ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI

Isolamento di DNA ed RNA da un tessuto o da cellule eucariotiche o procariotiche

E’ quindi possibile estrarre acidi nucleici da varie fonti

- Procarioti - Eucarioti (tessuti animali, tessuti vegetali) - Virus - Organelli (mitocondri e cloroplasti), - Liquidi biologici

-Organo intero, tessuto, colture cellulari, sangue - foglie, radici, semi

ISOLAMENTO ACIDI NUCLEICI

Tipo di acido nucleico: ssDNA, ds DNA, RNA totale, mRNA rRNA, tRNA

Risultato desiderato: quantità, purezza, tempo richiesto

Applicazione: - Digestione con ER - Clonaggio, - Marcatura - Ibridazione - PCR ecc

METODO DI ESTRAZIONE TRADIZIONALE

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE

Inizialmente tutte le particelle dell’omogenato sono distribuite

uniformemente nel tubo da centrifuga

Centrifughe successive, variando i tempi e velocità di centrifugazione si possono

separare particelle che differiscono in dimensione e

densità

separazione sovranatante da pellet

L’estrazione di acidi nucleici dai vari materiali biologici procede in diverse fasi

1- Rottura e lisi cellulare 2- Allontanamento delle membrane 3- Allontanamento lipidi, proteine e carboidrati (Estrazione

fenolica) 4- Estrazione eterea (per allontanare il fenolo) 5- Allontanamento e distruzione di DNA o RNA (facoltativo) 6- Precipitazione alcoolica e purificazione A.N. 7- Dosaggio.

1- ROTTURA DELLE CELLULE

Metodi meccanici: omogeneizzatore a pestello (potter). Vibrazioni ultrasoniche Congelamento/scongelamento Scoppio delle cellule per shock osmotico Agenti litici responsabili della lisi cellulare

Metodi di lisi cellulare

Tecnica Applicazione Metodi non meccanici

Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali

Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri

Enzimi litici Cellule animali e vegetali

Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti

Sfere di vetro Batteri e funghi

Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali

Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati

Ultrasonicazione Microorganismi

La LISI CELLULARE può avvenire in due modalità:

1- Lisi blanda Triton e lisozima ( piccoli pori nella membrana).

Isolamento DNA plasmidiale mentre il DNA cromosomiale rimane attaccato alla membrana interna;

Detergenti anionici quali SDS (membrane Frantumate). Isolamento acidi nucleici totali (DNA

cromosomiale, mRNA, rRNA, tRNA ecc) . 2- Lisi spinta

2. ALLONTANAMENTO DELLE MEMBRANE

centrifugazione che permette la Separazione di due fasi

- una superiore (sopranatante) che contiene gli acidi nucleici in soluzione

- una inferiore (pellet) che comprende membrane e frammenti cellulari.

3. ALLONTANAMENTO PROTEINE

Sodio Dodecil Solfato (SDS).

Detergente anionico che si lega alle proteine alterandone la struttura secondaria e, se costituite da subunità, si dissociano

Enzimi proteolitici: pronasi e proteinasi K. PRONASI: miscela di almeno 4 enzimi proteolitici, di cui due endopeptidasi (serina- e metallo-proteasi) e due esopeptidasi (carbossi e ammino-petidasi). PROTEINASI K: endopeptidasi aspecifica molto attiva.

Cloroformio-alcool isoamilico. Le proteine formeranno un gel all’interfase cloroformio-acqua, mentre gli acidi nucleici rimangono in soluzione

3. ALLONTANAMENTO PROTEINE

FENOLO

IL FENOLO si lega al core delle proteine causando denaturazione

- DNA si usa fenolo a pH basico (che inibisce le DNAsi).

- RNA si utilizza fenolo a pH acido (che inibisce le RNAsi) .

Si aggiunge un egual volume di fenolo al sopranatante che diventa lattescente dopo agitazione. Quindi si centrifuga.

Dopo centrifugazione si ottengono tre fasi:

1)  superiore che contiene la soluzione di acidi nucleici;

2) interfase di proteine denaturate; 3) inferiore fase fenolica contenente lipidi e proteine ricche

di aminoacidi idrofobici

4. ESTRAZIONE ETEREA

Trattamento surnatante con etere per allontanare eventuali residui di fenolo

Dopo centrifugazione l'etere localizzato nella parte superiore del tubo viene allontanato.

La soluzione risultante costituisce la miscela di acidi nucleici.

5. ALLONTANAMENTO DI DNA O RNA

E' possibile a questo punto eliminare uno dei due componenti: RNA previo trattamento con ribonucleasi (RNAsi) DNA con l'uso di desossiribonucleasi (DNAsi)

La RNAsi viene usata per eliminare l’RNA in preparazioni di DNA; la DNAsi viene usata per eliminare il DNA che contamina le preparazioni di RNA

6. PURIFICAZIONE A.N.

La fase finale dell'estrazione è costituita dalla precipitazione alcolica

DNA è miscelato con 2 volumi di etanolo assoluto, in presenza di cationi monovalenti e viene lasciata precipitare a –80°C.

Tale precipitazione è fortemente dipendente dal raggiungimento di una massa critica. Per soluzioni a concentrazioni <10µg/ml è opportuno

aggiungere un carrier: t-RNA di lievito.

LAVAGGIO DEL PELLET

Dopo centrifugazione, i pellet di DNA vanno lavati in etanolo 70° e ricentrifugati. Tale lavaggio allontana i sali, insolubili in tale solvente, ma non è in grado di allontanare il cloruro di sodio

RISOSPENSIONE DELL’A.N

Il pellet dopo essiccazione, viene risospeso in un tampone a bassa forza ionica, in genere TE (Tris-EDTA) a pH 7.6 - 8.0

L'acido nucleico può quindi essere dosato ed essere utilizzato per ulteriori procedure quali digestione con

endonucleasi di restrizione, marcatura

DOSAGGIO DELL’A.N

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’ • Questa tecnica sfrutta un gradiente di densità del mezzo per separare le particelle : • ZONALE (centrifugazione in base alle dimensioni delle particelle es: ribosomi) • ISOPICNICA (centrifugazione in base alla densità delle particelle es:DNA) • Il gradiente di densità del mezzo aumenta dall'alto verso il fondo del tubo. • Substrati maggiormente utilizzati sono il Saccarosio o metalli pesanti (Cloruro di cesio o di litio)

TIPI DI GRADIENTE

• DISCONTINUI la densità del mezzo cresce dall’alto verso il basso in maniera discontinua attraverso una serie di soluzioni di differente densità che vengono stratificate l’una sull’altra.

• CONTINUI quando la densità del mezzo cresce continuamente lungo il tubo da centrifuga

UTILIZZO DEI KIT (in soluzione o su colonna di silice)

Sistemi di Isolamento e separazione degli acidi nucleici disponibili in commercio

•  I Kit per l’estrazione degli acidi nucleici hanno il vantaggio di fornire reagenti standardizzati e di qualità garantita dando così un elevato grado di affidabilità

•  L’Estrazione automatizzata mediante strumenti consente di estrarre il DNA senza alcun intervento manuale (circa 45’)

KIT DI PURIFICAZIONE

Molti prodotti commerciali garantiscono facilità d’uso riproducibilità ed elevato livello di purificazione. Si basano

essenzialmente sull’utilizzo di

.Kit per estrazione in soluzione •Resine a scambio ionico (scambiatori anionici come la DEAE cellulosa) •Matrici silicee •Gel filtration •Ultrafiltrazione

scambiaredamolecolacontroioneescambiator

OOCR'Cl........NR4 +−+

scambiatoionelegatomolecolareione

−+

+ ClOOCR'....NR 4

Matrici silicee

Legame acidi nucleici e particelle della matrice in presenza di sali caotropici, (tiocianato della guanidina GuSCN) .

NO legame a sostanze contaminanti

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

Lavaggi ed eluizione degli acidi nucleici con tamponi a basso contenuto in sali

Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi principali dell’estrazione di DNA da cellule o tessuti

DNA Omegenizzazione di cellule/tessuti 4°C

Lisi cellulare:detergenti/lisozima

Agenti chelanti: EDTA/citrato

Agenti proteinasici:proteinasi K

Lisi parete

Estrazione con fenolo e fenolo/cloroformio

Purificazione

Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 %

Risospensione del DNA: Tampone TE (Tris -EDTA pH 8)

Conservazione del DNA: 4 / -20 / -80 °C

DNasi (ioni metallici) sono termolabili, facilmente inattivate da agenti chelanti e dalla sterilizzazione in autoclave RNasi (no cofattori) resistono a trattamenti drastici (ebollizione prolungata, sterilizzazione in autoclave) e sono attive entro un ampio range di pH.

ESTRAZIONE DELL’RNA

Vincere la battaglia con le RNasi

Fonti di RNasi in laboratorio

Tamponi e soluzioni di uso comune

Presenza di batteri o altri microrganismi che rilasciano i loro enzimi; autoclavarli NON inattiva le RNasi, anzi può introdurle nei reagenti.

lavorare senza guanti può introdurre nelle soluzioni RNasi batteriche e cellulari

batteri veicolati dall’aria possono sedimentare sulla superficie delle soluzioni, portando con sè RNasi

Pipette Mai utilizzare le stesse pipette che hanno già dispensato soluzioni di RNasi

E’ importante quindi

Dividere le soluzioni in piccole aliquote Utilizzare plastica garantita RNasi-free Trattare la vetreria per almeno 4 ore a 200°C

Indossare sempre guanti e cambiarli spesso

Mantenere un’area di lavoro separata, dedicata all’RNA

Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi

Potenti agenti denaturanti •  Sali di guanidinio (guanidinio cloruro, guanidinio tiocianato) •  2-mercaptoetanolo

•  Temperatura (Ghiaccio)

Sostanze deproteineizzanti

fenolo, cloroformio, SDS, proteinasi K

RNase inhibitor Proteine che legano covalentemente le RNasi inibendo il 90% dell’attività. Legame reversibile (inibitore mantenuto attivo)

soluzioni contenenti agenti fortemente denaturanti, come SDS o urea, mantenendo un ambiente riducente e la temperatura < 65°C.

EVITARE

Composti contenenti gruppi amminici primari, come il Tris reagiscono con il DEPC; di conseguenza, le soluzioni devono essere preparate sciogliendo il Tris in acqua DEPC già trattata ed autoclavata.

Come proteggere l’RNA dalla degradazione da parte delle RNasi

DEPC (dietilpirocarbonato): agente alchilante che reagisce con le proteine attaccando gli azoti imidazolici dei residui istidinici, con perdita dell’attività enzimatica

Inattivazione RNasi alla conc. dello 0,1% INATTIVAZIONE IN AUTOCLAVE

ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE Metodo del fenolo acido-guanidina tiocianato

Si procede quindi alla precipitazione alcolica in presenza di cloruro

di litio, ammonio acetato o sodio acetato

PRINCIPIO il DNA passa nella fase organica se il fenolo è tamponato con una soluzione a pH acido 5-6, mentre l’RNA rimane

nella fase acquosa

metodo non adatto per gli mRNA batterici

ISOLAMENTO DELL’mRNA

mRNA eucariotici presentano la coda di poliA all’estremità 3’.

Ibridazione con sequenze sintetiche di oligo(dT)

• La preparazione di RNA totale è fatta passare attraverso una colonna costituita da un polimero ricoperto con oligo(dT).

• Solo l’mRNA polidanilato ibriderà con l’oligo(dT), mentre le altre specie verranno eliminate mediante lavaggi con tamponi a bassa concentrazione salina.

• L’eluato finale sarà costituito dalla miscela di tutte le specie di mRNA presenti nella cellula al momento dell’estrazione.

ISOLAMENTO DELL’mRNA

Isolamento e separazione degli acidi nucleici: passaggi principali dell’estrazione di RNA da cellule o tessuti

RNA Trattamento dei reagenti con inibitori delle RNAsi (DEPC DietilPiroCarbonato)

Omegenizzazione di cellule/tessuti 4°C

Lisi cellulare: detergenti/lisozima

Agenti proteinasici:proteinasi K

Lisi parete

Estrazione con fenolo e fenolo/cloroformio Purificazione

Precipitazione con etanolo al 100 % e lavaggio al 70 %

Risospensione e conservazione dell’RNA a -80°C

Solventi per RNA: Guanidina tiocianato

E' possibile dosare gli acidi nucleici con: 1)  Metodo Spettrofotometrico (spettroscopia nell’ultravioletto)

2) Metodo Fluorimetrico 3) Metodo Colorimetrico (spettroscopia nel visibile)

Dosaggio degli acidi nucleici

acidi nucleici assorbono la luce UV con un massimo alla lunghezza d'onda di 260 nm.

METODO SPETTROFOTOMETRICO

Tale assorbimento è determinato dalle basi azotate, per cui è caratteristico del DNA a doppio e singolo filamento e dell’RNA.

la frazione della luce incidente che viene assorbita da una soluzione ad una determinata λ è proporzionale a: -concentrazione della specie assorbente -spessore della soluzione (cammino ottico) determinazione assoluta, che si basa sulla relazione esistente tra concentrazione e assorbanza.

Log I0/I = ε c λ

I0 è l’intensità della luce incidente I : intensità della luce trasmessa ε :coefficiente di estinzione molare (l’assorbanza di una soluzione 1M della sostanza in esame quando viene letta in una cuvetta con percorso ottico uguale ad 1 cm, ad una determinata lunghezza d’onda) c : concentrazione della specie assorbente (moli/l) λ : percorso ottico (cm)

LEGGE DI LAMBERT-BEER

L’espressione Log I0/I viene detta assorbanza (A) o densità ottica (OD).

Coefficiente di estinzione specifico K, anziché il coefficiente di estinzione molare

L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione del soluto che sta assorbendo la luce

c = A/ ε λ Se λ = 1 cm c = A /ε

Il coefficiente di estinzione molare ε dipende da:

-la natura chimica del composto -il solvente -la lunghezza d’onda

Il coefficiente di estinzione molare ε rappresenta l’assorbanza di una soluzione a concentrazione 1M e a cammino ottico unitario

K esprime l’assorbanza di una soluzione a concentrazione 1mg/ml alla λ di 260 nm K = 21 per il DNA nativo a doppio filamento K = 23 per il DNA denaturato a singolo filamento K = 25 per l’RNA

Quindi: C (mg/ml) = A / K

Il coefficiente di estinzione molare degli acidi nucleici è la somma dei coefficienti di estinzione molare di ciascun nucleotide. È impossibile calcolare questa somma per tutti i nucleotidi, quindi è usato un coefficiente di estinzione molare medio che è: 50 (µg/ml)-1 cm-1 per il DNA a doppio filamento 40 (µg/ml)-1 cm-1 per l’ RNA Quindi: 1 A260 di DNA a doppio filamento = 50 µg/ml

1 A260 di RNA = 40 µg/ml

oppure

Preparazioni pure di DNA hanno valori di A260/A280 uguali a 1,8

Preparazioni pure di RNA hanno valori di A260/A280 uguali 2

DETERMINAZIONE DELLA PUREZZA

Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza della preparazione degli acidi nucleici

Assorbanza a 230 nm contaminazione del campione dovuta a carboidrati, fenoli, peptidi o composti aromatici

Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2

Il dosaggio fluorimetrico è un dosaggio di tipo RELATIVO.

• Quantità crescenti e a concentrazione nota di acido nucleico vengono caricate su un gel accanto al campione a concentrazione incognita.

• Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso in una soluzione di Etidio Bromuro che si intercala tra le basi d e l l ' a c i d o n u c l e i c o r e n d e n d o l o fluorescente alla luce UV.

la quantità di DNA nella banda del campione è stimata

confrontando la fluorescenza delle bande della serie standard

METODO FLUORIMETRICO

Concentrazione acidi nucleici stimata in base alla fluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro.

La quantità fluorescenza emessa da ciascuna banda

osservata, è proporzionale alla massa del DNA presente nella

banda stessa,

METODO COLORIMETRICO

Orcinolo per l’RNA

Difenilammina per il DNA

Formazione di complessi colorati di particolari sostanze con il ribosio o con il deossiribosio dello scheletro degli acidi nucleici

Valuta esattamente la quantità di DNA o RNA presenti in soluzione, anche se la soluzione contiene entrambi gli acidi nucleici.

L’intenso colore verde-azzurro, che si produce al termine della reazione, consente il dosaggio colorimetrico dell’RNA a 660 nm. Per il dosaggio, è necessario costruire una retta di taratura con

soluzioni di RNA a concentrazione nota e crescente.

Saggio con l’orcinolo per il dosaggio dell’RNA

Si basa sul dosaggio del ribosio attraverso la liberazione del furfurale che si ottiene per riscaldamento del ribosio in ambiente contenente acido cloridrico concentrato L’RNA in HCl concentrato, subisce dapprima depurinazione e successivamente i ribosi fosfati ottenuti defosforilati e deidratati per produrre furfurale. Quest’ultimo si condensa con l’orcinolo dando origine ad un complesso stabile e colorato.

Saggio con la difenilammina per il dosaggio del DNA

Si basa sul dosaggio del deossiribosio che, resosi libero in ambiente acido, viene convertito in ω−idrossilevulinilaldeide che con la difenilammina dà luogo ad una colorazione blu. Campioni contenenti DNA vengono incubati in acido perclorico. In queste condizioni il DNA è depurinato, viene rilasciato deossiribosio e convertito a ω- idrossilevulinilaldeide. Si legge l’Assorbanza a 750 nm e a 595nm. 595 nm = max assorbanza del complesso 750 nm si leggono le impurezze, per cui tale lettura va sottratta a quella a 595 nm.

Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

Analisi acidi nucleici

Analisi di acidi nucleici

• Elettroforesi su gel di agarosio

• Elettroforesi su gel di poliacrilammide

• Elettroforesi su gel a campo pulsato o PFGE (Pulsed-field Gel Electrophoresis)

Elettroforesi: separazione di molecole di RNA/DNA in base alla dimensione

Elettroforesi su gel di agarosio

Apparato elettroforetico

Elettroforesi su gel di agarosio

Effetto setaccio del gel di agarosio

L’agarosio è un polisaccaride costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L galattosio.

PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

Consente la separazioni di molecole di grandi dimensioni: 0.1 - 20 kb

Concentrazione di agarosio

0.8% : 0.5 – 20 kb 2% : 0.1 – 3 kb Risoluzione

Come si prepara un gel d’agarosio

Etidio Bromuro (EtBr):

colorante fluorescente assorbe la luce UV a 300 nm dando colore giallo-arancio E’ utile sia per visualizzare, sia per quantificare il campione: l’intensità della fluorescenza è, infatti, proporzionale alla quantità del campione

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

Loading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, Blu di bromofenolo e Blu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIO

Per frammenti lineari di DNA e/o RNA la distanza di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola (ovvero alla sua lunghezza in

basi)

Fattori che influenzano la migrazione

• Peso molecolare

• Concentrazione di agarosio

• Conformazione DNA

• Voltaggio applicato

• Intercalanti • Tampone di elettroforesi

Marcatori di peso molecolare

λ HindIII

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTI

Gli acidi nucleici a singolo filamento (come l’RNA) tendono a formare complesse strutture secondarie, pertanto la loro “corsa

elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano

DENATURAZIONE RNA

Agenti denaturanti comunemente usati:

ü  calore, ü  formaldeide, ü  formammide, ü  urea

SEPARAZIONE IN GEL D’AGAROSIO DI MOLECOLE DI RNA IN CONDIZIONI DENATURANTI

La denaturazione si ottiene “scottando” (90-95°C) il campione e aggiungendo formaldeide al gel.

Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene formaldeide e formammide

ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE)

Ø La PAGE in presenza di SDS (buffer) è il metodo di più largo impiego per l’analisi qualitativa di miscele di proteine

Ø Separazione di frammenti minori di 1 kb

Ø Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)

Formazione di un gel di poliacrilammide

ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDE (PAGE)

Spessore del gel 0,4-1,5 mm

Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore

dei pori. Esso inoltre contiene urea che funziona da denaturante

acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea Risoluzione: 20 - 1000 nucleotidi

SDS-PAGE

Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE)

Carica Massa

+3 30kD

-4 42kD

SDS Carica Massa

-300 30kD

-420 42kD

§ Le molecole di SDS si legano alle proteine § Le proteine perdono la loro normale forma § Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa § Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni

SDS-PAGE SDS (Sodio Dodecil Solfato)

• Solubilizza e denatura le proteine

• Aggiunge cariche negative alle proteine

O S O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDS

Proteina Nativa Carica netta: -4

Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

SDS-PAGE

Colorazione con Blu di Coomassie

acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

+

–

Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8

ü Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica

•  Inclusione di un marker di peso molecolare colorato •  10-50ug di estratto proteico totale •  0.1-1ug di proteina purificata

ü Ioni Cloruro (-) / Proteina/Glicina(+)

ü Si muovono verso il gel separatore (“resolving”)

•  Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore

Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda)

Coomassie staining Silver staining

VISUALIZZAZIONE DELLE PROTEINE NEL GEL

I due metodi piu’ usati sono:

ENZIMI DI RESTRIZIONE ED ANALISI RFLP

ENZIMI DI RESTRIZIONE enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze:

1.  Le esonucleasi (estremità libere)

2. Le endonucleasi (legami interni)

Endonucleasi Esonucleasi

Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali riconosce una sequenza particolare.

ENZIMI DI RESTRIZIONE

•  Enzimi batterici capaci di tagliare molecole di DNA in posizioni specifiche

•  Fenomeno della restrizione-modificazione controllata dalla cellula ospite

ANNI ’50: preparazione di batteriofagi cresciuta in E.coli non pienamente infettante per E.coli di un altro ceppo ANNI ’65: si scopre che il DNA fagico preparato in E.coli (c) è degradato una volta entrato nel ceppo K che restringe i fagi prodotti in E.coli (c).

10 anni dopo: nel fago resistente alla degradazione presenza di basi metilate

La degradazione del DNA del fago è dovuta all’esistenza di un sistema di restrizione modificazione controllato dalla cellula ospite

per proteggersi dall’introduzione di sequenze di DNA esogeno

SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE

Contengono due componenti:

-ENDONUCLEASI di restrizione: taglia il DNA a livello di una specifica sequenza (no metilazione).

-DNA metilasi: modifica mediante metilazione specifiche basi nella sequenza riconosciuta dall’endonucleasi di restrizione

E. coli degrada DNA esogeno Taglio in siti specifici

SISTEMA MODIFICAZIONE

Metilazione DNA endogeno

NO TAGLIO

ENZIMI DI RESTRIZIONE

1970 Isolamento enzima restrizione dal ceppo Rd del batterio Haemophilus influenziae (HindII)

5’- GT(T/C) (G/A)AC -3’ 3’- CA(A/G) (C/T)TG -5’

L’enzima non era in grado di tagliare il genoma di H. influenziae ma era capace di tagliare in oltre 40 punti il genoma del fago T7.

1972 Isolamento enzima di restrizione EcoRI dal ceppo RY13 di E. coli,

5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’

SISTEMA DI RESTRIZIONE-MODIFICAZIONE EcoRI

Sistemi di restrizione-modificazione

enzimi di classe I:

Restrizione e metilazione casuale nella stessa molecola lontano dai siti di riconoscimento

enzimi di classe II:

Restrizione e metilazione su molecole distinte, elevata specificità di taglio a livello o vicino al sito di

riconoscimento

enzimi di classe III

Restrizione e metilazione condividono una subunità comune, tagliano lontano dal sito di riconoscimento

(a 24-26 pb rispetto al sito di riconoscimento)

•Sequenza di taglio se ruotata è simmetrica (palindromo)

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II

5’- GAATTC -3’ 3’- CTTAAG -5’

•Il sito palindromico puo’ essere continuo o interrotto (es. BstII taglia la sequenza 5’GGNACC 3’).

•Sequenze lunghe 4, 6 o 8 pb •Nomenclatura: genere e specie del batterio dal cui è isolato l’enzima di restrizione:

EcoRI da Escherichia coli, ceppo R

Hind III da Haemophilus influentiae ceppo Rd

ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II

Gli enzimi di restrizione di tipo II riconoscono sequenze specifiche che tagliano con tre diverse modalità : •  Generando estremità piatte (blunt) •  Generando estremità sporgenti al 5' (5' protuding) •  Generando estremità sporgenti al 3' (3' protuding)

Le estremità sporgenti al 5' e al 3’ sono definite estremità coesive o appiccicose (sticky) perché potranno legarsi con

sequenze di basi complementari (estremità compatibili)

Taglio degli Enzimi di restrizione di tipo II

Estremità appiccicose

ISOSCHIZOMERI

Enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza e tagliano allo stesso modo

MboI e Sau3A 5’-GATC-3’

NEOSCHIZOMERI

Enzimi di restrizione che riconoscono la stessa sequenza ma tagliano in modo diverso

XmaI e SmaI 5’-CCCGGG-3’

Enzimi di restrizione compatibili

Enzimi che pur riconoscendo sequenze diverse, producono estremità appiccicose compatibili:

BamHI

5’- GGATCC - 3’ 5’- G - 3’ 5’- GATCC - 3’

3’- CCTAGG - 5’ 3’- CCTAG - 5’ 3’ - G - 5’

BglII

5’- AGATCT - 3’ 5’- A - 3’ 5’- GATCT- 3’

3’- TCTAGA - 5’ 3’- TCTAG - 5’ 3’- A - 5’

Ligazione estremità BamHI+BglII:

5’- GGATCT - 3’ 3’- CCTAGA - 5’

Modificazioni delle estremità coesive

Frequenza di taglio degli enzimi di restrizione

La lunghezza della sequenza di taglio determina la frequenza media di taglio di una molecola di DNA Assumendo che la frequenza delle quattro basi nel DNA sia la stessa e che la distribuzione delle 4 basi che compongono il DNA sia casuale

in ogni posizione del DNA ci sarà 1 probabilità su 4 di trovare una delle quattro basi.

La frequenza di taglio è uguale a 1/(4)n (n = al numero di nucleotidi del sito di riconoscimento)

Es. AluI: AGCT frequenza = 1/44 = 1/256 pb EcoRI: GAATTC frequenza = 1/46 = 1/4096 pb

ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT)

.

CCC/GGG GGG/CCC

GAT/ATC CTA/TAG

SmaI EcoRV

CCC GGG

ATC TAG

la sequenza ibrida che si forma non e’ riconosciuta da nessuno dei due enzimi

Estremità blunt Estremità blunt differenti +

NO complementarietà

Ligasi meno efficiente SVANTAGGIO:

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

L’Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

frammenti di DNA di dimensioni diverse

Enzimi di restrizione singoli o in combinazione

mappa dell’acido nucleico