARNm de IL-1β en el cerebro

fetal mientras que la melatonina, administrada antes que el LPS en el día 14 de

gestación, sí previno este aumento. En cambio, Xu y colaboradores demostraron que la

melatonina administrada por vía materna regula diferencialmente citoquinas

proinflamatorias inducidas por LPS en suero materno, líquido amniótico, el hígado y el

cerebro fetal. Particularmente en este trabajo, los niveles de IL-1β no se vieron

modificados por el tratamiento con LPS en ninguno de los tejidos estudiados, lo que

podría deberse a que la dosis de LPS utilizada fue menor que las de nuestro modelo

(Xu et al. 2007).

El NO y las especies reactivas de oxígeno ejercen múltiples efectos

moduladores sobre la inflamación y juegan un papel clave en la regulación de las

respuestas inmunes. Elevados niveles de NO, generados principalmente por la NOSi,

son tóxicos y proinflamatorios (Guzik et al. 2003). Numerosas evidencias demuestran

que debido a la administración de LPS, tanto la isoforma inducible como las

constitutivas de las NOS contribuyen al aumento en los niveles de NO provocando

alteraciones estructurales en el cerebro murino (Zhou et al. 2005; Czapski et al. 2007;

Yao et al. 2010). En cambio, Patruno y colaboradores afirman que el LPS produce un

aumento de la expresión de la NOSi y una disminución de las isoformas constitutivas

en la línea celular H9c2 de cardiomiocitos de ratón (Patruno et al. 2012). En nuestro

modelo de parto prematuro, el LPS produce un aumento tanto en la expresión del

ARNm de la isoforma NOSi como de la NOSn en el cerebro fetal y la melatonina

Discusión

99

previene este aumento en ambos casos. Como se mencionó anteriormente, se ha

mostrado de forma consistente que la melatonina inhibe la inducción de NOSi, pero no

así de las formas constitutivas (Koh 2008; Wang et al. 2011; Nair et al. 2011).

Recientemente, ha sido publicado que la melatonina previno la expresión de las tres

isoformas de la NOS inducida por hipoxia/reoxigenación en el SNC de rata (Huang et

al. 2015). Los resultados del presente estudio se condicen con la inhibición de la

inducción de la NOSi por la melatonina y aportan evidencia del mismo efecto sobre la

NOSn. Actualmente, fármacos que interfieren con el aumento del NO y los radicales

libres son utilizados como tratamientos antiinflamatorios (Guzik et al. 2003). Con el fin

de proteger el cerebro fetal antes de que ocurra una lesión irreversible, la

neuroprotección es el objetivo principal del tratamiento con melatonina y este estudio

proporciona una prueba más de que esta indolamina mediante la regulación de las

distintas isoformas de NOS podría estar contribuyendo a la neuroprotección fetal.

Nuestros resultados indican que la melatonina puede tener un doble

mecanismo de protección, ya que no sólo actuó como un agente tocolítico, sino

también aumentó la supervivencia de la descendencia. El efecto protector de la

melatonina sobre la descendencia en modelos de parto prematuro no ha sido aún

reportado. Sin embargo, se demostró que la administración materna de melatonina en

ovejas, antes y después de la completa oclusión del cordón umbilical suprime la

peroxidación lipídica neuronal, reduce la astrogliosis y la inflamación, y protege la

integridad de la barrera hematoencefálica de los fetos, lo que sugiere que la

melatonina otorga protección al cerebro fetal en respuesta a la hipoxia (Yawno et al.

2013). Esta indolamina podría ser un recurso promisorio no sólo como agente

tocolítico frente a procesos inflamatorios desencadenantes de parto prematuro sino

también en cuanto a la capacidad de otorgar protección frente a la inflamación y al

estrés nitro-oxidativo a nivel del cerebro fetal, ya que en nuestro modelo disminuyó la

expresión de mediadores proinflamatorios (IL-1β, NOSn y NOSi) en los cerebros fetales

y a su vez previno la infiltración leucocitaria en el parénquima del cerebro fetal.

Teniendo en cuenta su alta lipofilicidad, así como su capacidad para atravesar

fácilmente la barrera hematoencefálica, la melatonina podría llegar a ser una molécula

eficaz especialmente a nivel del sistema nervioso central (Reiter 1995). Quedan por

establecer los mecanismos involucrados en el efecto protector de la melatonina, pero

probablemente esté actuando a través de vías mediadas y no mediadas por receptor,

como se ha mencionado antes. Respecto a esto, ha sido reportada la expresión de los

receptores tipo 1 y tipo 2 de membrana acoplados a proteína G en diversas partes del

sistema nervioso central, tanto en el humano como en el ratón (Imbesi et al. 2006;

Pandi-Perumal et al. 2008). Hasta el momento en el cerebro fetal sólo se ha detectado

la expresión del receptor MT1 en el humano y en la rata, y por lo tanto, parecería

probable que los efectos en este tejido, sean al menos en parte mediados por este

receptor específico (Thomas et al. 2002; Johnston et al. 2006). De hecho, nosotros

Discusión

100

observamos particularmente que la melatonina previene el marcado daño histológico

del cerebro fetal inducido por LPS, suponiendo una acción local. Como se mencionó

anteriormente, dentro de la serie de acciones no mediadas por receptores, la

melatonina secuestra radicales libres y es un antioxidante de amplio espectro (Reiter,

Paredes, et al. 2009). El daño por parte de los radicales libres es común durante el

embarazo y tiene efectos en el feto (Reiter, Tan, et al. 2009). Por lo tanto, estas

acciones antioxidantes de la melatonina también podrían ser responsables de su

efecto protector sobre el cerebro fetal.

Las modificaciones epigenéticas constituyen uno de los mecanismos

regulatorios de la expresión de genes (Probst et al. 2009). Diversas evidencias postulan

que modificaciones epigenéticas durante la gestación están involucradas tanto en el

desencadenamiento del parto prematuro como en las consecuencias sobre las crías.

Modificaciones en el patrón de metilación del ADN de las membranas y leucocitos

fetales se han asociado al desencadenamiento del parto prematuro (Parets et al. 2013;

Behnia et al. 2015). Asimismo, se ha demostrado que la inflamación prenatal produce

modificaciones epigenéticas en el patrón de metilación del ADN de sangre de cordón

umbilical que podrían aumentar la susceptibilidad a enfermedades crónicas en la vida

adulta (Liu et al. 2013). A su vez, la inflamación prenatal provoca modificaciones

epigenéticas en múltiples tejidos, incluyendo el cerebro, que pueden traer aparejadas

consecuencias a corto y a largo plazo (Borrelli et al. 2008; Hirabayashi & Gotoh 2010;

Riccio 2010; Monk et al. 2012; Benoit et al. 2015). Recientemente, ha sido demostrado

que las modificaciones epigenéticas uterinas se encuentran involucradas en el

desencadenamiento del parto prematuro, ya que en un modelo de parto prematuro

por benzopireno en ratas, el aumento de la expresión de los ARNm uterinos de TNF-α,

IL-1β y COX-2 se debe a la modulación de diversas isoformas de las histonas

deacetilasas o HDAC (Laknaur et al. 2015). En nuestro modelo de parto prematuro

inducido por LPS, un inhibidor de las HDAC (TSA) previno el parto prematuro en el 75%

de los casos y a su vez previno el aumento de la expresión del ARNm de IL-1β inducido

por LPS en el cerebro fetal. Estos resultados aportan evidencia de que modificaciones

epigenéticas se encuentran involucradas tanto en el desencadenamiento del parto

prematuro como en las consecuencias sobre la descendencia. Ésto se condice, en

parte, con un reciente trabajo que ha demostrado que el LPS produce modificaciones

en el patrón epigenético que contribuyen al silenciamiento génico y este efecto es

inhibido por TSA en fibroblastos de pulmón de ratón (Xing et al. 2015).

Como se ha descripto, diversas evidencias postulan que modificaciones

epigenéticas durante la gestación están involucradas tanto en el desencadenamiento

del parto prematuro como en las consecuencias sobre las crías. Ha sido demostrado

que el LPS produce cambios en el patrón de acetilación de histonas. Por un lado, se ha

demostrado que aumenta la acetilación de la H3 y a su vez que aumenta la expresión

Discusión

101

de la IL-1β mediante la acetilación de la H3 de su promotor (Kaminski & Stavnezer

2007; Schaafsma et al. 2015). En cambio, Xing y colaboradores demostraron que el LPS

incrementa los niveles y la actividad de varias isoformas de HDAC vía TLR-4, resultando

en la desacetilación de las histonas H3 y H4 que contribuyen al silenciamiento génico y

como se mencionó en el párrafo anterior este efecto del LPS es inhibido en presencia

de TSA (Xing et al. 2015). Se sabe que la activación de NF-κB induce una variedad de

procesos epigenéticos, como modificaciones de la acetilación de histonas y metilación

del ADN, llevando eventualmente a un aumento de la expresión de genes

inflamatorios y/o a una disminución de la expresión de genes antiinflamatorios

(Adcock et al. 2005). En nuestro modelo de parto prematuro, el LPS aumentó

significativamente la actividad de las histonas acetilasas o HAT así como los niveles de

acetilación de la H3 en el cerebro fetal, lo que podría estar modulado por NF-κB,

mediando el aumento de la expresión de los ARNm de IL-1β, NOSn y NOSi.

Voiculescu y colaboradores hicieron una revisión sobre la participación de la

melatonina en el desarrollo embrio-fetal y proponen que la melatonina estaría

implicada en eventos que van desde la calidad de los ovocitos hasta el momento del

parto, ya que sus concentraciones en suero durante el embarazo van aumentando

progresivamente y sus receptores se encuentran ampliamente distribuidos en el

embrión y el feto. Por ello, la influencia de la melatonina sobre el feto humano en

desarrollo podría no estar limitado a la ritmicidad circadiana sino también parecería

tener un efecto directo sobre el desarrollo del sistema nervioso y endocrino, siendo un

importante regulador epigenético durante toda la gestación (Voiculescu et al. 2014).

Sharma y colaboradores han demostrado que concentraciones fisiológicas de

melatonina aumentan significativamente la acetilación de las histonas y la expresión

del ARNm de varias isoformas de HDAC en la línea celular de células madre neurales

C17.2 N de ratón. Es importante destacar que en este trabajo se demostró que la

incubación con melatonina durante 24 horas produjo un aumento significativo en la

acetilación de la histona H3 sólo en el rango de concentración fisiológico, efecto que

no se observó a concentraciones menores y mayores (Sharma et al. 2008). A su vez, se

postula que existe una regulación diferencial de la expresión de determinados genes

por parte de la melatonina en condiciones de estrés nitro-oxidativo, ya que esta

indolamina no sólo disminuye la capacidad de unión del NF-κB al ADN sino que

también, mediante modificaciones epigenéticas, disminuye la expresión de este factor

de transcripción e incrementa la expresión de Nrf2, un factor de transcripción

implicado en regular positivamente genes antioxidantes en respuesta a cambios en el

estado de óxido-reducción celular (Li et al. 2009; Jung et al. 2010; Tripathi & Jena

2010). En nuestro modelo, la melatonina no tuvo un efecto per se ya que por sí sola no

produjo modulaciones en cuanto a la acetilación de la H3, ni a la actividad de HAT con

respecto al tratamiento control pero revirtió significativamente ambos efectos

inducidos por el LPS en el cerebro fetal. En lo que respecta a que la melatonina previno

el aumento inducido por LPS de los niveles de ARNm de IL-1β, NOSn y NOSi, pensamos

Discusión

102

que es probable que esta acción inhibitoria en el cerebro fetal, esté relacionada con las

modificaciones en el patrón epigenético, donde podrían estar involucrados NF-κB y

Nrf2.

Como se ha mencionado, la exposición prenatal a la inflamación parecería ser

un factor causal importante de los resultados adversos para los niños nacidos

prematuros o a término. Con respecto a la exposición prenatal a LPS, se ha

demostrado que conduce a consecuencias tales como la reducción del peso desde el

nacimiento hasta la adultez y retrasos en el desarrollo (Asiaei et al. 2011; Foley et al.

2014). En nuestro modelo experimental, los fetos nacidos prematuros no sobreviven

fuera del útero pero en el 50% de las hembras tratadas con melatonina en presencia

de LPS donde se revirtió el parto prematuro, todas las crías nacieron vivas y su peso

corporal al nacer no difirió de los animales control. A su vez, a estas crías se les realizó

un seguimiento durante el período de lactancia, en el cual tuvieron la misma tasa de

ganancia de peso que los animales controles. Asimismo, los parámetros de desarrollo

evaluados como la separación del pabellón auricular, la erupción de los dientes y la

apertura ocular ocurrieron en el mismo día que los animales provenientes de hembras

controles o tratadas con melatonina, indicando un desarrollo postnatal normal.

La inflamación o infección intrauterina materna es un factor de riesgo

importante de lesión cerebral neonatal en la sustancia blanca y futuros déficits

neurológicos (Jin et al. 2015). En humanos, se ha demostrado que las infecciones

durante la gestación producen inflamación causando diversas deficiencias neurológicas

postnatales, dando lugar a discapacidades de aprendizaje y de memoria persistentes

(Meyer et al. 2009). Estudios en animales proporcionan evidencia de una relación

causal entre la exposición a inmunógenos prenatales y anomalías conductuales-

cognitivas en la descendencia (Meyer et al. 2009). Más precisamente, dependiendo del

momento del desafío y de la naturaleza del mismo, la activación inmune materna

resulta en diferentes anomalías de comportamiento y disfunciones cerebrales (Fortier

et al. 2007; Depino 2015). En particular, diversos trabajos en roedores han demostrado

que la exposición a LPS en distintos días de gestación pueden provocar una alteración

en el comportamiento relacionado con el aumento de la ansiedad y una reducción en

la actividad exploratoria (Wang et al. 2010; Enayati et al. 2012; Penteado et al. 2014;

Harvey & Boksa 2014; Depino 2015). Sin embargo, otros trabajos describen que el LPS

prenatal disminuye el comportamiento relacionado con la ansiedad en la descendencia

(Asiaei et al. 2011; Solati et al. 2015). En nuestro modelo de parto prematuro inducido

por LPS no se puede evaluar el efecto per se del LPS sobre el crecimiento y

comportamiento a largo plazo en la descendencia, ya que el LPS produce 100% de

parto prematuro durante la noche del día 15 de gestación y la descendencia no es

viable fuera del útero debido a su prematurez. Por consiguiente, el objetivo fue

evaluar el comportamiento de las crías provenientes de hembras tratadas con LPS en

presencia de melatonina con el fin de dilucidar si presentaban diferencias con respecto

Discusión

103

a los animales provenientes de madres control. Por un lado, en el test de campo

abierto la actividad locomotora en los animales provenientes de madres tratadas con

LPS en presencia de melatonina fue similar a los controles y en una segunda exposición

al ambiente presentaron el mismo grado de habituación. Asimismo, tanto en el test de

campo abierto como en el de laberinto elevado en cruz, los animales provenientes de

madres tratadas con LPS en presencia de melatonina mostraron un comportamiento

similar a los controles en parámetros relacionados a la ansiedad. Se propone al estrés

prenatal como un factor de riesgo importante en el desarrollo de alteraciones

cognitivas a largo plazo en la descendencia como la memoria asociativa (Nazeri et al.

2015). Al evaluar a los animales provenientes de madres tratadas con LPS en presencia

de melatonina en el test de evitación inhibitoria, éstos mostraron el mismo grado de

memoria asociativa con respecto a los controles. Estos resultados apoyan que la

melatonina podría estar protegiendo frente a posibles efectos a largo plazo del LPS

sobre la descendencia, teniendo en cuenta los diferentes efectos previamente

reportados del lipopolisacárido a menores dosis durante la gestación (Wang et al.

2010; Penteado et al. 2014; Harvey & Boksa 2014; Depino 2015).

La melatonina es actualmente un medicamento de venta libre y aparentemente

sin efectos adversos. Su toxicidad es extremadamente baja y no se han encontrado

efectos adversos aún cuando se ha administrado a dosis elevadas como por ejemplo

de 800 mg/kg a animales de experimentación (Mohammadghasemi et al. 2012). A su

vez, se ha demostrado que incluso a muy altas dosis administradas durante la

gestación, la melatonina no presenta toxicidad materna o fetal (Jahnke et al. 1999;

Welin et al. 2007; Yawno et al. 2013; Hobson et al. 2013; Voiculescu et al. 2014). Hasta

el momento, ha sido probada en mujeres con otras patologías reproductivas como la

restricción del crecimiento intrauterino y la preclampsia (Alers et al. 2013; Hobson et

al. 2013). También en neonatos en casos de sepsis, asfixia, y dificultades respiratorias o

postquirúrgicas (Fulia et al. 2001; E Gitto et al. 2004). A pesar de que ya hay algunos

estudios clínicos en mujeres embarazadas y neonatos, donde se demuestra que la

melatonina parecería ser segura, consideramos que faltan aún más estudios para que

su uso farmacológico sea extendido a mujeres embarazadas con riesgo de parto

prematuro debido a la posibilidad de efectos sobre la descendencia aún no conocidos.

Como se han ido mencionando, en modelos animales es de sólida evidencia la acción

neuroprotectora de la melatonina, lo cual genera expectativas para su uso en

humanos, ya que los recién nacidos son muy susceptibles al daño nitro-oxidativo y a la

inflamación, por lo tanto la melatonina podría tener importantes efectos

neuroprotectores (Eloisa Gitto et al. 2004). Sin embargo, Houdek y colaboradores

demostraron que en ratas donde se suprimieron los niveles de melatonina endógena y

recibieron dosis farmacológicas durante la gestación, el tratamiento afectó el ritmo

circadiano fetal a nivel del SNC. Por lo tanto, estos resultados ponen en consideración

la existencia de otros posibles efectos (Houdek et al. 2015). También, considerando el

Discusión

104

reciente papel descubierto de la melatonina como modulador epigenético, resulta

necesario realizar más estudios para confirmar que no hay reacciones adversas de

inicio tardío en la vida adulta.

No hay duda que el tiempo de gestación o grado de prematuridad ejerce la

mayor influencia en las secuelas del parto prematuro. El comienzo del trabajo de

parto antes de tiempo puede considerarse como un mecanismo de defensa de la

madre contra la infección uterina, a través del cual elimina tejidos infectados,

incluyendo al feto. Entonces, si las manifestaciones clínicas son adaptativas habría

que considerar el equilibrio entre el intento de prolongar la gestación para promover

la maduración fetal y la exposición del feto a un ambiente intrauterino subóptimo o

incluso peligroso. La inflamación y el estrés oxidativo parecen ser dos caras de la

misma moneda que contribuyen, en parte a través de mecanismos similares, a las

lesiones en los recién nacidos prematuros. Las intervenciones que intentan reducir la

incidencia de parto prematuro siguen siendo limitadas, pero lo que sí se ha logrado

hasta el momento es mantener la tasa de parto prematuro y disminuir la mortalidad

perinatal debido a las mejoras en las intervenciones de neonatología. Más allá de

estas mejoras que aumentan considerablemente la sobrevida de los nacidos

prematuros y les otorgan mejores condiciones a corto y largo plazo, sin lugar a duda

son necesarias nuevas estrategias de prevención y reducción del parto prematuro

para disminuir la morbimortalidad fetal y mejorar las condiciones de salud de los

nacidos prematuros incluso en la adultez. En nuestro modelo de parto prematuro, la

melatonina mostró capacidad tocolítica, previniendo el parto prematuro en el 50%

de los casos, permitiendo que ocurra la maduración de la descendencia dentro del

útero. Además, tendría la capacidad de otorgar protección al cerebro fetal a través

de sus funciones antioxidantes y antiinflamatorias, produciendo una respuesta

neuroprotectora frente a la inflamación intrauterina.

Conclusiones

Conclusiones

105

Conclusiones

1. Efecto de la melatonina sobre el desencadenamiento del parto prematuro

En hembras BALB/c de día 15 de gestación, la melatonina previno el parto

prematuro inducido por LPS en el 50% de los casos.

La melatonina impidió la dilatación y el sangrado del cérvix inducido por LPS.

2. Mecanismos implicados en el desencadenamiento del parto prematuro inducido por LPS

y la reversión por la melatonina

En el útero de hembras preñadas de d15 de gestación:

La melatonina previno el aumento de los niveles de TNF-α inducido por LPS.

La melatonina previno el aumento de la actividad de la NOS y la expresión de

NOSi inducido por LPS.

La melatonina previno el aumento de los niveles de PGE2 y PGF2α, y la

expresión de COX-2 inducido por LPS.

3. Consecuencias de la administración de LPS en el día 15 de preñez en el cerebro fetal y el

efecto de la melatonina sobre el mismo

En el cerebro fetal proveniente de hembras preñadas de d15 de gestación:

La melatonina previno la desorganización del parénquima y de las estructuras

meníngeas, como así también la infiltración leucocitaria en el parénquima

inducida por LPS.

La melatonina previno el aumento de la expresión de ARNm de IL-1β inducido

por LPS.

La melatonina previno el aumento de la expresión de ARNm de NOSn y NOSi

inducido por LPS.

La melatonina previno el aumento de la acetilación de H3 inducido por LPS.

Conclusiones

106

La melatonina previno el aumento de la actividad de la HAT inducido por LPS.

A su vez, un inhibidor de las HDAC (TSA) previno el parto prematuro inducido por LPS

en el 75% de los casos y también previno el aumento de la expresión de ARNm de IL-1β

inducido por LPS en el cerebro fetal.

4. Crecimiento y un comportamiento de las crías provenientes de hembras tratadas con

melatonina y LPS donde se revirtió el parto prematuro

Las crías provenientes de madres tratadas con melatonina y LPS donde se revirtió

el parto prematuro:

Tuvieron el mismo peso al nacer y la misma tasa de crecimiento durante el

período de lactancia.

No difirieron en el momento en que se produjo la separación del pabellón

auricular, la erupción de los dientes y la apertura ocular con respecto a los

animales control.

En el período de adultez con respecto al tratamiento control:

No se observaron cambios en la actividad locomotora, los niveles de

comportamiento asociado a la ansiedad y la memoria de habituación en el test

de campo abierto.

No hubo diferencias en los niveles de comportamiento asociado a la ansiedad

en el test de laberinto elevado en cruz.

No difirieron en el grado de memoria asociativa en el test de laberinto elevado

en test de evitación inhibitoria.

Los presentes resultados nos permiten concluir que la melatonina permitiría

ampliar los recursos disponibles ante el desafío terapéutico que enfrentan los

obstetras tanto en la prevención del parto prematuro como en la disminución de las

secuelas en el neurodesarrollo de los recién nacidos.

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107

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