Messa a punto di un innovativo modello murino umanizzato...

Progetto di Ricerca Giacomo Oliveira

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Messa a punto di un innovativo modello murino umanizzato per lo studio di fattori prognostici molecolari e di meccanismi di immunoevasione nella

leucemia mieloide acuta: relazione finale

Background e scopo del progetto di ricerca

Sebbene gli studi attuali abbiano permesso di descrivere le mutazioni più frequenti nelle

leucemie mieloidi acute (acute myeloid leukemia, AML), la conoscenza dei meccanismi biologici

che permettono alle cellule leucemiche di crescere eludendo il controllo del sistema immunitario

e di resistere ai diversi approcci terapeutici rimane tuttavia parziale. Ciò è dovuto alla difficoltà di

eseguire studi che permettano di definire l’impatto delle lesione genetiche sui meccanismi

biologici delle cellule leucemiche e di correlare i processi deregolati con la prognosi della

patologia. In aggiunta, la grande variabilità inter-paziente spesso limita l’elucidazione di

meccanismi condivisi da molteplici patologie leucemiche. Gli studi funzionali sono spesso

limitati dall’incapacità di mantenere o crescere in vitro cellule leucemiche primarie, nonché

dall’impossibilità di ricostituire artificialmente il microambiente tumorale. D’altro canto, la

trasferibilità nella pratica clinica delle informazioni ottenute da modelli di leucemia murina è

fortemente limitata dalle evidenti barriere di specie.

Con lo scopo di superare queste limitazioni, questo progetto di ricerca si è rivolto allo

sviluppo di un innovativo modello murino umanizzato per (i) studiare fattori prognostici

molecolari e (ii) caratterizzare i meccanismi di immunoevasione nella leucemia mieloide acuta.

Tale modello si propone di coniugare la riproducibilità e il potere analitico dei modelli animali

con l’alta informatività derivante dall’analisi delle leucemie primarie umane.

Risultati

Identificazione di fattori prognostici della leucemia acuta

Cinquantuno leucemie primarie umane

(Tabella 1) sono state infuse in topi

immunodeficienti NSG (NOD SCID gamma

# AML testate 51

Cellule infuse (x106) 9.5

Deplezione linfociti T 86.3% (44)

origine Midollo: 62.7% (32) Sangue periferico 37.3%(19)

Campione fresco 13.7% (7)

Stato della malattia Diagnosi: 72.5% (38)

Post-chemioterapia: 25.5% (12) Altri: 2% (1)

Tabella 1. Caratteristiche delle leucemie testate.


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chainnull) di 4-8 settimane non irradiati. I linfociti T contenuti nei campioni primari sono stati

depletati con biglie magnetiche per evitare il loro attecchimento e la conseguente reattività

contro i tessuti murini. Dopo l’infusione, la comparsa di cellule leucemiche sul sangue periferico

è stata quantificata settimanalmente in modo tale da monitorare l’attecchimento. Venticinque

delle 51 AML (49%) hanno generato degli xenotrapianti e sono cresciute nei topi (Fig. 1A): ciò

ha permesso di espandere di circa 5 volte le cellule leucemiche primarie (Fig. 1B), fattore

necessario per la loro caratterizzazione e per il loro impiego nei successivi esperimenti. In

particolare la cinetica di attecchimento si è rivelata riproducibile tra i replicati biologici costituiti

0

20

40

60

80

100

leuk

emic

cel

ls (x

106 )

/ mou

se12.4

63.2

25

1433.46

n = Median Fold Increase =

Median Days =

Infused (iv)Harvested form BMHarvested form Spleen

0 25 50 75 100 125 150 200 250 3000

250

500

750

1000200040006000

Days after infusion

leuk

emic

cells

/ µ

L (m

edia

n)

AML#51AML#50AML#49

AML#47AML#44AML#43

AML#33AML#31AML#29AML#27AML#25AML#23AML#21AML#20AML#17AML#16AML#14AML#12AML#8AML#7

AML#1

AML#40

AML#4

AML#39

AML#48

A B

Primary AML

-3 -2 -1 0 1 2-2

-1

0

1

2

Dimension 1

Dim

ensio

n 2

UPN#1

UPN#8

UPN#16

UPN#12

C

NSG xenografts

0 25 50 75 100 1250

250

500

750

1000200040006000

Days after infusion

leuk

emic

cells

/ µ

L

AML#25

Relapse post alloHSCTDiagnosis

D

Figura 1. Caratterizzazione dell’attecchimento delle leucemie nei topi NSG. (A) Cinetica di crescita delle cellule leucemiche misurata su sangue periferico di topi NSG. Ogni colore indica una leucemia primaria differente testata in diversi topi (n da 1 a 15). Ogni leucemia mostra un profilo di crescita paziente specifico. (B) Quantità di cellule leucemiche purificate infuse per ciascun topo (grigio chiaro) e ricavate dalla milza e dal midollo osseo dei topi al sacrificio (grigio scuro). Le barre mostrano i risultati per le 25 leucemie che hanno attecchito nei topi. L’attecchimento nei topi permette l’espansione delle cellule leucemiche. (C) Cinetica di crescita su sangue periferico delle cellule leucemiche di uno stesso paziente prelevate in due timepoint differenti del suo decorso clinico (giallo=diagnosi, blu=recidiva post trapianto allogenico). La capacità di attecchire in topi viene mantenuta in maniera indipendente dallo stadio della malattia. (D) Analisi del profilo di espressione genica di 4 leucemia alla diagnosi (cerchi vuoti) e dopo attecchimento in topi NSG (cerchi pieni). Mentre leucemie appartenenti a pazienti diversi sono molto eterogene, i campioni derivati dai topi si dispongono vicini alle rispettive leucemie di origine, dimostrando come il loro trascrittoma sia simile alle leucemie primarie parentali.


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da diversi topi NSG; inoltre la capacità di generare xenotrapianti è risultata caratteristica di ogni

AML e paziente-specifica, dal momento che tale proprietà si è mantenuta costante quanto sono

stati testati differenti campioni provenienti da stadi di malattia diversi dello stesso paziente (Fig.

1C). L’analisi del trascrittoma tramite microarray ha permesso di evidenziare come il profilo di

espressione sia caratteristico di ciascun paziente, ma anche come tale profilo sia riproducibile

negli animali (Fig. 1D). In casi selezionati (n=6), le cellule leucemiche attecchite sono state

reinfuse in altri topi riceventi, in modo tale da realizzare trapianti seriali, e il loro profilo di

espressione genica è stato analizzato tramite microarray. In particolare abbiamo osservato che

leucemie fortemente adattate all’ambiente murino mostrano una cinetica di crescita più

aggressiva (Fig. 2A). Tale comportamento correla con una perturbazione dell’espressione

genica e con l’acquisizione di un profilo specifico caratterizzato dalla prevalente deregolazione

leuk

emic

cel

ls /u

L

0 25 50 75 100 125 1500

250

500

750

1000

2000

4000

6000 AML#1

0 25 50 75 100 125 1500

250

500

750

1000

2000

4000

6000 AML#8

0 25 50 75 100 125 1500

250

500

750

1000

2000

4000

6000 AML#12

0 25 50 75 100 125 1500

250

500

750

1000

2000

4000

6000 AML#16

Days after infusion

A

cell cycleRNA or DNA metabolismCell metabolismResponse to stress Immune processesCellular organizationSignaling

B

C Upregulated genes DescriptionARHGAP5 Rho GTPase Activating Protein 5AURKA Aurora kinase AAZU1 Azurocidin1C2orf44 chr2 open reading frame 44CCDC34 Coiled-Coil Domain Containing 34CDC20 Cell Division Cycle 20CENPF Centromere Protein FCTSG Cathepsin GDLGAP5 Discs Large (Drosophila) homolog-associated protein 5MPO MyeloperoxidaseNCOA5 Nuclear receptor coactivator 5PHF23 PHD Finger Protein 23PPP1R10 Protein Phosphatase 1, Regulatory Subunit 10PRTN3 Proteinase 3 +serpine 1 serpine 2PSRC1 Proline/Serine-Rich Coiled-Coil 1RNASE3 Ribonuclease, RNAse A family, 3RNASEH2C Ribonuclease H2 subunit CTMEM177 Transmembrane Protein 177TP53RK TP53 Regulating Kinase1 +p53TRIM13 Tripartite Motif Containing 13WDR4 WD repeat domainZBTB3 Zinc Finger And BTB Domain Containing 3ZNF627 Zinc Finger Protein 627ZNF788 Zinc Finger Protein 788

Downregulated genes DescriptionATF3 Activating Transcription Factor 3 CD44 CD44 moleculeCEP170 Centrosomal Protein 170kDACHMP1B Charged Multivesicular Body Protein 1BFAM65B Family With Sequence Similarity 65, Member BIDS Iduronate 2-SulfatasKLF6 Kruppel-Like Factor 6 +TP53KRT8P9 Keratin 8 Pseudogene 9LOC649431LOC653171LOC728098MYADM Myeloid-Associated Differentiation MarkerPPTC7 PTC7 protein posphatase homologSTK17B Serine/Threonine Kinase 17bTIPARP TCDD-Inducible Poly(ADP-Ribose) PolymeraseUBE2A Ubiquitin-Conjugating Enzyme E2AVIM VimentinYPEL5 Yippe-like5

Figura 2. Trapianti seriali delle leucemie attecchite nei topi NSG e identificazione dei geni associati ad una maggiore aggressività in vivo . (A) Cinetica di crescita delle cellule leucemiche misurata su sangue periferico di topi NSG in seguito a trapianti seriali. Con l’aumentare dei trapianti seriali, la stessa leucemia mostra una cinetica di crescita più aggressiva. (B) Classificazione dei processi deregolati da ciascuna leucemia in seguito all’attecchimento nel topo. La maggiore parte dei geni deregolati appartiene alla regolazione del ciclo cellulare e al metabolismo degli acidi nucleici ad esso collegato. (C) Geni deregolati stabilmente da tutte le leucemie in seguito a trapianto seriale in topi NSG. Sono elencati 24 geni upregolati (rosso) e 18 geni downregolati (blu).

1st recipients 2nd recipients 3rd recipients 4th recipients

0 25 50 75 100 125 1500

250

500

750

1000

2000

4000

6000 AML#25

0 25 50 75 100 125 1500

250

500

750

1000

2000

4000

6000 AML#20


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di processi coinvolti nella proliferazione cellulare (Fig. 2B). Sono stati identificati 42 geni

deregolati da tutte le leucemie in seguito ad attecchimento nel topo e correlati con un aumento

dell’aggressività delle AML nel nostro modello (Fig. 2C). Tra questi spiccano geni legati alla

mitosi cellulare (AURKA, CDC20), alla riorganizzazione della cromatina (CENPF, CEP170) e al

differenziamento mieloide (come AZU1, MPO, MYADM, CTSG), la cui deregolazione è stata

spesso associata ad una maggiore aggressività delle cellule tumorali (Zhang et al, Clin Cancer

Res 2013; Jin, Oncogene 2013 et al.; Katayama et al., Cancer Cell 2012). Il nostro modello

fornisce quindi un contesto idoneo per lo studio di tali geni nell’ambito della leucemia mieloide

acuta.

Nell’ambito delle leucemie mieloidi acute, l’attecchimento in topi immunocompromessi risulta

essere maggiore per patologie ad alto rischio con una prognosi sfavorevole (Pearce et al, Blood

2006). Nella nostra casistica l’attecchimento delle leucemie primarie in topi NSG è strettamente

associato alla ricaduta di malattia dopo terapia (Fig. 3A-B). In particolare in analisi statistica

univariata e multivariata, la capacità di generare degli xenotrapianti si è dimostrata una

proprietà fortemente correlata con la recidiva di malattia (p=0,002), indicando come lo studio dei

fattori in grado di influire su tale attecchimento sia di grande rilevanza per predire la risposta alle

terapie. Sono stati perciò correlate diverse proprietà cliniche e molecolari delle AML testate con

la loro capacità di attecchire negli animali. I risultati ottenuti hanno evidenziato come l’assetto

mutazionale delle leucemie sia fortemente associato all’attecchimento: mentre la presenza di un

cariotipo aberrante non risulta correlata con la capacità di generare degli xenotrapianti, la

presenza delle tre mutazioni più frequenti nell’ambito della leucemia acuta (mutazione

0 500 1000 1500 20000

20

40

60

80

100

Days from diagnosis

Leuk

emia

free

sur

vival

0.0022p=**

Non Engrafters (n=21)

Engrafters (n=10)

0 500 1000 1500 20000

20

40

60

80

100

Days from diagnosis

Rela

pse

incid

ence

Non Engrafters (n=21)

Engrafters (n=10)

< 0.0001p=****

A B

Figura 3. L’attecchimento delle AML in topi NSG come fattore prognostico sfavorevole. Le curve di Kaplan-Meier riportate mostrano la sopravvivenza libera da malattia (A) e l’incidenza di recidiva (B) nei pazienti le cui leucemie acute hanno originato xenotrapianti in topi NSG (rosso, n=10) o in quelli le cui AML non hanno attecchito nel topo (nero, n=21). Entrambe le curve prendono in considerazione i soli pazienti le cui leucemie sono state testate alla diagnosi (Tabella 1). Questi dati dimostrano come l’attecchimento nei topi immunodeficienti permette di identificare pazienti con una prognosi negativa.


5

puntiforme del gene DNMT3A, mutazione puntiforme del gene NPM1 e duplicazione tandem

interna del gene FLT3) è significativamente associata all’attecchimento in topi NSG (Fig. 4A).

Inoltre la co-occorren za di queste tre mutazioni ha un notevole impatto sul tasso di

attecchimento (Fig. 4B). Questi dati dimostrano come il carico mutazionale delle leucemie (ed in

particolare le mutazioni dei geni DMNT3A, NPM1 e FLT3) influenzi la capacità delle cellule

leucemiche di generare degli xenotrapianti in topi immunodeficienti e permetta di identificare

AML ad alto rischio prognostico.

0 25 50 75 100 125 1500

25

50

75

100

Time of engraftment (days)

% o

f eng

rafte

d AM

L

p = 0.0883

p = 0.0134

p = 0.0026

3

2

1

0

# of most common mutations(FLT3ITD, DNMT3A mut, NPM1mut)

# of most common mutation

(FLT3 ITD, NPM1 mut, DNMT3A mut)

Most commonly mutated genes in AML

FLT3-ITDNPM1 mutDNMT3A mut

FLT3 wtNPM1 wtDNMT3A wt

0 25 50 75 100 125 1500

25

50

75

100

Time of engraftment (days)

% o

f eng

rafte

d AM

L

p = 0.0295

p = 0.0244

p = 0.0113

A

B

Figura 4. Associazione tra il profilo mutazionale e trascrizionale delle leucemia e l’attecchimento in topi immunodeficienti. (A-B) Curve Kaplan-Meier relative al tasso di attecchimento delle leucemie testate alla diagnosi in relazione al tipo (A) o al numero (B) delle mutazioni più ricorrenti nelle AML. I risultati dimostrano che la copresenza delle tre mutazioni si associa a un maggior tasso di attecchimento. (C) Analisi della varianza dell’espressione genica delle leucemie primarie capaci di generare xenotrapianti (arancione) o leucemie che non attecchiscono nei topi (blu). I simboli uguali identificano dei replicati tecnici di uno stesso campione, mentre simboli diversi rappresentano campioni appartenenti a pazienti diversi. Le leucemie in grado di attecchire nel topo mostrano un profilo di espressione genica più omogeneo. (D) Heatmap rappresentante il set di 136 geni differenzialmente espressi tra leucemie in grado o meno di generare xenotrapianti.

-100 -50 0 50 100-100

-50

0

50

100

PC1: 59% expl. var.

PC2:

41%

exp

l. va

r.

Engrafters Non EngraftersC

FOCA_Diagn Engrafted_2


MABI_postCT Engraft_3


PLGA_Diagn Engrafted_3


JARA_postCT Engraft_2JARA_postCT Engraft_2M

OG

E_postCT Engraft_3M

OG

E_postCT Engraft_3PIAG

_Diagn Engrafted_3PIAG

_Diagn Engrafted_3M

AGI_postCT Engraft_1

MAG

I_postCT Engraft_1FRLA_Diagn Engrafted_1FRLA_Diagn Engrafted_1M

ACE_Diagn Engrafted_1M

ACE_Diagn Engrafted_1ZIDO

_Diagn Engrafted_2ZIDO

_Diagn Engrafted_2BADI_Diagn Non Engraft_2BADI_Diagn Non Engraft_2BAPI_Diagn Non Engraft_3BAPI_Diagn Non Engraft_3CAEL_Diagn Non Engraft_1CAEL_Diagn Non Engraft_1M

AEL_Diagn Non Engraft_2M

AEL_Diagn Non Engraft_2ANAN_Diagn Non Engraft_1ANAN_Diagn Non Engraft_1CALU_postCT Engraft_2CALU_postCT Engraft_2O

ZAR_postCT Engraft_1O

ZAR_postCT Engraft_1TATI_Diagn Non Engraft_3TATI_Diagn Non Engraft_3

SERPINB8AK3L1HS.10862CHD7HOMER3ST3GAL6ITSN1ACSL1SAP30COL5A1SOX18LOC283340RNF144BVNN1CLIP4IGF2BP3VWA5ALDLRAD2BCAS4SULT1A1LOC728047SLC29A2AFAP1L2CYP2C8GPR27EFHC2ITGA2BZNF154ACY3INPP4BGCH1FRMD4BTMEM144DDEF2KLHL3PNMA3LSP1C4ORF32LOC641825ACP6PPM1HLOC391475CARD11ST6GALNAC4IGJPRDM16GLI2LOC647336DOCK1C9ORF58LOC730051JAM3LCTANGPT2PLS1GPR12SLC24A3RPS6KA2TDRD9TRAT1HALMFAP4CYP2E1LOC643911FLJ22536MC1REPHB4LOC401237ALDH1A1LRRN2GPRC5CMPZL2C6ORF192ASAP2GSTO2GATA1ZNF135C20ORF54ZNF418TNFRSF25ABCG1RGS12HOPXSMARCA1CMTM2TSPAN13ARHGEF5LOR2A9PSLC22A5SLC24A4ATP8A1KDELC1MOSC2ACPL2PGAP1TGFAVASNACVR1BCDKN2AABLIM1MMRN1C1ORF150HS.25318H2AFY2AMICA1SORT1NYNRINCD7KLRG1ALDOCLOC286367SPINK2GPR114C11ORF21SPNS3GPR56FAM30AKIAA0125AIF1LSPINT2PADI4CPNE3ZNF185FCER1ASEPT5SH3PXD2AHCP5LTBERMP1RTN4GUCY1A3S100ZS100A10PLIN2FLNBSFRS2B

6

8

10

12

14








OG

E_postCT Engraft_3M

OG



_Diagn Engrafted_3M


MAG











6

8

10

12

14








OG

E_postCT Engraft_3M

OG



_Diagn Engrafted_3M


MAG











6

8

10

12

14








OG

E_postCT Engraft_3M

OG



_Diagn Engrafted_3M


MAG











6

8

10

12

14

Non Engrafters

Engrafters








OG

E_postCT Engraft_3M

OG



_Diagn Engrafted_3M


MAG











6

8

10

12

14

D


6

Infine, con lo scopo di identificare le peculiarità del trascrittoma delle leucemie più aggressive

ed in grado di attecchire nei topi, il profilo di espressione genica delle AML primarie in grado di

generare degli xenotrapianti è stato confrontato con quello di leucemie che sono prive di tale

proprietà. L’analisi della varianza dell’espressione genica ha permesso di visualizzare che,

sebbene le leucemie provenienti da pazienti diversi siano molto eterogenee, le AML in grado di

attecchire nei topi risultano più simili tra loro di quanto siano le altre leucemie (Fig. 4C). Dal

confronto dei due gruppi sperimentali è stato possibile identificare un set di 136 geni espressi in

maniera differenziale dalle leucemie in grado di generare xenotrapianti e che permetta quindi di

identificare le leucemie con una prognosi sfavorevole (Fig. 4D).

Messa a punto di un modello di pressione immunologica in vivo

La disponibilità di leucemie umane in grado di attecchire in topo immunodeficientici ha

permesso di studiare direttamente in vivo l’efficacia della pressione immunologica nel controllo

delle cellule tumorali e i cambiamenti messi in atto dalle leucemie mieloidi acute nell’interazione

col sistema immunitario umano. A tal scopo abbiamo messo a punto un modello che ricapitoli

una pressione immune nei confronti delle cellule leucemiche: una volta attecchite in topi NSG,

le cellule leucemiche sono state sottoposte in vivo ad una pressione immunologica costituita da

infusioni seriali di linfociti T umani. In particolare, per mimare una diversa intensità della

pressione immune, sono stati utilizzati linfociti T provenienti da diversi donatori e dotati di un

differente grado di compatibilità nei confronti delle leucemie (linfociti T autologhi, HLA-identici,

HLA compatibili da donatore da registro, aploidentici o completamente scorrelati), in modo tale

da ottenere un diverso grado di allo-reattività. Per ottenere numeri sufficienti per il trattamento di

diversi topi, le cellule T dei differenti donatori sono state attivate con biglie antiCD3/CD28 ed

espanse in presenza di IL-7 e IL-15, in modo tale da preservarne la policlonalità e le potenzialità

effettrici (Kaneko, Blood 2009). Un gruppo di controllo ha ricevuto la sola leucemia, in assenza

di trattamento linfocitario. I risultati ottenuti su 4 leucemie differenti mostrano che in nessuno dei

casi analizzati le cellule autologhe sono state in grado di controllare la crescita delle cellule

leucemiche (Fig. 5, linee verdi). A seconda della leucemia testata, l’utilizzo di linfociti T HLA-

identiche ha consentito di ottenere un controllo della malattia parziale o duraturo (Fig. 5, linee

blu). Al contrario un completo arresto della crescita delle cellule leucemiche è stato raggiunto

con l’infusione di linfociti T con una singola incompatibilità dell’HLA di classe seconda (Fig. 5,

line viola). Infine l’utilizzo di linfociti T completamente o parzialmente scorrelati (Fig. 5, linee

rosa e rosse) ha comportato la completa scomparsa delle cellule leucemiche circolanti nel


7

sangue periferico degli animali trattati. Tale modello dimostra come il riconoscimento alloreattivo

mediato dai linfociti T rappresenta una delle maggiori forze che determinano un effetto

antileucemico delle terapie cellulari che utilizzano linfociti da donatore.

Nonostante l’efficacia dei linfociti T allogenici nel controllare la crescita della malattia, le

cellule leucemiche sono in grado di eludere dal controllo del sistema immunitario, come

dimostrato clinicamente dalla recidiva di malattia in seguito a trapianto di cellule staminali da

No T cells

Autologous T cells

Class II mismatched T cells

Haploidentical T cells

Fully mismatched T cells

HLA-Identical T cells

Treated with:

20 40 60 800

50

100

1000

2000

3000AML#26

20 40 60 800

50

100

500100015002000

AML#16

20 40 60 800

50

100

500

1000AML#8

20 40 60 80 1000

200

400

500

750

1000AML#1

Days after infusion of leukemic cells

leuk

emic

cel

ls / μL

No T cells

Autologous T cells





Treated with:

No T cells

Autologous T cells





Treated with:

Figura 5. Pressione immunologica mediata in vivo dai linfociti T sulle cellule leucemiche attecchite nei topi NSG. I grafici mostrano le conte delle cellule leucemiche misurate sul sangue periferico di topi immunodeficienti in cui è stata fatta attecchire una specifica AML. Una volta stabilita la presenza della leucemia in vivo, i topi hanno ricevuto una o più infusione di 5x106 linfociti T (freccia nera) provenienti da differenti donatori con un diverso grado di disparità genetica nei confronti della malattia. In particolare i differenti gruppi sperimentali (n>4) hanno ricevuto una pressione immunologica costituita da: linfociti T autologhi (verde), linfociti T HLA-identici (blu), linfociti T da donatore da registro con una disparità in uno degli HLA di classe II (viola), linfociti aploidentici (rosa) e linfociti completamente scorrelati (rosso). Per ciascuna delle 4 leucemie testate, un gruppo ha ricevuto la sola leucemia, senza trattamento linfocitario (giallo). I dati mostrano l’attività antileucemica della pressione immune somministrata nei confronti della leucemia: mentre i linfociti T autologhi risultano inefficaci e i linfociti T HLA-identici lo sono solo parzialmente, una singola disparità dei geni HLA è sufficiente a determinare l’eradicazione delle cellule leucemiche dal sangue dei topi, dimostrando come in tale modello l’alloreattività sia la sorgente principale dell’azione antileucemica.


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donatore allogenico. Nel nostro modello abbiamo rilevato due casi sperimentali che indicano

come le cellule leucemiche siano in grado di persistere anche in presenza della pressione

immune mediata dai linfociti T. In un primo caso, il trattamento con linfociti T HLA-identici si è

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

100

200

300

400

10000200003000040000

Treated withHaploidentical T cells

1st recipient NSG 2nd recipient NSG 3rd recipient NSG 4th recipient NSGDays

cells

/ µL

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 5000

100

200

300

400

10000200003000040000

Treated withHLA-mismatched T cells

1st recipient NSG 2nd recipient NSG 3rd recipient NSG 4th recipient NSGDays

cells

/ µL

T cells Leukemic cells DLILegend: CD3 depletion Transfer of leukemic cells in recipient NSG mice

A

C

B

T cells Leukemic cells DLILegend:

0 50 100 1500

100

200

300

400

10000200003000040000

Days ce

lls / µL

0 50 100 1500

100

200

300

400

10000200003000040000

Days

cells

/ µL

UntreatedTreated with


Figura 6. Casi sperimentali di persistenza di malattia in presenza di pressione immunologica mediata dai linfociti T. (A) Immagina istologica raffigurante la colorazione con ematossilina ed eosina del sarcoma extramidollare rilevato in un topo trattato con cellule HLA-identiche. La sezione mostra le cellule leucemiche e l’infiltrato linfocitario umano nelle fibre muscolare murino. (B) Conte cellulari della leucemia (giallo) e dei linfociti T HLA-identici (blu) circolanti nel sangue periferico di topi che hanno ricevuto le cellule leucemiche provenienti dal sarcoma extramidollare in presenza (destra) o in assenza (sinistra) dell’infusione dei linfociti (freccia blu). (C) Conte cellulari misurate su sangue periferico di topi in cui l’AML#1 (giallo) e trattati con linfociti (blu) provenienti da donatore completamente scorrelato (pannello in alto) o donatore aploidentico (pannello in basso). Le frecce blu indicano le infusioni linfocitarie. Al Sacrificio (frecce grigie), i linfociti sono stati rimossi dalla milza e dal midollo osseo degli animali sacrificati (frecce nere) e le cellule rimanenti sono state reinfuse in altri topi riceventi. I dati rimostrano la ricrescita delle cellule leucemiche dopo la rimozione della pressione immune. Le stesse cellule si dimostrano nuovamente sensibili alle infusioni di linfociti T.


9

dimostrato efficace nel controllare la crescita delle cellule leucemiche; in uno degli animali

trattati, tale efficacia è stata però accompagnata dallo sviluppo di un sarcoma extramidollare

costituito da cellule leucemiche umane e da un infiltrato linfocitario umano all’intermo nel

tessuto muscolare murino (Fig. 6A). Per verificare se ciò fosse il risultato di un evento di

immunoevasione della AML#16 nei confronti della pressione immune, le cellule leucemiche del

sarcoma sono state purificate e infuse in topi riceventi secondari (Fig. 6B). Tali cellule sono

state in grado di ricrescere in assenza di trattamento, ma si sono dimostrate nuovamente

sensibili all’infusione degli stessi linfociti T HLA-identici. In un secondo caso abbiamo dimostrato

la persistenza di malattia anche in presenza di una pressione immunologica altamente allo-

reattiva: in topi con AML#1 e trattati con linfociti T parzialmente o completamente scorrelati, la

presenza di cellule leucemiche residue è stata vagliata rimuovendo i linfociti T dal midollo e

dalla milza degli animali sacrificati e trapiantando in modo seriale le cellule rimanenti. In modo

del tutto inaspettato, abbiamo osservato che alcune rare cellule leucemiche sono sopravvissute

al trattamento, sono state trasferite nei topi secondari e sono ricresciute in seguito a trapianti

seriali (Fig. 6C). Una volta riapplicata la pressione immune, tali cellule si sono nuovamente

dimostrate sensibili al trattamento linfocitario e sono state eradicate dal sangue periferico. Tali

osservazioni suggeriscono che alcune cellule leucemiche possono persistere nel nostro modello

sotto il controllo dei linfociti T, e sono in grado di riemergere in seguito alla rimozione della

pressione immune.

Infine, per determinare come la pressione immunologica mediata dai linfociti T influenzi il

profilo di espressione delle cellule leucemiche, abbiamo effettuato un’analisi del trascrittoma

delle cellule leucemiche persistenti dopo trattamento. Per questo motivo, le cellule dell’AML#1

sono state purificate dalla milza e dal midollo di topi trattati con linfociti T autologhi o HLA-

identici e sono state confrontate tramite microarray con cellule leucemiche isolate da topi non

trattati. Data la completa eradicazione, tale studio non è stata effettuata per i topi trattati con

linfociti T scorrelati. L’analisi della varianza dell’espressione genica ha dimostrato che il

trattamento con linfociti T determina una perturbazione del profilo trascrizionale della AML presa

in considerazione (Fig. 7A). Sono stati identificati 2383 geni comunemente deregolati in seguito

a trattamento con linfociti T autologhi e HLA-identici. Interrogando le liste annotate di Gene

Ontology (GO) e Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) sono stati identificati i processi

maggiormente influenzati dalla pressione immune. La maggior parte di questi è costituita da

processi immuni (Fig. 7B): i geni maggiormente deregolati risultano essere correlati alla risposta

agli interferoni, come molte subunità del proteasoma e dell’immunoproteasoma (PSMD1,

PSMB8, PSME2, IP11s regulator, 26S proteasome, 20S core, HSP90), o annoverano molecole


10

e recettori coinvolti nel processamento e nella presentazione antigenica, come molte molecole

classiche e non dell’HLA di classe I e II (HLA-DMA, HLA-DRA, CD74, B2M, TAP1, TAP2, HLA

class I). Inoltre la deregolazione dei geni dell’HLA di classe seconda (HLA-DP e HLA-DR) è

stata validata in vivo, monitorando l’upregolazione della loro espressione sulle cellule

leucemiche in seguito a trattamento con linfociti T (Fig. 7C). In particolare tali esperimenti

mostrano come l’upregolazione di queste molecole sia concomitante alla pressione

immunologica. Queste osservazioni mostrano come in seguito all’interazione coi linfociti T infusi,

le cellule leucemiche vadano incontro ad una perturbazione specifica del loro profilo di

espressione genica deregolando processi implicati nel riconoscimento immune.

20

0

-20

-20

0

20

-20

0

20

40PC1

PC3

PC2

Leukemic cells treated in vivo with Autologous T cells

Leukemic cells treated in vivo with HLA-Identical T cells

In vivo untreated leukemic cells

Primary AML• Immune response: IFN alfa/beta signaling

pathway

• Development: transcriptional regulation of granulocytes development

• Immune response: antigen presentation by MHC class I

• Cytoskeleton remodeling

• Immune response: Oncostatin M signaling via MAPK in human cells

Top deregulated processes

A B

C

no T cellsAutologous T cellsMatched T cellsHaploidentical T cellsMissmatched T cells

In vivo treated with:

AML#8

0 10 20 30 400

25

50

75

100

HLA-ABC

Days after DLI

%H

LA-A

BC+ /

CD

33+ c

ells

0 10 20 30 400

25

50

75

100

HLA-DR

Days after DLI

%H

LA-D

R+ /

CD

33+ c

ells

AML#1

AML#1

0 10 20 30 400

25

50

75

100

HLA-DP

Days after DLI

%H

LA-D

P+ / C

D33

+ cel

ls no T cellsAutologous T cellsMatched T cellsHaploidentical T cellsMissmatched T cells

In vivo treated with:

Figura 7. Profilo di espressione genica delle leucemie sottoposte in vivo alla pressione immune mediata dai linfociti T. (A) Analisi della varianza genica del trascrittoma della leucemia primaria AML#1 (nero) e delle cellule purificate dopo l’attecchimento nei topi in assenza della pressione immune (giallo) o in presenza della pressione immune mediata da linfociti T autologhi (verde) o HLA-identici (blu). La pressione immunologica infusa in vivo determina una perturbazione del profilo di espressione genica. (B) Analisi dei processi deregolati in seguito all’infusione dei linfociti T. Il profilo di espressione genica di cellule leucemiche trattate in vivo con pressione immune autologa o HLA-identica è stato confrontato con quello di cellule leucemiche purificate da topi non trattati. I cinque processi maggiormente deregolati nei topi trattati sono mostrati nel grafico. Tali processi deregolati sono prevalentemente implicati nel riconoscimento immunologico (evidenziati in rosso). (C) Andamento dell’espressione dell’HLA di classe prima (HLA-ABC) e di classe seconda (HLA-DR e HLA-DP) rilevata sulle cellule leucemiche attecchite in topi non trattati (giallo) o trattati con linfociti T provenienti da donatore autologo (verde), da donatore non familiare compatibile (viola) o da donatore scorrelato (rosso). I dati mostrano una upregolazione delle molecole di HLA di classe II sulla superficie delle cellule leucemiche in seguito all’infusione di linfociti (giorno 0).


11

Conclusioni e prospettive future

Nel corso del progetto abbiamo sviluppato e messo a punto un modello murino umanizzato

con lo scopo di caratterizzare i fattori prognostici molecolari nell’ambito della leucemia mieloide

acuta. I risultati ottenuti dimostrano che l’attecchimento delle AML in topi immunodeficienti

costituisce una proprietà che correla con una prognosi infausta: lo studio delle variabili che

influenzano tale proprietà ha così permesso di definire come la co-presenza di mutazioni nei

geni più frequentemente colpiti nell’ambito delle leucemie mieloidi acute (DNMT3A, NMP1 e

FLT3) si associ ad un elevata capacità di attecchire negli animali testati. In linea con queste

osservazioni, altri lavori hanno riportato un effetto sfavorevole della co-presenza di tali

mutazioni sulla prognosi dei pazienti (Dohner et al, ASH 2015). Confrontando il profilo

trascrizionale di AML in grado o meno di generare xenotrapianti abbiamo individuare un set di

geni deregolato nelle cellule leucemiche in grado di attecchire nei topi. Tale gruppo di geni

potrebbe permettere di stratificare i pazienti in gruppi con differente prognosi: questa ipotesi

verrà valutata successivamente prendendo in considerazione database pubblici e analizzando

come la deregolazioni dei geni da noi identificati sia un grado di stratificare l’outcome dei

pazienti. Inoltre verranno validati e studiati in dettaglio i geni che maggiormente definiscono

questa “signature” specifica: tale studio potrebbe costituire la base per lo sviluppo di nuove

strategie terapeutiche volte a colpire i geni deregolati nelle leucemie associati ad un fenotipo più

aggressivo.

La studio delle leucemie attecchite nei topi ha permesso di dimostrare come le caratteristiche

principali delle cellule leucemiche umane rimangano inalterate nei topi immunodeficienti e come

tutti i parametri osservati (crescita delle cellule e profilo trascrizionale) siano riproducibili: ciò ci

ha permesso di sfruttare questo modello per determinare il potenziale antileucemico dei linfociti

T e per studiare come la pressione immunologica da essi esercitata vada a scolpire il profilo

delle cellule leucemiche. Il modello umanizzato messo a punto in un contesto privo di fattori

confondenti (quali l’immunosoppressione e le reazioni avverse di GvHD), ha permesso di

evidenziare come il potenziale leucemico dei linfociti T sia proporzionale alla disparità HLA tra

donatore e leucemia. La pressione immune, inoltre, determina una perturbazione specifica del

profilo trascrizionale delle cellule leucemiche che è basato sulla deregolazione di processi

immuni fondamentali quali il processamento e la presentazione antigenica. Inoltre in diversi casi

sperimentali abbiamo documentato la capacità di alcune rare cellule leucemiche di persistere in

presenza della pressione immune. Il nostro modello permette di studiare a fondo come la

pressione immunologica allogenica sia in grado di eliminare la malattia e come alcune cellule


12

leucemiche siano in grado di persistere in sua presenza. Nel corso degli esperimenti non

abbiamo però identificato delle varianti leucemiche in grado di acquisire una resistenza

permanente e capaci di evadere il controllo del sistema immune. Ciò potrebbe essere dato dalla

scarsa eterogeneità clonale delle leucemie attecchite nei topi e da una pressione immunologica

troppo forte mediata dai linfociti T infusi. A tal proposito sono già state identificate delle modalità

sia per indurre instabilità genetica nelle cellule leucemiche, favorendo così l’insorgere di cloni

immunoresistenti, sia per controllare la reattività della pressione immune somministrata. In

particolare le cellule leucemiche possono essere modificate con vettori lentivirali genotossici in

grado di indurre instabilità genetica ed espressione aberrante dei geni colpiti (Cesana et al, Mol

Ther 2014). Abbiamo verificato che vettori lentivirali contenenti un gene reporter (GFP) siano in

grado si essere trasdurre efficientemente le leucemie testate e che tale processo non influenzi

la capacità di attecchimento e di crescita delle cellule in vivo (Fig. 8). Applicando una pressione

immunologica su tali cellule leucemiche si potrebbero identificare delle varianti leucemiche

capaci di eludere la risposta immune; inoltre, analizzando dove il vettore virale genotossico si è

inserito nel DNA delle cellule leucemiche, è possibile identificare i geni deregolati, e quindi

coinvolti nell’evasione dalla pressione mediata dai linfociti T. Al tempo stesso verranno valutate

delle modalità con cui controllare la forza della reazione linfocitaria: in tal caso la

somministrazione di agenti immunosoppressivi selettivi per i linfociti T potrebbe costituire una

valida opzione per attenuare la crescita delle cellule antileucemiche. Inoltre i linfociti T possono

essere ingegnerizzati con geni suicidi, la cui attivazione permette di eliminare in maniera

selettiva le cellule, controllando così la loro reattività. Questi approcci verranno valutati e messi

a punti nel corso del progetto, con l’obiettivo di identificare nel nostro modello umanizzato eventi

di immunoevasione. La caratterizzazione molecolare e biologica di tali fenomeni potrà

consentire lo studio, in un sistema controllato, dei processi indispensabili per acquisire la

capacità di eludere il controllo del sistema immunitario.


13

0

20

40

60

80

100

% o

f GFP

+ ce

lls / l

euke

mic

cel

ls

Blood Spleen BM0

20

40

60

80

100

% o

f GFP

+ ce

lls / l

euke

mic

cel

ls

Blood Spleen BM

Spleen BM0

1

2

3

4

5

6

VCN

Spleen BM0

1

2

3

4

5

6

VCN

AML#1 AML#16

0 25 50 75 1000

200

400

600

800

1000

2000

4000

6000

8000


leuk

emic

cel

ls / μ

L

0 25 50 75 1000

200

400

600

800

1000

2000

4000

6000

8000


leuk

emic

cel

ls / μ

L

AML#1 AML#16A

B

CFigura 8. Trasduzione e attecchimento delle cellule leucemiche in topi NSG. (A) Crescita delle cellule leucemiche trasdotte con un vettore lentivirale (verde) o non trasdotte (blu) in seguito alla loro infusione in topi NSG. I dati mostrano che il processo di trasduzione non va ad inficiare la crescita delle due AML testate. (B) Percentuale di cellule trasdotte (GFP positive) rilevata su sangue periferico, nella milza e nel midollo osseo degli animali che hanno ricevuto cellule leucemiche trasdotte (verde) o non trasdotte (blu). (C) Quantità di vettore integrato nelle cellule trasdotte ed isolate dalla milza o dal midollo osseo degli animali. I dati mostrano come le cellule leucemiche isolate dai topi possano essere trasdotte con una buona efficienza con vettori lentivirali per poi essere infuse ed espanse in topi immunodeficenti.

AML#1 AML#16

Messa a punto di un innovativo modello murino umanizzato...

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