ESTRAZIONE DNA DA VEGETALI

PRINCIPIO DEL METODO

Questa tecnica permette l’estrazione del DNA da alcuni vegetali, sfruttando la naturale

composizione della membrana esterna e nucleare delle cellule; tale membrana è composta da

sostanze grasse denominate fosfolipidi. Le membrane vengono demolite facendo uso di un

semplice detersivo sgrassante per stoviglie. Una volta separato, l’acido nucleico, può essere

precipitato facilmente usando etanolo freddo.

Per favorire l’azione del detersivo, il campione deve essere precedentemente frammentato in

maniera opportuna, ovvero preparando una poltiglia ed evitando l’eccessiva frantumazione delle

cellule che comporterebbe l’isolamento di filamenti di DNA troppo corti, e quindi poco visibili.

La soluzione estraente è composta da detersivo e da sale; quest’ultimo ha il compito di facilitare

l’eliminazione delle proteine su cui è avvolto il DNA, ovvero gli istoni, (allo stesso scopo possono

essere usati al termine del procedimento degli enzimi proteolitici, come la bromelina contenuta

nel succo di ananas).

In questa tecnica è molto importante Il controllo della temperatura, infatti la poltiglia viene

portata ad una temperatura di 60°C allo scopo di disattivare alcuni enzimi che potrebbero

degradare il DNA stesso. Bisogna aver cura, tuttavia, di non prolungare la permanenza del

preparato a questa temperatura (max 15 minuti) per evitare che l’acido nucleico si degradi

ugualmente per azione del calore.

Il DNA è molto solubile in acqua, quindi non è visibile in soluzione, per evidenziarlo è sufficiente

usare dell’alcol freddo che ne causa la precipitazione. La presenza di alcune bollicine sarà dovuta al

fatto che i gas più solubili nel liquido freddo, tenderanno di liberarsi a temperatura ambiente.

Dall’osservazione al microscopio vengono individuate strutture vagamente filamentose

raggruppate in ammassi.

PROCEDIMENTO

Preparare la soluzione di estrazione sciogliendo 2 g di cloruro di

sodio in 90 ml di acqua e 10 ml di detersivo per stoviglie,

mescolare evitando la formazione di bolle.

Ridurre in poltiglia il campione da trattare, pesarne successivamente 30 g e aggiungere una stessa

quantità di soluzione di estrazione.

Mescolare il tutto, e porre la beuta a b.m. per 15 minuti ad una temperatura di 60°C.

Trascorso il tempo inserire il tutto in un bagno di ghiaccio per circa 5 minuti e mescolare.

Filtrare il tutto con carta da filtro rapida e lasciare riposare per altri 5

minuti.

(Eventualmente per allontanare gli istoni aggiungere a 5 ml di

preparato 1 ml di succo d’ananas lasciando agire per 2-3 minuti).

Aggiungere molto lentamente e lungo le

pareti, per favorire la stratificazione, un

egual volume di alcol freddo

(precedentemente tenuto nel

congelatore), lasciare riposare qualche

minuto per consentire al DNA di

precipitare e rendersi visibile.

La massa lattiginosa ottenuta viene prelevata con un’ansa e posta su un vetrino portaoggetti,

quindi si aggiunge una goccia di colorante nucleare, come ad esempio il blu di metilene, si copre il

tutto con un vetrino coprioggetti, e si osserva al microscopio.

Le immagini che seguono sono state acquisite con un semplice microscopio ottico; esse sono il

risultato finale dell’esperienza condotta su campioni di frutta, nell’ambito delle esercitazioni del

laboratorio di chimica organica, effettuata dagli alunni della classe 5^ sez. A chimica, dell’Istituto

Tecnico Industriale “Pacinotti” di Taranto durante l’a.s. 2012/2013.

FILAMENTO DI DNA ESTRATTO DA UN CAMPIONE DI KIWI

FILAMENTO DI DNA ESTRATTO DA UN CAMPIONE DI BANANA

a cura della prof.ssa Stefania Galeandro