MISFOLDING E MALATTIE

NEURODEGENERATIVE A cura di:

Giancarlo Trimarchi

Dario Scapellato

Flavio Trusso

Valeria Todaro

Melissa Torrisi

Fabio Vignera

Gaetano Strano

Cesare Saitta

Video 1

Folding ed attività biologica delle proteine

“La forma è l’immagine plastica della funzione.”

(Angelo Ruffini)

Protein Folding: auto-assemblamento e ripiegamento intramolecolare attraverso cui il

polipeptide, mediante interazioni non covalenti, assume la propria conformazione nativa che gli

permette di svolgere la sua peculiare funzione fisiologica.

Le proteine sono molecole flessibili con struttura a rapida fluttuazione e le loro mobilità

strutturali sono collegate alla loro funzione.

Denaturazione Proteica

Condizioni ed agenti denaturanti:

CALORE rotazione ottica a carico della struttura e

variazione di viscosità e di assorbimento UV;

pH estremi variazione degli stati di ionizzazione delle

catene laterali degli amminoacidi;

DETERGENTI compromissione delle interazioni idrofobe

mediante associazione ai residui non polari;

AGENTI

CAOOTROPICI aumento della solubilità delle sostanze non polari

in acqua disgregazione delle interazioni idrofobe;

Urea Ione guanidinio Mercaptoetanolo Formaldeide

Dinamica molecolare

della mioglobina

Esperimento di Anfinsen (1957)

La ribonucleasi A (RNasi A), completamente denaturata in una soluzione 8 M di urea

contenente 2-mercaptoetanolo, riassume la propria conformazione nativa attraverso l’eliminazione

per dialisi dell’agente denaturante e del riducente e l’esposizione ad O2 a pH 8.

RNasi A:

-proteina a catena

singola (124 residui)

- 4 ponti disolfuro

determinati da 8

-residui Cys.

Probabilità complessiva di riformazione

casuale dei ponti disolfuro della RNasi A:

1/7 x 1/5 x1/3 x1/1 = 1/105 = 0.0095 < 1%

Dogma di Anfinsen (1957)

“In condizioni fisiologiche, le proteine possono ripiegarsi spontaneamente nella loro

conformazione nativa che corrisponde ad un unico minimo di energia libera, stabile e

cineticamente accessibile. Ciò implica che la struttura primaria di una proteina,

costituita da una specifica sequenza di amminoacidi, determina univocamente la sua

struttura tridimensionale.”

Paradosso di Levinthal Come fa una proteina a ripiegarsi nella sua conformazione nativa?

L’ eplorazione casuale di tutte le sue possibili conformazioni fino al raggiungimento

di quella corretta NON è una procedura possibile!!!

DIMOSTRAZIONE:

• ogni residuo ha 2 possibili angoli di torsione (φ e ψ) una proteina di n residui

possiede 2^n angoli di torsione;

• ciascun angolo di torsione ha tre conformazioni stabili 32n ≈ 10n conformazioni possibili;

• tempo di analisi di ogni nuova conformazione pari a 10-13 s

tempo di analisi di tutte le

strutture t = 10n/1013

Es: proteina di 100 residui (molto piccola), t = 10^87 >> età dell’Universo.

“ Le proteine raggiungono la loro conformazione nativa in meno di qualche secondo e

pertanto il ripiegamento avviene necessariamente attraverso vie dirette, piuttosto che

attraverso la scelta casuale della struttura.”

Processo di Folding

Ipotetica via di ripiegamento

di una proteina composta di

due domini.

Il ripiegamento avviene in modo gerarchico e la stabilità conformazionale della proteina

aumenta in maniera netta, ossia la sua energia libera (ΔG) diminuisce drasticamente.

Fasi del Folding:

• formazione di segmenti locali di struttura secondaria (α-eliche e foglietti-β) entro

5 ms dall’inizio del ripiegamento;

• collasso idrofobico;

• formazione globulo fuso (molten globule) con prevalenza di struttura secondaria

e poca struttura terziaria finale nativa;

• stabilizzazione della struttura secondaria e formazione di sottodomini con

parziale assemblaggio della struttura terziaria (5-1000 ms);

• impaccamento delle catene laterali interne, formazione di legami idrogeno ed

espulsione delle molecole d’acqua rimaste nel nucleo idrofobo;

• ΔG folding caratterizzato da valori bassi (-5, -10 kcal/mol)

Profilo energetico del Folding

Una proteina che si ripiega deve procedere da uno

stato ad alta energia ed alta entropia a uno stato

caratterizzato da bassi valori di energia ed entropia;

tale nesso è conosciuto come «imbuto di

ripiegamento» (folding funnel).

Le «fenditure» e le «gole» più piccole rappresentano

conformazioni acquisite temporaneamente dalle proteine

sino a quando, attraverso un’attivazione termica casuale,

superano la leggera rampa della barriera di energia

libera possono procedere verso una conformazione a

energia inferiore.

“Le proteine si sono evolute in modo da

possedere vie di ripiegamento efficienti e

conformazioni native stabili.”

Disolfuro isomerasi delle proteine (PDI)

Anche in condizioni sperimentali ottimali, le proteine si ripiegano in modo più lento in vitro che

in vivo a causa della formazione di ponti disolfuro non riscontrati nelle forme native. Tale

constatazione condusse Anfinsen alla scoperta della PDI.

•PDI si lega a proteine non ripiegate mediante interazioni idrofobiche con residui superficiali;

•PDI ridotta catalizza il processo di scambio di ponti disolfuro (~2 min in RNasi);

•PDI ossidata catalizza la formazione iniziale dei ponti disolfuro in un polipeptide;

Chaperon molecolari • Famiglia di proteine presente in tutti gli organismi, dai batteri all’uomo;

• Si trovano in ogni compartimento cellulare;

• Rendono più efficiente il ripiegamento («folding») di altre proteine;

• Inoltre partecipano al mantenimento o alla creazione di uno stato di parziale denaturazione delle proteine, favorendone così il trasporto attraverso le membrane dei mitocondri o dei plastidi (nel caso delle cellule vegetali).

Chaperon molecolari Esistono due classi di chaperon molecolari:

• Chaperon veri e propri (Hsp70, Hsp90);

• Chaperonine o chaperon di II classe (GroEL/GroES nei procarioti; Hsp60/Hsp10 negli eucarioti).

Hsp = «Heat shock proteins» (cioè «proteine da shock termico»), perché sono state rilevate durante studi di denaturazione delle proteine mediante calore.

Il numero che segue indica il peso molecolare espresso in kD (kiloDalton).

1 D = 1 uma = 1,660 538 921 × 10−27 kg.

Chaperon e chaperonine non sono separate tra loro, ma collaborano nel corretto folding delle catene polipeptidiche. N.B.: Dalla figura in alto potete notare che il complesso GroEL/GroES dei procarioti è identico al complesso Hsp60/10 presente negli eucarioti. Per quale motivo?

TEORIA ENDOSIMBIONTICA: il mitocondrio deriverebbe da un batterio aerobio che si è adattato a vivere all'interno di una cellula eucariotica ancestrale anaerobia.

Lynn Margulis, 1967

Meccanismi d’azione delle chaperon molecolari

Hsp70 (o dnaK in E.Coli):

1. Le Hsp70 si legano all’ATP nel loro dominio ammino-terminale (-NH₂) e assumono conformazione aperta.

2. Legame tra dominio carbossi-terminale (-COOH) delle Hsp70 e catene polipeptidiche nascenti ancora legate ai ribosomi;

3. Idrolisi dell’ATP legato alle Hsp70 permette la chiusura di tali chaperon con successivo folding della proteina.

Meccanismi d’azione delle chaperon molecolari

Complesso GroEL/GroES (uguale al complesso Hsp60/Hsp10 del mitocondrio):

• GroEL: costituito da due anelli sovrapposti di sette subunità ciascuno con una cavità centrale dove vi è il sito di ripiegamento ATP-dipendente della proteina;

• GroES: costituito da un singolo anello di altre sette subunità che si dispone a cupola su GroEL;

• Non appena la proteina ha completato definitivamente il processo di ripiegamento, viene rilasciata da GroEL.

GroEL

GroES

Grande utilità delle chaperon molecolari

Cellular homeostasis and stress survival requires maintenance of the proteome and suppression of proteotoxicity. Molecular chaperones promote cell survival through repair of misfolded proteins and cooperation with protein degradation machines to discard terminally damaged proteins. Hsp70 family members play an essential role in cellular protein metabolism by binding and releasing nonnative proteins to facilitate protein folding, refolding and degradation. L’omeostasi cellulare e la sopravvivenza allo stress richiedono il mantenimento del proteoma e la soppressione della proteotossicità. Le chaperon molecolari garantiscono la sopravvivenza della cellula attraverso la riparazione di proteine mal ripiegate e la cooperazione con complessi di degradazione proteica al fine di eliminare le proteine terminalmente danneggiate. Le Hsp70, legando e liberando proteine non native per facilitare il folding proteico, il refolding e la degradazione, giocano un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare delle proteine. From “Specification of Hsp70 Function by Type I and Type II Hsp40” by Douglas M. Cyr, Carlos H. Ramos, 09 Dec 2014

RIPIEGHIAMOCI !

FLAVIO TRUSSO

Ripieghiamoci !

mm.. La proteina non si ripiega mica sola

chaperon Controlla il corretto

ripiegamento

Viene particolarmente stimolata dal calore

Pronto..

ribosoma

..All’ opera!

AA + AA

AMMINOACIDO

AA + AA + AA

AMMINOACIDO

..Procedono i lavori

Prima costruzione della

proteina

Ottimo !

Andiamo alla grande!

Che bella proteina

Ma …

Non c’ è voglia di lavorare

E ci sono certi imprevisti !

esempio

Incidenti

normale Oops

OOK !

Proteasi

Proteosoma

Concentrazione proteica

Foro piccolo

Foro grande

7 7

ATPasica

+ riconoscimento

Ubiquitina

Ubiquitina

E1 ATP

E1

E2

E3

E2 + E3

= Ubiquitina ligasi

Quindi..

Proteosoma

ubiquitina

Processo

Capita però..

Amiloidosi

PrPc : sensibile alla proteasi

PrPsc: resistente alla proteasi

MISFOLDING

INSERIMENTO VIDEO

VIDEO 1

https://www.youtube.com/watch?v=hywcyZbWIeg

Video 2

Formazione delle amiloidi 1. Proteina sierica precursore

2.Fattori ambientali 3. Prioni

Aumento dei foglietti beta

Protofibrille

Protofilamenti

AMILOIDI

Malattie da misfolding proteico

PROTEINA MALATTIA PATOGENESI

MECCANISMO

Emoglobina Anemia falciforme Aggregazione

L’emoglobina non correttamente ripiegata

perde la sua funzionalità e la sua elasticità,

causando seri danni alla circolazione

sanguigna.

CFTR Fibrosi cistica Trasporto

Forme mutanti di CFTR non si dissociano

dagli chaperoni e non raggiungono la

membrana.

Huntingtina M. di Huntington Aggregazione La ripetizione di p-glu più lunga porta alla

formazione di aggregati cellulari insolubili.

Proteina b-amiloide M. di Alzheimer Aggregazione

Il peptide beta-amiloide non correttamente

ripiegato si accumula nel tessuto nervoso

umano, formando dei depositi noti come

placche neuritiche.

Proteina prionica (PrP) M. di Creutzfeld-

Jakob

Aggregazione

Effetto a cascata in cui sempre più proteina

viene convertita nella forma che determina

la malattia.

a-Synucleina M. di Parkinson Aggregazione La proteina con avvolgimenti sbagliati si

aggrega in masse sferiche (corpi di Lewy)

P53 Tumori Trasporto

P53 impedisce la divisione cellulare.

Mutazioni di p53 portano ad un non corretto

ripiegamento; le proteine p53 instabili sono

distrutte.

Morbo Di Alzheimer

Video https://www.youtube.com/watch?v=dj3GGDuu15I&index=7&list=PLLfnIn4GFtd5tOZ1qFcA0eOorWWV8KyI3

Tagliare da 1:31 a 2:10

Video 3

Esistono delle basi genetiche? SNPs coinvolti nella malattia di Alzheimer

Gene analizzato Varianti genetiche studiate

ACT -51 G-T

APO E

Cys112Arg

Arg158Cys

HMGCR -911 C-A

IL-1B -511 C-T

IL-10 -1082 G-A

VEGF -2578 C-A

Prospettive future

• Uso di cellule staminali pluripotenti indotte

• Uso di osmoliti o di chaperone molecolari

• Uso di nanoparticelle funzionalizzate

L’apice del misfolding delle proteine: la saga dei prioni

Islanda, anni ’50 SCRAPIE (eng. To scrape = grattare, scorticare)

Lymph nodes from (a) healthy and (b) infected sheep - colouring with antibodies shows clear sign of scrapie prions in the intracellular tissue of the infected sheep

IPOTESI VIRUS Smentita dagli studi di Stanley B. Prusiner (Nobel 1997)

«Prion diseases are transmissible, progressive and invariably fatal neurodegenerative conditions associated with misfolding and aggregation of

a host-encoded cellular prion protein, PrPC» An overview of human prion diseases, Imran and Mahmood, Virology Journal 2011, 8:559

PrPC PrPSc

«Proteine infettive»: il contagio conformazionale

…ma come è cominciato tutto? Cosa ha determinato la mutazione conformazionale della proteina PrP a parità di struttura primaria?

Classificazione delle malattie da prioni (PrDs):

• Sporadiche (85-90%) es. sporadic Creutzfeldt-Jacob disease (sCJD),

sporadic fatal insomnia (sFI)

• Acquisite (1-3%) es. iatrogenic CJD (iCJD), Kuru, variant CJD (vCJD)

• Genetiche (10-15%)* es. Fatal familial insomnia (FFI), familial or

genetic CJD (f/gCJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome (GSS)

*percentuali tratte dalla Review «Prion Diseases», L.T.Takada, M.D.Geschwind, Semin Neurol 2013;33:348-356

0

20

40

60

80

100

Sporadiche Acquisite Genetiche

PrDs

PRNP

PRNP pathogenic point mutations Tratto da JKMS, «Genetic Studies in Human Prion Diseases, Byung-Hoon Jeong and Young-Sun Kim

Più di 30 mutazioni nell’ORF del gene

Ricerca

Topo knockout per PRNP: Sopravvivenza, immune a infezioni da prioni

258a 272a

• Capacità di sintesi enzima che «disattiva» PRNP

• Encefalite spongiforme senza sintomi, non letale

• Scomparsa spongiosi dopo 12 mesi

Encefalopatie spongiformi trasmissibili(TSE)

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili sono un gruppo di malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali, caratterizzate da un lungo periodo d'incubazione e da lesioni al SNC.

Nei bovini:Encefalopatia bovina spongiforme Nella pecora: Scrapie Nell'uomo: malattia di Creutzfeldt-Jakob La malattia di Creutzfeldt-Jakob descritta negli anni venti da Hans Creutzfeldt e Alfons Jakob è una rara patologia degenerativa del

sistema nervoso centrale, caratterizzata da una progressiva demenza fatale.

Classificazione

La MCJ sporadica La forma sporadica comprende circa l'80% dei casi di MCJ; inizialmente presenta dei sintomi aspecifici quali, perdita di peso, atassia, diturbi visivi come allucinazioni visive. Nella fase avanzata della malattia avremo comparsa di crisi epilettiche, coma, con una durata media della malattia di circa 6 mesi. Un ruolo fondamentale che causa la malattia è svolto da un polimorfismo al codone 129 del gene PRNP che regola la suscettibilità alla malattia. La diagnosi è definita solo post mortem dall’analisi neuropatologica e/o dall’analisi biochimica eseguita su tessuto cerebrale. Intra vitam la diagnosi è probabile se il paziente presenta una demenza, disturbi visivi o segni cerebellari, associato a un tracciato elettroencefalografico.

La MCJ familiare

La MCJ familiare è legata a svariate mutazioni puntiformi del gene PRNP e si presenta con una sintomatologia simile alla forma MCJ sporadica ma con un esordio più precoce(intorno ai 45 anni).

Caratterizzata da movimenti involontari e da demenza, la MCJ ha un decorso clinico che oscilla tra i 2 e i 10 anni.

La MCJ variante

Nel 1996 è stata descritta nel Regno Unito la forma variante della MCJ legata al consumo alimentare di prodotti carnei contaminati dall’agente infettivo responsabile dell’encefalopatia spongiforme del bovino. Si discosta dalla forma classica di MCJ per la durata della malattia superiore ai sei mesi, per l'insorgenza della malattia con un'età media di 28 anni e per le caratteristiche cliniche di esordio di tipo psichiatrico (depressione, ansietà, apatia, illusioni). Fondamentale per la diagnosi clinica di vMCJ è l'esecuzione della risonanza magnetica; si è visto che l'analisi del gene PRNP non ha identificato alcuna mutazione nè altre alterazioni di rilievo (inserzioni, delezioni), mentre tutti i casi sono risultati omozigoti per metionina al codone polimorfico 129 del gene PRNP.

Trattamenti Per la MCJ al momento non è stato dimostrato alcun trattamento efficace, la malattia è sempre fatale e la ricerca per una nuova cura continua. Tuttavia esistono dei farmaci da somministare ai pazienti affetti da MCJ con funzione di ridurre le convulsioni nervose, spasmi muscolari e crisi epilettiche dovute a stadi avanzati della malattia.

MORBO DI PARKINOSN

MALATTIA NEURODEGENERATIVA EZIOLOGIA EPIDEMIOLOGIA SINTOMI TERAPIE INTERVENTO (NEUROCHIRURGIA STEREO-TASSICA)

EZIOLOGIA

Genetica Accumulo amiloidale ROS Infettiva Tossica

EPIDEMIOLOGIA

Maggiore nei maschi Età di esordio circa: 50 / 55 anni

TERAPIE

•Precursori dopamina (L-Dopa) •Dopamino-agonisti •Chirurgica (tramite elettro stimolazione)

DEEP BRAIN STIMULATION

Video 4

TO be

CONTINUED…

bibliografia/sitografia.

-JOURNAL OF VIROLOGY, Feb.1993,p.643 Byron Caughey-

Gregory Jay Reymond

-Current Therapeutic Research Volume 66.Number 6

November/December 2005 Peter Gosh-Jack Edelman

-National Academy Science USA oct 1998 Larisa Cervenàkova-

Ralph Garruto-Lev G.-Goldfarb-Hee Suk Lee-Paul Brown.

Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin

Raff, Keith Roberts, Peter Walter

Biologia molecolare della cellula

Quinta edizione

Harvey Lodish, A Berk, C.A. Kaiser, M. Krieger, M.P. Scott,

A. Bretscher, P. Ploegh, Paul Matsudaira

Biologia molecolare della cellula

Terza edizione italiana condotta sulla sesta edizione

americana

Majno - Joris , Editore: Casa Editrice Ambrosiana ,

Edizione: II 5/2009 , Volume: Unico

Cellule, tessuti e malattia - Principi di patologia generale

Credits

Donald Voet, Judith G Voet, Charlotte W Pratt

Fondamenti di biochimica

Terza edizione italiana condotta sulla quarta edizione

americana -Pocchiari M, Ladogana A. La malattia di

Creutzfeldt-Jakob.

Aspetti clinici ed epidemiologici.

- Collinge J, Sidle KC, Meads J, Ironside J, Hill AF.

Molecular

analysis of prion strain variation and the etiology of “new

variant” CJD. Nature 1996;383:685-90.

-Zanusso GL, Ferrari S, Rizzuto N, Monaco S. Malattie da

Prioni umane: etiologia, patogenesi e aspetti clinico-

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Brescia Medicina 2000;3-4:3-11. -"An overview of

human prion diseases", Muhammad Imran and Saqib

Mahmood, Virology Journal 2011, 8:559

-"Prions and Prion-Like Pathogens in Neurodegenerative

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Alessandro Bertoli, Pathogens 2014, 3, 149-163

Credits

-"Genetic Studies in Human Prion Diseases", Byung-Hoon

Jeong and Yong-Sun Kim, J Korean Med Sci 2014, 29,

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-"Prion Diseases", Leonel T. Takada and Michael D.

Geschwind, Semin Neurol 2013, 33:348-356

-"Cellule, tessuti e malattie. Principi di patologia

generale", Isabelle Joris and Guido Majno "Biologia e

Genetica", 2009, II edizione, De Leo, Ginelli, Fasano.

http://www.slideshare.net/cmid/master-buffa-marzo-

09http://flipper.diff.org/app/items/1194

http://www.amiloidosi.it/medici_amilo_sis.htm

http://www.inbb.it/wp-

content/uploads/2014/07/Atti_WS-2009.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3192805

/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24854788

http://didattica.uniroma2.it/assets/uploads/corsi/14073

7/Lezione_2_malattie_da_accumulo_proteinopatie.pdf

Credits