Diagnosi di laboratorio delle anemie emolitiche autoimmuni ...

Anemie emolitiche autoimmuni:diagnostica di laboratorio e terapia trasfusionale

Diagnosi di laboratorio delle anemie

emolitiche autoimmuni

Maria Antonietta Villa

Laboratorio di Immunoematologia di Riferimento

U.O.C. Centro Trasfusionale

Fondazione IRCCS Cà Granda Ospedale Maggiore Policlinico

Diagnosi delle Anemie Emolitiche

1-2 Marzo 2018

� Le Anemie Emolitiche Autoimmuni (AEA)

comprendono un gruppo eterogeneo di

disordini del sistema immunitario

caratterizzate dalla presenza di

autoanticorpi diretti contro antigeni

eritrocitari e da un quadro clinico di emolisi

variabile nella sua gravità

AEA: definizione


1-2 Marzo 2018

� Hanno un incidenza di 1-3 casi/100.000/anno,

una prevalenza di 17/100.000 nella popolazione

generale e una mortalità compresa tra il 4-11%

� Possono insorgere dalla prima infanzia ma più

frequentemente dopo la III-IV decade di vita con

un picco compreso tra 40 e 70 anni

AEA: incidenza


1-2 Marzo 2018

Petz LD, Garratty G. Immune Hemolytic Anemias. 2004

AEA: epidemiologia

� Sulla base della presentazione sono classificate in:

• Primitive

• Secondarie

� Nel 50% dei casi sono associate ad altre patologie

50% idiopatica

20% secondarie a malattie linfoproliferative

20% secondarie a malattie autoimmuni

10% secondarie a neoplasie maligne o infezioni


1-2 Marzo 2018

� AEA da autoanticorpi caldi: (60-70% dei casi)

� AEA da autoanticorpi freddi :

• Malattie da agglutine fredde (CHD) (20-25% dei casi)

• Emoglobinuria parossistica a frigore (1-5% dei casi)

� AEA miste da autoanticorpi caldi e freddi: (3-10%)

� AEA da farmaci

� AEA con Test dell’Antiglobulina Diretto (TAD) negativo

AEA: classificazione


1-2 Marzo 2018

� Emoglobina

� Reticolocitosi

� Bilirubina totale e indiretta

� LDH

� Emoglobinemia, emoglobinuria

Diagnosi di laboratorio

STUDIO

IMMUNOEMATOLOGICO


1-2 Marzo 2018

Nel laboratorio di immunoematologia

pervengono campioni di pazienti:

� con anemia di sospetta natura

immuno-mediata

� segnalati dal reparto per mancato

incremento trasfusionale

� con patologie associate ad AEA

AEA: studio immunoematologico


1-2 Marzo 2018

Nei pazienti con sospetta AEA è

importante conoscere:

� Sintesi anamnestica con la

diagnosi del paziente

� Pregresse gravidanze/aborti

� Pregresse trasfusioni

� Principali dati di laboratorio

� Terapie in corso

Storia clinica


1-2 Marzo 2018

Nei pazienti con sospetta AEA vengono eseguite:

Indagini immunoematologiche

Indagini sugli eritrociti

Indagini sul siero


1-2 Marzo 2018

Etichettatura: secondo la norma

vigente come per i test trasfusionali,

pertanto i campioni devono essere

sempre firmati

Particolari precauzioni: nel caso si

sospetti la presenza di anticorpi di tipo

freddo il prelievo e il trasporto in

laboratorio devono avvenire sempre a

37oC

2 provette in EDTA

1 provetta di sangue in toto (siero)

� Autocontrollo a 20oC (autoagglutinazione)

� Test dell’antiglobulina diretto (TAD) o test di Coombs

diretto

� Test dell’antiglobulina indiretto (TAI) o ricerca di

anticorpi eritrocitari nel siero/plasma a 4oC, 20oC,37oC

e in AHGT

� Ricerca emolisine mono e bifasiche

� Identificazione di eventuali alloanticorpi eritrocitari

� Determinazione fenotipo eritrocitario

� Test sierologici addizionali (es. auto/alloassorbimento)

Test di laboratorio


1-2 Marzo 2018

� In genere è positivo nelle AEA da

autoanticorpi freddi ma non nelle

forme da autoanticorpi caldi

� Se l’autoagglutinazione è positiva

bisogna lavare le emazie con

fisiologica a 37oC prima di

eseguire il TAD

Autocontrollo a 20 °°°°C


1-2 Marzo 2018

� Il TAD può essere eseguito in

prima istanza con un antisiero

antiglobulina umano polispecifico

in provetta, microcolonna e fase

solida

� In caso di positività si esegue il

TAD con antisieri antiglobuline

umane monospecifici anti-IgG,

anti-C3 e/o C3c/C3d, anti-IgM ed

anti-IgA

Test dell’antiglobulina diretto (TAD)


1-2 Marzo 2018

Cause TAD positivo


1-2 Marzo 2018

� L’eluato può essere eseguito con

diverse procedure tecniche:• Glicina acida

• Congelamento-scongelamento rapido

• Calore

� L’eluato è utile per:• confermare l’autoanticorpo caldo

• escludere che il TAD non si dovuto alla

AEA ma da un alloanticorpo adeso

• verificare che non si tratti di un anemia

emolitica da farmaco

Test di eluizione


1-2 Marzo 2018

� In microcolonna

� In fase solida

� In provetta con additivo PEG/LISS

� In provetta a 4oC, 20oC, 37oC

� In provetta con preincubazione

Ricerca/Identificazione di anticorpi

AEA da autoanticorpi caldi

AEA da autoanticorpi freddi

Si possono utilizzare emazie autologhe ed

omologhe non trattate e pre-trattate con

enzimi proteolitici (papaina, ficina) ed

cellule cordonali


1-2 Marzo 2018

� TAD: positivo da IgG (IgG1-IgG3) e/o Complemento , raramente IgM e IgA

Autoanticorpi:

• di tipo caldo con una temperatura ottimale di legame a 37oC , in genere dimostrabili nel siero e nell’eluato

• reagiscono contro gli eritrociti normali, possono mostrare specificità rivolta contro determinanti antigenici degli eritrociti del paziente (di solito del sistema Rh)

• causano emolisi extra-vascolare

AEA da autoanticorpi caldi

Panreattività nei test sierologici


1-2 Marzo 2018

� TAD: positivo o negativo da Complemento

� Autoanticorpi:

• di tipo IgM con una temperatura ottimale di legame < a 30oC , in grado di attivare il complemento

• reagiscono meglio a 0o- 4oC ma a differenze delle crioagglutinine fisiologiche presentano un alto titolo a 4oC e un ampio range termico anche sino a 37oC

• presentano specificità frequentemente anti-I, talora anti-i (mononucleosi ), anti-H e anti-Pr

• causano emolisi intra-vascolare

AEA da autoanticorpi freddi

Significato clinico se optimum termico a 37oCDiagnosi delle Anemie Emolitiche

1-2 Marzo 2018

� TAD: positivo da IgG e Complemento (C3d)

� Autoanticorpi:

• di tipo caldo (IgG)

• di tipo freddo IgM: in genere a basso titolo a 4oC(<64) ma con range termico ampio

• presentano delle specificità indipendenti

• causano emolisi intra e/o extravascolare

AEA di tipo misto


1-2 Marzo 2018

� Dimostrazione della presenza nel siero della emolisina bifasica di Donath-Landsteiner

� TAD: positivo da Complemento

� Autoanticorpo:

• di tipo IgG (emolisina bifasica) in genere a specificitàanti-P

• in grado di sensibilizzare gli eritrociti a temperatura <30oC e causarne l’emolisi a 37oC

• causano emolisi intra-vascolare

AEA da Emoglobinuria Parossistica a Frigore


1-2 Marzo 2018

� Dimostrazione della presenza nel siero della emolisina bifasica di Donath-Landsteiner

� TAD: positivo da Complemento

� Autoanticorpo:

• di tipo IgG in genere a specificità anti-P,

• in grado di sensibilizzare gli eritrociti a temperatura <30oC e causarne l’emolisi a 37oC

• causano emolisi extravascolare

AEA da emolisina bifasica


1-2 Marzo 2018

� Storicamente l’α-metildopa e la penicillina sono state responsabili della maggior parte dei casi di AEA da farmaco

� Dopo gli anni 80, con la diminuzionedel loro uso, l’incidenza di questotipo di AEA da farmaco si è molto ridotta (12-18%) mentre èaumentata quella delle cefalosporinedi seconda e terza generazione(70%)

AEA da farmaco


1-2 Marzo 2018

� Assorbimento e legame del farmaco allamembrana con produzione di IgG che silegano al complesso farmaco-membrana; emolisi extravascolare; TAD positivo daIgG

� Formazione dell’immunocomplessofarmaco e anticorpo anti-farmaco(soprattutto IgM) che si attacca allamembrana eritrocitari; emolisiintravascolare; TAD positivo daComplemento

� Modifica da parte del farmaco dellamembrana del globulo rosso rendendolaantigenica; induce la produzione diautoanticorpi IgG; emolisi extravascolare; TAD positivo da IgG

Meccanismi AEA da farmaco

Arnat Immunohematology 2014;30(2):44-54


1-2 Marzo 2018

Rappresentano un problema diagnostico critico e

sono state segnalate con crescente frequenza sia

negli adulti che nei bambini (dal 10 al 20%)

� Ridotto numero di immunoglobuline adese agli

RBCs in relazione alla tecnologia utilizzata

� Bassa affinità degli autoanticorpi IgG sensibilizzanti

o dissociazione durante i lavaggi

� Autoanticorpi IgA o IgM (non rilevati se utilizzato

un reagente polispecifico)

AEA con TAD negativo


1-2 Marzo 2018

24

• Provetta: almeno 500 molecole

• Microcolonna: 200-300 molecole

• Fase solida: <100 molecole

• Citofluorimetria: <50 molecole

Intensità di reazione IgG/cellula

0 < 25-120

debole 120

1 + 200

2 + 200-500

3 + / 4 + > 500

Garratty 2005

Segel 2013

Quantità IgG e score reazione


1-2 Marzo 2018

� Lavaggio emazie con fisiologica fredda o con LISS al 65%

� Microcolonna (con antisieri monospecifici)

� Fase solida

� DUAL-DAT

� Citometria

� Mitogen Stimulation (MS-DAT)

AEA con TAD negativo

I metodi più frequentamente utilizzati sono:


1-2 Marzo 2018

Mitogen Stimulated Direct Antiglobulin Test

(MS-DAT)

� Il test viene eseguito su sangue intero (eparina) dopo stimolazione per 48 h con dei mitogeni (es.fitoemagglutinina)

� La stimolazione mitogenica determina la produzione in vitro di autoanticorpi da parte dei linfociti B e il loro successivo legame alle emazie autologhe

� La quantità di autoanticorpi adesi viene valutata mediante un test ELISA competitivo in fase solida

MS-DAT

Barcellini Br J Haematol, 2000

Barcellini Blood 2009Diagnosi delle Anemie Emolitiche

1-2 Marzo 2018

AEA e alloimmunizzazione

� Il 15-53% delle AEA presenta alloanticorpi eritrocitari in associazioneagli autoanticorpi

� Per questo motivo devono essere utilizzate delle procedure speciali: diluizione del siero, tecniche di preincubazione, assorbimento del siero, uso di reagenti tiolici (mercaptoetanolo, DDT) per escludereeventuali alloanticorpi


1-2 Marzo 2018

• descritto nel 1987 (Nance e Garratty)

• utilizzato nel 1995 (Liew e Duncan) per

autoassorbimenti e alloassorbimenti

Assorbimento autologo è la procedura ideale per rimuovere l’autoanticorpo:

� Comporta lunghi tempi di esecuzione

� Dilazione delle trasfusioni urgenti

� Non eseguibile in tutti i pazienti (es. con anemia severa o recentemente trasfusi)

PEG

Assorbimento


1-2 Marzo 2018

Barron & Brown, Immunohematology 1997;13:119-122

Cheng et al, Transfusion 2001;41:13-17

Judd & Dake, Immunohematology 2001;17:82-85

PEGTradizionale

PEG

RBC non trattati e

trattati con enzimi

Siero/plasma

Siero/plasma

RBC non trattati

Assorbimento: confronto


1-2 Marzo 2018

Vantaggi del PeG

� Facilita l’assorbimento di anticorpi

� Non richiede emazie pretrattate

� Riduce il tempo tecnico

� Precipitazione di proteine

� Perdita di alloanticorpi debolmentereattivi

Svantaggi del PeG

Vantaggi e svantaggi


1-2 Marzo 2018

Assorbimento con Peg/LISS


1-2 Marzo 2018

L’alloassorbimento è un’alternativaall’autoassorbimento nei soggetti con

AEA recentemente trasfusi (nei 3 mesiprecedenti)

• Se la tipizzazione non è nota usare

emazie selezionate

• Se la tipizzazione è nota usare emazie

identiche alla tipizzazione del paziente

Allossorbimento


1-2 Marzo 2018

� Richiede lunghi tempi

� Disponibilità di campioni idonei

� Può comportare la rimozione di anticorpi verso

antigeni ad alta incidenza

� Richiede esperienza nell’esecuzione ed

interpretazione dei test

� Deve essere ripetuto ad ogni evento

trasfusionale

Assorbimento: limiti


1-2 Marzo 2018

Nei pazienti non recentemente trasfusi i

globuli rossi possono essere tipizzati in

provetta con reagenti monoclonali o

reagenti policlonali dopo aver staccato gli

autoanticorpi dai globuli rossi con:

� Clorochina

� ZZAP (ditiotreitolo e papaina)

� Sistemi a pH variabile/gradiente di densità

� Metodi acidi a freddo

� Soluzioni di glicina-HCL-EDTA

� Acido citrico

si possono denaturare

alcuni sistemi antigenici

Determinazione fenotipo eritrocitario


1-2 Marzo 2018

� L’impiego delle tecniche di genotipizzazione ha

permesso di determinare il fenotipo eritrocitario

esteso e facilitare gli studi di assorbimento,

l’identificazione di eventuali alloanticorpi associati e

le strategie trasfusionali

� Per evitare di eseguire ad ogni evento trasfusionale

studi di assorbimento i pazienti con AEA

Si possono tipizzare all’esordio in biologia molecolare, e

per la trasfusione si possono assegnare unità

estensivamente tipizzate per gli antigeni clinicamente

significativi

AEA e biologia molecolare


1-2 Marzo 2018

Sapatnekar S Transfusion 2014

Kappler E, Transfusion 2010

� La decisione di trasfondere o meno i pazienti con AEA non dipende dai risultati delle prove di compatibilità ma essenzialmente dalle necessità cliniche del paziente

� Nella maggior parte dei casi i test pre-trasfusionali e le prove di compatibilitàhanno spesso un risultato positivo ed èdifficile escludere la presenza di eventuali alloanticorpi

� Per la trasfusione è meglio trasfondere emazie con la specificità antigenica dell’autoanticorpo piuttosto che rischiare una alloimmunizzazione eritrocitaria

AEA trasfusione si o no?


1-2 Marzo 2018

� Frequentemente utilizzato

� Identifica le unità di globuli rossi con risultati

meno positivo nella prova di compatibilità

� Può essere interpretato in modo diverso da diversi

operatori sanitari

� Non è informativo nella discussione con i clinici

Petz LD. “Least incompatible” units for transfusion in

autoimmune hemolytic anemia: should we eliminate this

meaningless term? A commentary for clinicians and transfusion

medicine professionals. Transfusion 2003

Il termine “meno incompatibile”


1-2 Marzo 2018

Shirey et al. Transfusion 2002

� Prima della trasfusione tipizzare il paziente per antigeni RH, KEL, JK, FY, MNS

• selezionare unità di emazie identiche per la trasfusione

� Per pazienti non tipizzati

• selezionare unità fenotipo compatibile, K- negative per antigeni verso i quali sono rivolti eventuali alloanticorpi

• ripetere studi con alloassorbimenti prima di ogni trasfusione

� Pazienti con tipizzazione parzialmente determinata (antigeni RH, KEL, JK) con antisieri monoclonali

• selezionare unità identiche al paziente per gli antigeni determinati e unità negative per antigeni verso i quali sono rivolti eventuali alloanticorpi

• ripetere studi con alloassorbimenti prima di ogni trasfusione

AEA: come trasfondere


1-2 Marzo 2018

Procedura AEA


1-2 Marzo 2018

• Se la ricerca di anticorpi è negativa vengono selezionate unità a fenotipo compatibile, Kell negative

• Se la ricerca di anticorpi è positiva e la trasfusione è urgente vengono selezionate unità a fenotipo compatibile, Kell negative

• Se la trasfusione si può rimandare di qualche ora eseguire l’autoassorbitoe la tipizzazione del paziente con antisieri monoclonali e selezionare unitàidentiche per gli antigeni clinicamente significativi

In soggetti non recentemente trasfusi:

In soggetti recentemente trasfusi:

• Se la ricerca di anticorpi è negativa vengono selezionate unità a fenotipo

compatibile, Kell negative con assegnazione filtro

• Se la ricerca di anticorpi è positiva e non è disponibile una tipizzazione del

paziente, nei turni notturni e festivi devono essere selezionate unità a

fenotipo compatibile, Kell negative.

• La tipizzazione genomica o eventuali alloassorbimenti mirati verranno

eseguiti durante il turno lavorativo diurno

AEA e trasfusione


1-2 Marzo 2018

� La conoscenza dell’anamnesi del

paziente, dei segni clinici e dei dati di

laboratorio può aiutare a formulare una

corretta diagnosi di AEA

� Il laboratorio di immunoematologia: deve

caratterizzare l’autoanticorpo implicato ed

escludere la presenza di eventuali

alloanticorpi eritrocitari

� Il clinico deve dire se la trasfusione è

proprio necessaria perchè una terapia

trasfusionale aggressiva potrebbe essere

gravata da complicanze

� L’immunoematologo e il clinico devono

lavorare insieme

Conclusioni


1-2 Marzo 2018

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