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Le molecole biologicheGli acidi nucleici

A differenza delle proteine che costituiscono le strutture

cellulari e ne mediano gran parte delle funzioni

Gli acidi nucleici rappresentano il substrato molecolare

dell’informazione genetica che le cellule utilizzano per

costruire (sintetizzare) le proteine di cui esse hanno

bisogno.

Il termine acidi nucleici raggruppa due diversi tipi di macromolecole

Entrambe sono polimeri lineari di molecole più semplici chiamate nucleotidi, e

sono

• Acido desossiribonucleico, i.e. DNA

• Acido ribonucleico, i.e. RNA

Un po’ di storia…

Friederich Miescher (1844-95)

Miescher proveniva da una famiglia molto in vista nella comunità scientifica: il padre e lo zio

erano infatti stati professori di anatomia all'Università di Basilea. Timido ed intelligente, il giovane

Miescher si avviò verso la carriera di chimico fisiologo. Iniziò a studiare i linfociti, ma Felix Hoppe-

Seyler lo incoraggiò a studiare i leucociti. Miescher era infatti interessato soprattutto nello studio

della chimica del nucleo: dal momento che era difficile ottenere un numero di linfociti sufficienti

per uno studio, la scelta ricadde sui leucociti, che erano noti per essere il principale componente

del pus, ottenibile facilmente dalle garze usate nei vicini ospedali, affollati visto il conflitto franco-

prussiano.

Per evidenziare il nucleo dei leucociti presenti nel pus, Miescher dovette mettere a punto un

protocollo totalmente nuovo. Per recuperare le cellule dai bendaggi, utilizzò una soluzione salina

a base di solfato di sodio. Per separare i nuclei dai citoplasmi, sottopose le cellule ad una soluzione

alcalina, seguita da una acida.

Il precipitato formatosi in seguito a tale processo fu, appunto, chiamato nucleina.

Miescher morì nel 1895 di tubercolosi, dopo aver condotto anche un laboratorio della Max Planck

Society a Tubinga ed un istituto di ricerca di Basilea che, dopo la sua morte, prese il suo nome.


Miescher aveva avuto il merito di isolare e scoprire la nucleina, ma non aveva dato alcuna

interpretazione scientifica in merito al suo significato biologico.

Questo fece sorgere l’interrogativo nella comunità scientifica, se la nucleina altro non fosse

che il principale componente della cromatina, cioè quella sostanza complessa e fortemente colorabile che gli istologi osservavano nel nucleo delle cellule di tutti gli organismi superiori.

Tale ipotesi fu accettata comunemente, e all’inizio del XX secolo quando ormai il ruolo della

cromatina e dei cromosomi come elementi fondamentali dei caratteri ereditari era ben

chiaro, fu avanzata l’ipotesi che la nucleina degli organismi superiori fosse più complessa da

quella degli organismi inferiori.

Ciò diede un nuovo impulso allo studio della nucleina, portando alla scoperta che essa

conteneva due basi azotate puriniche (adenina e guanina) e due basi azotate piramidiniche

(timina e citosina) e lo zucchero pentoso 2-deossiribosio.

Negli stessi anni venne anche scoperta l’esistenza di un secondo tipo di acido nucleico

caratterizzato dallo zucchero ribosio e dalla presenza della base piramidinica uracile al posto della timina.

Giungendo dunque alla formulazione definitiva circa la presenza del DNA e dell’RNA

Tuttavia quando si provò ad analizzare la nucleina estratta da organismi diversi, ci si rese

conto la composizione chimica era sostanzialmente simile, facendo decadere l’ipotesi di una

nucleina più complessa a seconda della filogenesi dell’organismo.

Ciò fece cadere l’interesse verso questa sostanza come la responsabile della trasmissione dei

caratteri genetici, spostando invece erroneamente l’attenzione sulle proteine del nucleo.


I biologi restarono piuttosto scettici e poco interessati rispetto al DNA, che era oggetto di studio per la maggior parte di chimici.

Questo fino al 1944.

In quell’anno Oswald T. Avery, M. McLeod ed M. McCarty causarono parecchio sconvolgimento nell’ambiente accademico della biologia.

Il gruppo di ricerca aveva infatti ripreso gli esperimenti di un batteriologo inglese di nome F.Grifithche nel 1928 aveva condotto un esperimento circa il cosiddetto principio trasformante dello pneumococco Diplococcus pneumoniae, il batterio della polmonite.



Oswald T. Avery, M. McLeod ed

M. McCarty replicando gli

esperimenti di Griffith,

dimostrarono

inequivocabilmente che il

principio trasformante era il

DNA e che invece nessuna

trasformazione avveniva con le

sole proteine del nucleo.

Immagine 2.36

Basi biologiche

Un po’ di storia…Nel 1950 l’idea che fosse il DNA e non le proteine a trasmettere

l’informazione genetica era dunque ormai accettata.

In questi anni, il biochimico Ervin Chargaff riuscì a dimostrare che il DNA

è costituito da quantità uguali di basi puriniche e di basi piramidiniche.

Guanina = Citosina e Adenina = Timina.

Tale conclusione venne appunto definita come regola di Chargaff


In quegli anni inoltre il lavoro dei biochimici si intrecciò fortemente con il

lavoro degli strutturisti che potevano avvalersi di una nuova tecnica, la

cristollagrafia a raggi X

Un po’ di storia…I tempi erano ormai maturi per la scoperta della struttura del DNA ed a

lavoro su tale obiettivo vi erano tre diversi gruppi di ricerca:

California Institute of TechnologyPasadena Kings College

LondraCambridge

Linus PaulingJames D. Watson & Francis Crick


Linus Pauling

Aveva in precedenza scoperto la

struttura ad alpha-elica delle

proteine, e le forze che legano le

molecole

James D. Watson & Francis Crick

Aveva ottenuto delle immagini di

diffrazione che mostravano che il

DNA avesse una struttura elicoidale.

Ma non chiarivano quante

effettivamente fossero le catene di

DNA

Scoprirono la struttura a doppia

elica del DNA.

Ciò rese evidente che l’informazione genetica consisteva nella sequenza delle basi azotate lungo la

doppia elica, ma spiegò anche le modalità di duplicazione del DNA dalla cellula madre alla cellula

figlia. Inoltre spiegarono la regola di Chargaff evidenziando i legami idrogeno che legano la

guanina alla citosina e la timina alla adenina.

Per tutti questi grandi risultati Crick, Watson e Wilkins ricevettero nel 1962 il premio Nobel per la

medicina e la fisiologia.


I nucleotidiMentre le proteine sono polimeri caratterizzati dal legame di amminoacidi

Gli acidi nucleici legano fra loro i nucleotidi.

Gli amminoacidi sono in totale 20. I nucleotidi sono drasticamente di meno e sono

soltanto 4

1

23

45

Immagine

2.37

Basi

biologiche




soltanto 4

1

23

45

1. C1’ Lega la base azotata

2. C2’ Lega un gruppo ossidrile –OH nel ribosio/ due H nel desossiribosio

3. C3’ Lega sempre un –OH

4. C4’ Lega un atomo di O che rende ciclica la molecola di zucchero

5. C5’ Lega il gruppo fosfato




soltanto 4

1

23

45

Immagine

2.37

Basi

biologiche




soltanto 4

1

23

45

Nucleoside, Desossiribonucleoside Ribonucleoside

Fosforilazione

Nucleotide, Desossiribonucleotide Ribonucleotide

Il primo gruppo fosfato, chiamato alpha può a sua volta legare fino ad altri due

gruppi fosfati (beta e gamma)

Questo denota il nucleotide identificandoli come fosforilati, difosforilati e trifosforilati

Immagine 2.38

Basi biologiche

Nucleotidi trifosforilati come deposito energia chimica

L’energia del legame di due gruppi fosfato costituisce la maggiore sorgente energetica di

pronto utilizzo all’interno delle cellule.

In particolare l’ATP ed il GTP (trifosfati) in caso di bisogno vengono defosforilati di una o due

unità con liberazione di un fosfato inorganico.

In caso di energia in eccesso le stesse reazioni avvengono in direzione opposta

Nucleotidi trifosforilati come deposito energia chimica

Questi processi energetici vengono fondamentalmente utilizzati per due scopi

principali:

• Glicolisi – degradazione anaerobica del glucosio nel citoplasma

• Respirazione cellulare – nei mitocondri

Altre funzioni dei nucleotidi

Oltre ad essere i componenti degli acidi nucleici, ed essere parte del ciclo

energetico delle cellule i nucleotidi possono essere implicati nei processi di

trasduzione del segnale, ossia la risposta intracellulare all’arrivo di messaggeri

extracellulari come gli ormoni od i neurotrasmettitori.

Tale processo avviene attraverso la ciclizzazione dei nucleotidi.

Ad esempio, l’ATP ed il GTP cAMP e cGMP

Il legame fosfodiesterico

La classica modalità biologica di creare

macromolecole unendo molecole più piccole è

osservabile anche nel caso degli acidi nucleici.

Mentre i polisaccaridi sono legati dal legame

glicosidico e le proteine dal legame polipeptidico, gli

acidi nucleici utilizzano il legame fosfo-diesterico.

Tale nome deriva dal fatto che ad unirsi sono una

molecola di acido fosforico col C5’ di un nucleotide e

con il C3’ del secondo nucleotide.

Tale legame si sviluppa in 3 fasi:

1) I nucleotidi vengono trifosforilati in C5’

2) In presenza del secondo nucleotide due gruppi

fosfati vengono tagliati

3) L’energia derivante dalla liberazione del pirofosfato

viene usata per legare il gruppo fosfato in C3’ del

secondo nucleotide

Immagine 2.39

Basi biologiche

La struttura del DNA

Come scoperto da Crick e Watson, il DNA è composto da due filamenti polinucleotidici, legati

fra loro, avvolti su se stesso con un andamento a spirale, formando una doppia elica

tipicamente destrorsa.

Le due catene polinucleotidiche hanno fra loro un andamento antiparallelo (cioè direzioni 5’3’ opposte).

Immagine 2.40

Basi biologiche

La struttura del DNA

Le due catene polinucleotidiche sono tenute insieme dal legame fra le varie coppie di basi azotate, in particolare una base purinica si lega, tramite legami H, sempre ad una

base piramidinica.

Si vengono così a formare due coppie: Timina Adenina (legate da due legami H)Guanina Citosina (legate da tre legami H)

Questo rende i due filamenti di DNA complementari fra loro, legati stabilmente visto il grande numero di basi azotate legate fra loro (Kbase)

Data la regolarità dell’appaiamento fra una purina ed una piramidinica, il DNA ha una distanza costante fra i due filamenti, e quindi la doppia elica ha un diametro sempre

uguale in ogni suo punto.

Vi sono inoltre due solchi che percorrono la superfice della molecola chiamati solco minore e solco maggiore, che permettono ad alcune proteine chiamate fattori di

trascrizione, di legarsi in quei determinati punti e conoscere la sequenza di basi azotate senza aprire la doppia elica.

Nel legame fosfodiesterico ogni gruppo fosfato ha un gruppo acido libero di ionizzarsi.

Questo conferisce alla molecola una spiccata qualità di idrofilia che la rende solubile nel nucleo acquoso della cellula

Di contro le basi azotate all’interno della molecola restano un compartimento idrofobo, privo di acqua lasciando le basi protette da aggressivi chimici idrofili.

Immagine

2.40

Basi

biologiche

I cromosomi

All’interno del nucleo delle cellule eucariote il DNA forma un numero limitato di grosse

molecole lineari dette cromosomi

Nell’essere umano nel nucleo di ogni cellula sono contenuti 46 cromosomi

La replicazione del DNA

Crick e Watson, intuirono un’altra importante caratteristica del DNA, ovvero la capacità di

replicare se stesso e dare origine a due molecole figlie identiche all’originale, tramite un

meccanismo di replicazione semiconservativo.

Ovvero ogni molecola figlia riceve uno dei due filamenti originari mentre il secondo viene

sintetizzato nel momento della duplicazione.

Tale operazione avviene di norma nella fase S del ciclo cellulare.

Immagine 2.41

Basi biologiche


L’operazione di reduplicazione del DNA si può sintetizzare in 5 fasi.

1) Il processo inizia in punti specifici denominati siti Ori, in questi punti la molecola va incontro ad un

processo di denaturazione apportato da un enzima chiamato elicasi, con la rottura dei legami H che

tenevano uniti i due filamenti. A questo punto intervengono una serie di proteine che stabilizzano la

molecola mantenendo aperti i due filamenti, dando così origine alla cosiddetta forchetta di replicazione.

All’interno di questa regione ormai aperta, possono accedere i nucleotidi trifosfati che formeranno la

nuova catena, guidati da un enzima, chiamato DNA polimerasi DNA-dipendente

Immagine 2.42

Basi biologiche


2) All’interno di ogni forchetta di replicazione i singoli filamenti che prima formavano da doppia elica,

agiscono da stampo per la sintesi dei filamenti complementari.Infatti questi filamenti essendo aperti hanno le basi azotate ai numerosi nucleotidi trifosfati presenti

all’interno del nucleo.

Quindi sotto l’impulso dell’agitazione termica accade che basi fra loro complementari si leghino fra loro

con legami H, dando così il tempo all’enzima DNA polimerasi di legare fra loro le basi del nuovo

filamento.


3) Dal momento che la sintesi del DNA può avvenire solo in direzione 5'→3' e che l'origine di replicazione (rappresentato da una specifica sequenza di nucleotidi) non si trova mai all'estremità 5' o 3' (motivo per cui si forma la

cosiddetta bolla replicativa), solo uno dei due filamenti appartenenti alla stessa corsia, detto filamento guida (o

filamento leader, filamento veloce o, in inglese, leading strand), può essere sintetizzato in maniera continua, utilizzando

un unico innesco.


4) L'altro filamento, invece, chiamato filamento in ritardo (detto anche filamento lento o lagging strandin inglese), deve essere sintetizzato in direzione opposta al leading (in direzione 3'- 5'), sotto forma di

piccoli frammenti discontinui, definiti appunto frammenti di Okazaki. Per tale motivo, in realtà, il

filamento tardivo è dunque composto da diversi filamenti, la cui sintesi inizia vicino alla forca replicativa

a partire da un innesco (in inglese primer) da parte dell'enzima DNA polimerasi. Il frammento viene poi

legato al frammento successivo grazie al DNA ligasi

Si noti che la replicazione del DNA è bidirezionale, a opera di forchette di replicazione che operano in

entrambe le direzioni lungo il doppio filamento di DNA; pertanto un singolo filamento di DNA è

contemporaneamente guida per la duplicazione in una direzione e in ritardo in direzione opposta; i

frammenti di Okazaki si formano sulle "metà" percorse dalle forchette di replicazione in direzione 3'→5',

quindi su entrambi i filamenti della doppia elica del DNA.


5) Tutte le tappe fin qui descritte vengono ripetute in ogni punto Ori, per tutta la lunghezza del DNA

La struttura dell’RNA

A differenza del DNA l’RNA è formato da un singolo filamento nucleotidico, formato da ribonucleotidi

con la timina sostituita dall’uracile.

Sebbene sia un singolo filamento, l’RNA si avvolge su se stesso formando un gran numero di forcine a

doppia elica. Queste forcine si formano in presenza di particolari sequenze nucleotidiche dette

palindromiche, fra loro complementari. In modo analogo al DNA la doppia elica è stabilizzata da

legami idrogeno fra le basi azotate.

Tutte queste caratteristiche conferiscono all’RNA delle particolari funzioni.

In particolare:

1. Veicolazione dell’informazione genetica dal

DNA alle proteine (RNA messaggero)

2. Funzioni strutturali come costituenti dei

ribosomi (rRNA)

3. Trasportatori degli amminoacidi nella sintesi

delle proteine (tRNA)

4. Catalisi di varie reazioni chimiche, connesse

con il metabolismo degli acidi nucleici –

ribozimi

5. Regolatore dei processi della trascrizione e

traduzione small RNA

Immagine 2.43

Basi biologiche

La trascrizione del DNA in RNA

Il processo della sintesi delle varie molecole di

RNA, detta anche trascrizione del DNA in RNA, è molto simile al processo di replicazione del DNA

ma con alcune sostanziali differenze.

• Utilizza i ribonucleotidi trifosfato (rATP, rGTP, rCTP,

rUTP)

• Il processo è catalizzato dall’enzima RNA

polimerasi DNA-dipendente

• Mentre il processo della replicazione di DNA si

svolge sull’intera molecola, la trascrizione

dell’RNA è di tipo locale e riguarda solo una

sequenza nucleotidica, più o meno lunga,

definita gene

Immagine 2.44

Basi biologiche

I geni

Il termine gene indica uno specifico segmento cromosomico, la cui sequenza nucleotidica

codifica la sequenza amminoacidica che costituisce la struttura primaria di una proteina.

I nostri cromosomi portano complessivamente circa 30000 geni

Il gene è in genere formato da una sequenza codificante e da una sequenza regolatrice in

genere disposte a monte (verso l’estremità 5’) rispetto alla sequenza codificante.

Inoltre la parte della sequenza regolatrice più vicina alla sequenza codificante, è definita

promotore del genere.

Dal lato opposte c’è inoltre una particolare sequenza detta sito di poliadenilazione che servirà

da punto di attacco di una coda di poliadenine (poliA) durante il processo della maturazione

dell’RNA messaggero


Nella regione regolativa di ogni gene, ci sono delle corte sequenze chiamate elementi genici,

questi vengono riconosciuti da proteine specifiche chiamate fattori di trascrizione.

Quando la cellula ha bisogno di una particolare proteina, i fattori di trascrizione si legano alla

regione promotore del gene che codifica quella particolare proteina consentendo alla RNA

polimerasi di iniziare la trascrizione.

Che avviene tipicamente in tre fasi.

Immagine 2.45

Basi biologiche

1. INIZIO. I fattori di trascrizione si legano al DNA in

corrispondenza del gene specifico. Una volta

presente questo legame, può arrivare la RNA

polimerasi che dopo la denaturazione della

doppia elica, userà uno solo dei due filamenti,

come stampo.

2. ALLUNGAMENTO. La RNA polimerasi si libera dei

fattori di trascrizione ed inizia a scorrere in direzione 3’ 5’ polimerizzando l’RNA in direzione

5’ 3’.

3. TERMINE. L’allungamento prosegue fin quando

l’RNA polimerasi incontra una sequenza

nucleotidica chiamata sito di terminazione. A

questo punto questo filamento di RNA chiamato

trascritto primario si stacca e andrà incontro ad

alcuni processi che porteranno alla sua

maturazione.


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