Emoglobina (Hb)Costituisce il 95% delle proteine del globulo

rosso (ca. 300 milioni di molecole per cellula)

E’ un trasportare di O2: si lega a questo elemento quando si trova nei polmoni (o nelle lacune di Wolff del sacco vitellino o

nella placenta) o lo rilascia nei tessuti

Grazie all’Hb il sangue è in grado di trasportare una quantità di O2 100 volte più

elevata di quella che potrebbe essere trasportata da un ugual volume di soluzione salina acquosa come il plasma l’Hb rende il sangue capace di trasportare MOLTO O2

proteina tetramerica composta da una parte proteica ed una

non proteica

Gruppo eme: l’atomo di Fe è in grado di legare l’O2 solo quando si trova allo stato ridotto (Fe2+)

La parte proteica crea il microambiente idrofobico necessario a mantenere l’atomo di Fe allo stato

ridotto

Curva di dissociazione dell’Hb e sua dipendenza dal pH

La curva di dissociazione e la sua dipendenza dal pH e dalla concentrazioni di alcuni composti chimici dipendono dalla parte

proteica

Nei diversi periodi dello sviluppo ontogenetico l’approvvigionamento di O2 avviene in strutture

diverse necessità di differenti Hb ciascuna espressa in uno specifico periodo ontogenetico e

adatta ad associarsi all’O2 nella specifica struttura di approvvigionamento

La parte proteica è sempre costituita da 4 catene polipeptidiche uguali due a due (2 catene di tipo e

2 catene di tipo non-)Emoglobine embrionali Hb Gower I (22) Hb Portland (22) Hb Gower II (22)

emoglobina fetale Hb F (22)

Emoglobine adulte Hb A2 (22)Hb A (22)

Produzione dei vari tipi di catene globiniche nei diversi periodi di

sviluppo

I due switch (embrionale fetale e fetale post-natale) sono controllati a livello trascrizionale

Produzione di eritrociti

Negli adulti è presente una certa quota di HbF non è distribuita in modo uniforme in tutti i

gl.rossi ma si trova in poche cellule cellule F. La quantità di HbF aumenta in condizioni di

stress emopoietico

Qual è l’origine delle cellule F ?

Due ipotesi: 1) due popolazioni di cellule staminali diverse 2) un’unica popolazione in grado di attuare due programmi trascrizionali diversi

Risposta: un’unica popolazione di cellule staminali Cloni originati da una singola cellula progenitrice contengono sia cellule che producono HbF che cellule che producono HbA

Produzione di tutti gli elementi figurati del sangue

Lo switch feto adulto è dovuto a uno switch del programma trascrizionale delle cellule

progenitrici e non ad uno switch nell’attivazione di popolazioni staminali diverse

L’eritropoiesi ricapitola l’ontogenesi

Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol. 2005 33(3): 259

le catene di tipo sono lunghe 141 aminoacidi, i loro geni si trovano sul

cromosoma 16 (cluster , circa 30 kb)

le catene di tipo sono lunghe 146 aminoacidi, i loro geni si trovano sul cromosoma 11

(cluster , ca. 60 kb)

catene di tipo e di tipo mostrano una

forte omologia di sequenza ad

indicare una loro origine evolutiva

comuneUna notevole omologia si

riscontra anche con la sequenza della

mioglobina proteina che lega l’O2 nel muscolo

Manca e Masala, IUBMB Life, 60(2): 94–111, 2008

Mioglobina Emoglobina

In entrambi i cluster i geni sono organizzati secondo l’ordine

temporale in cui sono espressi e sono presenti delle regioni

regolative (LCR = Locus Control Region), poste diverse kb a monte

dei geni stessi, che sono necessarie per l’espressione di

tutti i geni del cluster

I geni globinici sono di piccole dimensione (< 1.6 kb) hanno 3 esoni e 2 introni, il 38% della loro sequenza è codificante

Manca e Masala, IUBMB Life, 60(2): 94–111, 2008

Strachan e Read – Genetica Molecolare Umana, Zanichelli, 2012

Organizzazione dei due cluster globinici: cluster (cromosoma 16) e cluster (cromosoma 11

Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia

La proteina si trova in forma praticamente pura all’interno dei gl.rossi cellule di un tessuto facilmente accessibile

Molti individui hanno patologie dovute a mutazioni dei geni globinici molte varianti strutturali e varianti quantitative (talassemie, HPFH)

alfa talassemie /non- < 1 (c’è un difetto di catene )

beta talassemie /non- > 1 (c’è un difetto di catene non , che nell’adulto sono sostanzialmente le )

In ogni momento della vita di un individuo (periodo embrionale, fetale e post-natale) il

rapporto

n° catene /n° catene non- = 1

Si definisce talassemia la condizione in cui tale rapporto 1

Le talassemie sono quindi un difetto QUANTITATIVO generalmente dovuto a perdita di funzione

Nomenclatura

Microcitemia o Talassemia minor o Trait talassemico sono sinonimi e indicano la condizione CLINICAMENTE ASINTOMATICA degli eterozigoti facilmente individuabili attraverso un semplice esame ematologicoAnemia mediterranea o Morbo di Cooley o Talassemia major sono sinonimi e indicano il quadro clinico, molto grave (mortale in assenza di cure) degli individui omozigoti (o eterozigoti composti per alleli non funzionanti)

alleli thal0 (thal0) assenza completa di catene ()

alleli thal+ (thal+) riduzione più o meno marcata di catene ()

I principali parametri del sangue che risultano alterati nei microcitemici

nei microcitemici la quantità totale di Hb è ridotta mentre il numero di globuli rossi è aumentato

gli eritrociti sono però più piccoli

il ridotto contenuto di Hb determina un appiattimento delle emazie e una loro maggiore resistenza all’emolisi

in soluzione salina ipotonica.

g/dl

per l

3

g/dl

per l

3

in soluzione ipotonica l’emolisi delle emazie normali è totale e il liquido color

rosa è limpido;

le emazie microcitemiche vengono distrutte solo in parte e la soluzione resta torbida.

NORMALE MICROCITEMICO

i globuli rossi dei malati

sono quasi completamente

privi di Hb, essi sono molto

pochi e presentano marcate

alterazioni morfologiche,

alcuni sono solo dei

frammenti, tutti vanno

incontro ad una precoce

distruzione

FREQUENZA DELLA MICROCITEMIA NEL MONDO

La microcitemia è frequente in tutti i paesi che si affacciano sul Mediterraneo (da cui il nome di anemia mediterranea) e in tutto il

sud-est asiatico.

si calcola che i portatori sani nel mondo siano circa 180.000.000

in Italia vivono circa 2.500.000

microcitemici sani

grazie alla prevenzione le

nascite di individui malati sono molto

limitate

la frequenza dei portatori sani è molto alta nelle

regioni meridionali, in Sardegna, in

Sicilia e nella regione del delta del Po

FREQUENZA DELLE MICROCITEMIE IN ITALIAFREQUENZA DELLE MICROCITEMIE IN ITALIA

dal GENE al PRODOTTO POLIPEPTIDICO

FUNZIONANTE

1. Il gene deve essere presente;

2. Il gene deve essere trascritto;

3. Il trascritto deve essere maturato:

rimozione degli introni, aggiunta del CAP,

aggiunta del poli-A

4. L’mRNA maturo deve essere portato nel

citoplasma e caricato sui ribosomi;

5. La traduzione deve avere inizio;

6. L’mRNA deve essere tradotto per tutta la

sua lunghezza;

7. La catena polipeptidica deve essere stabile

e in grado di svolgere la sua funzione

Maturazione del trascritto

primario produzione di mRNA

Produzione del trascritto primario e rimozione degli introni

EVENTOCOMPROMESSO

REGIONE GENICA MUTATA

TIPO DI ALLELE

N° DI ALLELI NOTI

CONSEGUENZA FUNZIONALE

Trascrizione Promotore Thal (+) 19 L’attività trascrizionale residua varia tra il 20 e

il 50%

Splicing Introne, sito donatore o accettore

Introne, sequenze consesus

Introne, attivazione di un sito criptico

Esone, attivazione di un sito criptico

Thal (0)

Thal (+)

Thal (+)

Thal (+)

16

16

6

5(3 MS e 2 SS)

Exon skipping o ritenzione dell’introne

(o di parte di esso)

mRNA normale presente in quantità ridotta +

mRNA anormale

Come sopra

Come sopra, inoltre in caso di mutazione MS la

globina prodotta presenta una SSA

La grande varietà degli alleli thal

EVENTOCOMPROMESS

O

REGIONE GENICA MUTATA

TIPO DI

ALLELE

N° DI ALLEL

I NOTI

CONSEGUENZA FUNZIONALE

Taglio dell’RNA e poliadenilazione

Sito di adenilaz.AATAAA

Thal (+) 6 RNA normali +

RNA instabili

Capping Sito del capping

Thal (+) 1 RNA normali+

RNA instabili

Attacco al ribosoma

5’ UTR RBS=Ribos. Binding

Site

Thal (+) 7 Assenza di traduzione

Inizio traduzione 1° codone (AUG)

Thal (0) 7 (max poss 9)

Assenza di traduzione

Traduzione codificante codone

sensoSTOP

Thal (0) 16 mRNA instabile per presenza di un codone di stop

prematuro

Traduzione codificanteindel

Thal (0) > 60 Come sopra

Traduzione codificanteMS

Il polipeptide presenta una singola sostit. aa, le conseguenze funzionali dipendono da sede e proprietà di aa.

sostituito e aa. sostituente

HPFH Hereditary Persistence of Fetal Haemoglobin

In base all’evento mutazionale che ne è la causa può essere suddivisa in due categorie:

•forme dovute a delezione (di tratti più o meno estesi del cluster globinico)

•forme NON dovute a delezione (ndHPFH), in quelle dovute a mutazioni nel cluster dei geni globinici spesso le mutazioni interessano regioni regolative dei geni

Lo studio delle Hb e dei loro geni ha portato contributi fondamentali in vari campi della biologia

Studi biochimici di correlazione struttura-funzione

Scoperta del primo crossing-over (intragenico) dislocato la Hb Lepore

Scoperta della prima regione HSR (Hot Spot of Recombination)

Scoperta della prima regione LCR

Si è arrivati alla sua scoperta attraverso lo studio delle delezioni del cluster beta (e delle loro conseguenze) e attraverso lo studio della organizzazione cromatinica della regione

Assenza dei geni assenza delle catene globiniche

I geni sono intatti ma le globine non vengono sintetizzate, perché?

Struttura della LCR 5 siti sensibili al trattamento con DNAsi I, ciascun sito è di 250 bp e contiene sequenze di legame per vari fattori di trascrizione

La LCR è necessaria per l’espressione di TUTTI i geni del cluster e isola la regione dalla vicina cromatina inattiva

Come agisce la LCR ? E’ stato dimostrato che la LCR lega dei fattori di trascrizione e interagisce fisicamente con i promotori dei geni globinici (con un promotore alla volta)

Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol. 2005 33(3): 259

Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?

Due meccanismi: Competizione tra geni

Studi su topi transgenici

Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol. 2005 33(3): 259

Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?

Silenziamento di geniIn topi transgenici con il gene legato alla LCR il

transgene viene espresso solo nel periodo

embrionale sequenze necessarie per il

silenziamento sono state identificate sia nella parte

distale che in quella prossimale del promotore

Stamatoyannopoulos G, Exp Hematol. 2005 33(3): 259

Come vengono accesi e spenti i vari geni globinici ?

In sintesi di fondamentale importanza sono:

1) La distanza dalla LCR2) La presenza di fattori di silenziamento3) La presenza di fattori di accensione gene-

specifici (sicuramente per il forse per il )

Periodo embrionale il gene viene espresso in quanto fisicamente più vicino alla LCR

Periodo fetale il gene viene silenziato, la LCR agisce sul gene che (forse) è attivato anche da fattori di trascrizione specifici

Periodo adulto il gene viene silenziato, il gene si lega a fattori di trascrizione specifici e su di esso agisce la LCR

Attualmente sono state indentificate varie proteine coinvolte nel silenziamento dei geni o

nell’accensione del gene . Il fenotipo di soggetti portatori di vari tipi di talassemie dovute a delezione

contribuisce a chiarire l’importanza di specifiche regioni del cluster per il legame di queste proteine

Ghedira et al. (2013) – Hematologica 98: 305-308)