FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI

1: I dentificazione, isolamento e clonaggio genecodificante per proteina bersaglio

2: espressione in sistema eterologo

3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type(stabilità termodinamica e cinetica)

4: progettazione, produzione e caratterizzazione versionimutate

(⇔ BIOINFORMATICA)

(⇔ BIOINFORMATICA)

(⇔ FOLDING)

ISOLAMENTO DEL GENE

ANALISI DI REPERTORI MOLECOLARI (gene o cDNA)

Isolamento per omologia (clone di topo per ottenere cDNA umano)Genetica inversa (dalla proteina al gene)Isolamento in base alla posizione genomica (informazioni genetiche)Anticorpo (libreria di espressione)

CLONAGGIO DIRETTOPCR (geni procariotici o cDNA)

SINTESI EX-NOVOOligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)

Le caratteristiche di una libreria di cloni idealeCompleta – Almeno un clone per mRNA

Ben classificabile – Possibilità di formare sottogruppi

Flessibile – Cloni trasferibili in altri vettori velocemente

Esprimibile – I cloni devono essere completi e pronti per l’inserzione disequenze aggiuntive utili

Ad alta qualità – Tutti I cloni sequenziati

Economicamente accessibile –

www.invitrogen.com mgc.nci.nih.govhttp://www.geneservice.co.uk/products/image/index.jsp

Disponibilità commerciale e informazioni

La completezza delle librerie è condizionata dalledimensioni degli inserti

N = [ln (1-P)]/[ln (1-f)]P – probabilità di completezzaN – numero di cloni richiestif – proporzione di genoma nel singolo clone

N = [ln .01]/[ln 0.99999886] = -4.6/-1.14 x 10-7

= 40,350,877 cloni

Genoma umano - plasmidi (max 5Kb)

P – 99%f – 5 kb/4,400,000 kb = 1.14 x 10-6

Batteriofagi (40kB)= 578, 616 cloni

YACs(500kB) = 40,350 cloni

Libreria digeni umani

Cloni su filtro

Sonda costruita su genedi topo

Positivi sonoomologhi al gene di topo

ISOLAMENTO PER OMOLOGIA

MOLTI METODI DI CLONAGGIO (e altro) SONO BASATI SULL’USO DELLA PCR

….e i primers? Si scrivono sempre 5’->3’ Primer sense (forward) = filamento codificante -> 5’-ATG………-3’Primer antisense (reverse) = reverse complement -> 5’-TTA……-3’

ATG TAA

PCR Primers: ALCUNE REGOLE DA RICORDARE.....1. Primer Length: Lunghezza ottimale 18-22 bp. Assicura specificità e facilità di legame.

2. Melting Temperature: è la temperatura a cui la metà di un duplex si denatura dando unsingle strand. Tm= 52-58 oC danno risultati ottimali; primers con Tm più elevate (>65°C) tendonoa formare strutture secondarie.

Formula per calcolo Tm (rigorosa e basata su la valutazione per coppie di basi delle interazioni):

FORMULE SEMPLIFICATE

1. Più corti di 18 basi

Tm= 4°C  x  (G +C) + 2°C  x  (A + T)

2. Più lunghi di 18 basi

Tm =  64.9°C + 41°C x [(G+C) – 16.4]/N

3. Tiene conto dell’effetto dei sali (Primer 3 program e altri)

Tm =  81.5°C  +  16.6°C  x  (log10[Na+] + [K+])  +  0.41°C  x  (%GC)  –  675/N

3. Calcolo del peso molecolare (accurato):

MW = (329.2 * G) + (313.2 * A) + (304.2 * T) + (289.2 * C) 

Correzioni:

-78 per il 5' phosphate group (PO3) sostituito da un idrogeno (primers defosforilati)

+17 per il 3’ OH .

4.Primer annealing temperature : Stima della stabilità dell’ibrido DNA-DNA.

Ta troppo elevata: primer-template hybridization insufficiente: resa bassa prodotto PCR.

Ta troppo bassa: prodotti aspecifici per la presenza di mismatches

Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (prodotto) – 14.9

Dove Tm(primer) = Melting Temperature dei primers

Tm(product) = Melting temperature del prodotto di PCR

5. GC Content : (numero di G e C nel primer come % basi totali) dovrebbe essere 40-60%.

6. GC Clamp : La presenza di basi G o C nelle ultime 5 basi al 3’ dei primer ha un effetto positivo(meglio non più di tre).

7. Strutture secondarie : La presenza di strutture secondarie abbassa la resa in prodottoinfluenzando il processo di annealing primer-templato. Riduce la concentrazione effettiva deiprimers.

Hairpin : Intramolecolare nel primer. Sono tollerati: 3' -hairpin con DeltaG di -2 kcal/mol ehairpin interni con DeltaG di -3 kcal/mol

Self Dimer : Intermolecolari tra primer omologhi. Sono tollerati: 3' - self dimer con DeltaG di -5kcal/mol e self dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.

Cross Dimer : Intermolecolari tra primer senso e antisenso. Sono tollerati: 3' - cross dimer conDeltaG di -5 kcal/mol e cross dimer interni con DeltaG di -6 kcal/mol.

8. Repeats : ripetizioni consecutive di due nucleotidi: possono dare errori di innesco.

Sono tollerati massimo 4 dinucleotidi

9. Runs : sequenze formate dallo stesso nucleotide: possono dare errori di innesco.

Esempio: AGCGGGGGATGGGG.

Sono tollerati runs di massimo 4 nucleotidi.

10. 3' End Stability : è il valore massimo del deltaG delle 5 basi al 3’. Non dovrebbe esseremolto negativo.

11. Evitare le zone in cui nel templato sono presenti strutture secondarie.

12. Evitare le regioni di cross-omologia tra geni presenti nella miscela di reazione.

ACUNI SITI ONLINE PER IL DISEGNO DI PRIMERS

PRIMER3

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

CloningSequencingPrimer_List

Primer_Check

Differential PrimersPCR primer design per:•Gene-specific primers (per multi-gene families)

-identificare specie o ceppi specifici -diagnostica molecolare•Consensus primers amplificare geni appartenenti a una famiglia digeni

BISOGNA LAVORARE SU ALLINEAMENTI MULTIPLI E TROVAREZONE CONSERVATE O MENO (CONSENSUS O SPECIFICHE)

Primer 3 at the MIT Whitehead Institutehttp://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

GeneFisher by Folker Meyer & Chris Schleiermacherat Bielefeld University, Germanyhttp://bibiserv.TechFak.Uni-Bielefeld.DE/genefisher2/

GENETICA INVERSA

1. La sequenza della proteina è nota e si può dedurre una sequenza genica (o proteine omologhe)

NH3+-Met-Asp-Gly--------------Trp-Ser-Lys-COO-

5’-ATG-GAT-GCT TGG-AGT-AAA-3’ C C C G A TCT G C A G

2. Si possono progettare primers degenerati

Forward primer: 5’-ATGGAT/CGCN-3’ (sense)Reverse primer: 5’-T/CTTNC/GT/ACCA-3’ (antisense)

Note: T/C = miscela di T e C; N = miscela di 4 nucleotidi (anche dInosina)NB La degenerazione diminuisce la concentrazione effettiva del singolo primer(nell’esempio: sense= 1/4x1/2=1/8 ; antisense= 1/4x(1/2)3=1/32)Evitare degenerazioni maggiori di 1/512…..

Libreria

Cloni su filtro

Sonda = frammento di PCR

Positivi sono il gene umano di interesse

4. Si analizza una libreria di cloni

3. Si amplifica il frammento di gene mediante PCR

ISOLAMENTO DIRETTO DA MATERIALE GENETICO

Fonti di materiale genetico di vario tipoMicrorganismi, Virus vegetali, Linee cellulari animali ed umaneSITO : www.dsmz.de

PCR su stampi a sequenza nota (genomi caratterizzati)

SINTESI EX-NOVO

Oligonucleotidi sintetici (geni di piccole dimensioni)

www.genscript.com < 1.5 USD/bp (da 1800 USD espressione)www.geneart.com < 1 euro/bp

Polimerasi ad alta fedeltà

Taq polimerasi (dal termofilo Thermus aquaticus)= 94 kDa con 2 attività cataliticheA) 5’⇒3’ DNA polymerase (50-60 nucleotidi/sec)B) 5’ ⇒ 3’ esonucleasi (rimuove nucleotidi al 5’)Versioni ricombinanti di Taq

Manca la attività 3’ ⇒ 5’ esonucleasiFrequenza di errore: 1 per 104 nucleotidi per un frammento di 400 bp amplificato per 106 volte(=20 cicli) : 33% mutati

Polimerasi ad alta fedeltà(= con attività 3’ ⇒ 5’ esonucleasi)Riconosce se il nucleotide al 3’ si appaia con il templato.A volte taglia anche i nucleotidi non appaiati al 3’ del primer (‘nibbling’)Aumento di fedeltà 5-12 volteVent®, DeepVent®, Tli (Thermoccocus litoralis),Pfu (Pyrococcus furiosus)Blunt ends invece che overhangs(Si può fare ultimo ciclo con Taq per TA cloning)

I METODI DI CLONAGGIO SONO DI GRANDE IMPORTANZASIA NELL’ISOLAMENTO E PRODUZIONE DELLA PROTEINA WILD TYPE

CHE NELLA PRODUZIONE DI MUTANTI

-NECESSITA’ DI LAVORARE CON UN NUMERO ELEVATO DI CLONIIN TEMPI SPERIMENTALI RAGIONEVOLI

SONO STATE SVILUPPATE NUOVE TECNOLOGIE DI CLONAGGIO RAPIDO

• Strategia comune per clonare invettori diversi

• Singola reazione di breve durata• Alta resa (HTP)• Efficienza quasi 100%• No mutazioni

Approccio per ricombinazione

CLONAGGI: Approccio tradizionale(ligasi)

SISTEMI GATEWAY E TOPO (Invitrogen)

Integrase (Int)Host Integration Factor (IHF)

Int+IHF+ Excisionase (Xis)

Il sistema Gatewaysi basa sul processo di ricombinazione tra fago lambda ed E. coli

ccdB gene= gene killer: interferisce con l’attività della DNA girasi causando morte cellulare (plasmide F con ccdA=antidoto)

Il principio Gateway: le reazioni LR e BP

La LR clonasi comprende le attivitàInt, IHF e Xis

(= excisione di lambda)

Il costrutto di espressione:-ha selezione positiva (Apr)- non ha selezione negativa (ccdB)

La procedura sperimentale è semplice

IL VETTORE DI INGRESSO PUO’ ESSERE COSTRUITO CON STRATEGIE DIVERSE

1. Restrizione e clonaggio in vettore Gateway attL

2. PCR con primers attB(>20-25 basi extra) eclonaggio in vettore Gateway attP

3. Libreria di clonaggio

4. Libreria di espressione

QUALSIASI VETTORE PUÒ DIVENTARE VETTORE DI DESTINAZIONE

Deve essere replicato in un ceppo con una mutazione nellaDNA girasi (gyrA462) (DB3.1™)

I vettori di destinazione possono avere caratteristiche diverse a seconda dello scopo dell’esperimento

3 giorni:6 prodotti di fusionee loro espressione

……e i tempi?

Il sistema TOPO si basa sulla attività della topoisomerasi I

1. Si lega covalentemente al gruppo fosfato di una sequenza specifica2. Svolge il DNA3. Riforma il legame covalente (attività = ligasi)

1 (TOPO) La topoisomerasi è covalentemente legata ad un gruppo fosfato presentealle estremità del vettore di clonaggio2 (TOPO) L’inserto ha una estremità 3’ che si allinea al vettore3 (TOPO) L’enzima forma il legame covalente (attività = ligasi) e poi si stacca

Il sistema TOPO può essere trasformato in sistema di clonaggioad alta resa (High-Throughput,HT) se nella singola provetta sono presenti

molte reazioni (es. 500)

Il metodo di clonaggio è molto veloce

I sistemiGateway e TOPOpossono essere

combinati

I vantaggi di questi sistemi sono molteplici:1. i tempi sperimentali si abbreviano

Si possono progettare esperimentiHTP (High-throughput)

E.coliE.coli expression screenings (1) expression screenings (1)

Expression screening (normalized)with auto-inducing medium in 24well plate followed by anti-His Dot-Blot and Ni affinity purificationwith 96-well filter plate

Freedom Tecan robotTotal Soluble

Total expression (mg/L of culture) Soluble Fraction (mg/L of culture)0.27 3.34 0.48 3.78 11.94 0.60 1.51 0.04 2.85 0.270.04 3.38 0.18 2.50 1.50 0.14 3.93 0.26 4.99 0.091.31 10.09 0.34 13.87 1.30 1.38 0.82 0.19 0.46 0.131.00 0.75 0.55 2.73 0.82 1.22 1.20 0.46 7.88 0.258.20 24.56 0.83 7.77 51.64 1.58 25.00 1.35 16.97 2.619.64 1.65 12.10 20.31 21.94 1.24 1.34 0.33 1.57 8.4222.37 18.75 6.13 12.87 19.40 1.53 0.23 0.02 0.54 15.380.61 10.87 6.74 9.65 3.22 0.17 0.08 -0.02 0.77 1.23

No expression Soluble < 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble

No expression Soluble > 2mg/L No expression Soluble > 2mg/L Not Soluble

Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L No expression Not Soluble Not Soluble

Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble > 2mg/L Not Soluble

Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L Soluble > 2mg/L

Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L

Soluble < 2mg/L Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble > 2mg/L

Not Soluble Not Soluble Not Soluble Soluble < 2mg/L Soluble < 2mg/L

Fully automated expression screening: 8 hours for 160 culturesFully automated expression screening: 8 hours for 160 cultures

reference scale

• 3 classes:-soluble-partially soluble-not soluble

Vincentelli R et al. (2005) Anal. Bioch.for 1-4 mL cultures

Si possono ottenere moltepliciinformazioni sulla stessa proteina

2

–

–

+

X

c

1167121

––––+–+

–––––––

–––––––

LCZYABA

nccpncnLocalizzazione

Interazioni

Saggio funz #1

Saggio funz #2

Saggio funz #3

Purificazione