Determinazione degli additivi per mangimi: valutazione dei metodi di analisi disponibili

Cinzia Cinzia CivitarealeCivitareale e Maurizio Fiorie Maurizio Fiori

Istituto Superiore di SanitàLNR per gli additivi nei mangimi

III Workshop

dei LNR per Metalli Pesanti negli Alimenti e nei Mangimi e Additivi nei Mangimi

Roma, 29-30 Ottobre 2013

1. Perché controllare gli additivi/PNAA 2012-2014

2. Disponibilità metodi di analisi/banca dati EURL-FA

3. Verifica e applicabilità per il controllo ufficiale

4. Trasferimento e Armonizzazione del controllo (LNR-FA)

PERCHE’ controllare gli additivi?

REGOLAMENTO (CE) N.882/2004 relativo ai controlli ufficiali intesi a verificare la conformità alla normativa in materia di mangimi e di alimenti e alle norme sulla salute e sul benessere degli animali

“Gli Stati membri dovrebbero applicare la normativa in materia di mangimi e di alimenti e le norme sulla salute e il benessere degli animali nonché controllare e verificare il rispetto delle pertinenti disposizioni delle medesime da parte degli operatori del settore in tutte le fasi della produzione, della trasformazione e della distribuzione. A tal fine si dovrebbero organizzare i controlli ufficiali.”

“I controlli dei mangimi e degli alimenti provenienti da paesi terzi di cui alla direttiva 97/78/CE si limitano agli aspetti veterinari.Occorre integrare tali controlli con controlli ufficiali su aspetti non coperti dai controlli veterinari come ad esempio quelli relativi agli additivi, all’etichettatura, alla tracciabilità, all’irradiazione di prodotti alimentari e ai materiali a contatto con gli alimenti.

PERCHE’ controllare gli additivi?

Controllo della qualità e conformità degli alimenti per animali

� Assicurare la salute e il benessere animale

� Sicurezza del consumatore

Regolamento (EC) No 1831/2003Tra gli additivi per mangimi figurano i seguenti:� additivi tecnologici: per esempio, conservanti, antiossidanti, emulsionanti, agenti stabilizzanti, regolatori di acidità, additivi per insilaggio;

� additivi organolettici: per esempio, aromatizzanti, coloranti;

� additivi nutrizionali: per esempio, vitamine, aminoacidi, oligoelementi*;

� additivi zootecnici: per esempio, promotori della digestione, stabilizzatori della flora intestinale;

� coccidiostatici e istomonostatici*

* Inseriti in PNAA

PNAA 2012-2014La programmazione dei controlli ufficiali nella filiera alimentare

animale prevede due tipi di attività differenti (coerentemente con il Regolamento 882/2004):

“Monitoraggio”- l’attività di campionamento volta alla raccolta di dati al fine di valutare l’evoluzione di un determinato fenomeno (ex “Sorveglianza”).

“Sorveglianza” - l’attività di campionamento volta alla verifica della conformità alla normativa (ex “Vigilanza”).

PNAA 2012-2014

Programma di Monitoraggio/Sorveglianza degli additivi – NUOVI OBIETTIVI

“Si intende ribadire, visto quanto sopra riportato, che nell’ambito dei controlli ufficiali sui mangimi debbano essere inclusi, nel corso del triennio, attività di monitoraggio/sorveglianza per altre categorie di additivi (tecnologici, organolettici, zootecnici) e per altri additivi appartenenti alla categoria degli additivi nutrizionali finora non previste dai precedenti piani e dal presente.”

PNAA 2012-2014

Programma di Monitoraggio/Sorveglianza degli additivi – NUOVI OBIETTIVI

“Raccogliere indicazioni affinché si possa cominciare ad intraprendere un’attività di monitoraggio nuova rispetto a quelle definite nei piani precedenti al fine di approfondire la conoscenza nell’ambito dell’utilizzo degli additivi sul territorio e al fine di verificare la conformità dei limiti minimi e/o massimi definiti per gli additivi autorizzati nel mangime completo.”

PNAA 2012-2014Proposta Ministero della Salute inserimento dei controlli per

additivi in particolare:

Vitamine Amminoacidivitamina D L-valina, L-isoleucina, acido guanidinacetico

Promotori della digestione6-fitasi, 3-fitasi, endo-1,4-beta-xilanasi

Stabilizzatori della flora intestinaleSaccharomyces cerevisiae, Enterococcus faecium

Altri additivi zootecniciacido benzoico, sodio benzoato

Ricognizione disponibilitàmetodi

Disponibilità di metodi per il controllo degli additivi nel data base dei metodi del EURL-FA

RICHIESTA DI AUTORIZZAZIONEIl Regolamento (CE) n. 1831/2003 definisce la procedura di autorizzazione comunitariadegli additivi e prevede l’emissione di un regolamento di autorizzazione in cui sono definiti requisiti specifici (es.: composizione, specie animale di destinazione, istruzioni d’uso), la definizione di un contenuto minimo e/o massimo, nonché i metodi analitici da utilizzare nei controlli ufficiali dei mangimi.

Cosa devono contenere i fascicoli

REGOLAMENTO (CE) N. 429/2008 “Sulle modalità di applicazione del regolamento (CE) n. 1831/2003 del Parlamento europeo e del Consiglio per quanto riguarda la preparazione e la presentazione delle domande e la valutazione e l'autorizzazione di additivi per mangimi”

Cosa devono contenere i fascicoli – efficacia e sicurezza

Relazioni dettagliate sugli studi destinati a dimostrare l’efficacia e la sicurezza dell’utilizzo dell’additivo.

Cosa devono contenere i fascicoli – metodi analitici

1) Studi per stabilire l’identità e le proprietàfisico-chimiche dell’additivo nonché i metodi di determinazione quali- quantitativa atti a valutare la presenza del principio attivo nelle premiscele e nei mangimi al fine di determinare la conformità ai livelli massimi o minimi proposti.

Cosa devono contenere i fascicoli - metodi analitici� “ La descrizione dei metodi di analisi nel mangime o in acqua devono essere conformi alle norme di BPL di cui alla direttiva 2004/10/CE e/o alla norma EN ISO/IEC 17025. I metodi devono rispettare le disposizioni dell’articolo 11 del regolamento (CE) n. 882/2004 del Parlamento europeo e del Consiglio, del 29 aprile 2004”

Cosa devono contenere i fascicoli - metodi analitici

� “La caratterizzazione dettagliata dei metodi include le caratteristiche appropriate di cui all'allegato III del Regolamento (CE) n. 882/2004.”

� “I metodi proposti devono essere convalidati da parte del richiedente mediante ring test o se validati in house devono essere verificati da un secondo laboratorio indipendente accreditato.”

Cosa devono contenere i fascicoli- metodi analitici

2) Metodi analitici qualitativi e quantitativi per la determinazione dei residui marcatori del principio attivo nei tessuti bersaglio e nei prodotti di origine animale. Dati e metodologia di convalida (recupero, specificità, accuratezza, precisione, limite di rivelazione, limite di quantificazione).

I relativi limiti di quantificazione dei metodi proposti devono essere inferiori dei LMR

VALUTAZIONE METODIEURL-FALa valutazione critica dei metodi di analisi proposti, viene effettuata dal Centro Comune di Ricerca della Commissione (European Commission’s Joint Research Centre – JRC, Geel, Belgio) nominato EURL-FA e assistito dal Consorzio di LNR (REGOLAMENTO (EC) N. 378/2005 emendato dalREGOLAMENTO (EC) N. 885/2009)

Responsabilità del EURL -FA (REGOLAMENTO (EC) N. 1831/2003)

� Ricevimento, preparazione, immagazzinaggio e mantenimento dei campioni di controllo;

� Valutazione dei dati forniti dal richiedente l’autorizzazione onde valutare, testare, o convalidare il metodo di rilevazione;

� Presentazione di relazioni valutative complete all’EFSA.

Responsabilità del EURL -FA (REGOLAMENTO (EC) N. 885/2009)

La relazione di valutazione deve comprendere:

� Una valutazione indicante se i metodi di analisi integrati nei dati presentati nella domanda sono adatti per essere utilizzati nei controlli ufficiali;

� L'indicazione se la sperimentazione di un metodo di analisi è considerata necessaria;

� L'indicazione se una convalida di un metodo di analisi tramite studio di intercomparazione èconsiderata necessaria.

European Union Register of Feed

Additives pursuant to Regulation

(EC) No 1831/2003List of additives

(Released 27.08.2013)

Sito web:

http://ec.europa.eu/food/food/animalnutrition/feedadditi

ves/comm_register_feed_additives_1831-03.pdf

1. Data base EURL-FA

Portale Joint Research Center – Institute forReference Materials and Measurement(IRMM)

http://irmm.jrc.ec.europa.eu/

1 EU Reference Laboratories

2 EURL feed additives

3 Method database

2. Data base EURL-FA

Se vado su:1 Authorisation2 Evaluation reports

Trovo l’elenco dei FAD (Food Additive Dossiers) – report di valutazione dei metodi analitici proposti per determinare la sostanza attiva nell’additivo, nelle premiscele, nei mangimi e in acqua (se pertinente) nonché i residui e/o i metaboliti negli alimenti.

Metodi proposti dalle Ditte

� Additivi proposti dal Ministero della Salute

1. Che tipo di metodi sono comunemente proposti (Ufficiali o sviluppati ditta)?

2. Rispondono ai requisiti di un metodo per il controllo ufficiale (allegato III Reg. 882/2004/CE) ?

Vitamina D3

3a vitamine e provitamineUso: mangime/acqua 0,05-0,250 mg/kg. Tutte le specie animali e categorie

Registro: 0,05 - 0,1 mg/kgN.1 Dossier valutato dal CRL – Metodi raccomandati per mangimi e premiscele

� Premiscele: HPLC-UV 265 nm – VDLUFA* 1997, Method 13.8.1

� Mangime: HPLC-UV 265 nm – VDLUFA 1997, Method13.8.1; RP-HPLC-UV 265 nm – EN 12821

� Acqua: RP-HPLC-UV 265 nm – EN 12821 (matrice: latte a bassa percentuale di grassi)

Entrambi validati mediante ring-trial e LOQ 0.025 mg/kg

*VDLUFA: Association of German Agricultural Analytic and Research Institutes

Metodo ufficiale nazionale

MINISTERO DELLE POLITICHE AGRICOLE ALIMENTARI E FORESTALI

Approvazione del metodo ufficiale di analisi per la determinazione del contenuto di vitamina D 3

negli alimenti per gli animali

(Decreto 17 luglio 2012,Gazzetta n. 180 del 3 agosto 2012 )

Metodo HPLC-RP - LOQ 2000 UI/Kg (equiv. 0,05 mg/kg)

L-valina 3c aminoacidi, loro sali e analoghiUso: mangime 2500 - 3000 mg di L-valina totale/kg. Tutte le specie

animali. L’inclusione del prodotto nel mangime dipende dalla concentrazione di

L-valina naturalmente presente nella componente del mangime.Registro: rimanda ad regolamento di autorizzazione in cui non ci sono

indicazioni di min/maxN. 4 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di

microrganismo produttore) – Metodi raccomandati per mangimi e premiscele

� Commission Regulation (EC) No 152/2009� EN ISO 13903:2005 standard method (Animalfeedingstuffs – determination of amino acids content) (HPLC-VIS) (validazione mediante ring-trial del metodo in Reg. EC 152/2009)

Tecnica: Analizzatore di aminoacidi o HPLC scambio ionico - 570 nm (derivatizzazione post colonna con ninidrina)

Nota: Il metodo è applicabile per la determinazione di L-valina libera e totale (sintetica e naturale) – non distingue tra le forme L- e D-né tra L-valina aggiunta o naturalmente presente

L-isoleucina 3c aminoacidi, loro sali e analoghiUso: l’inclusione del prodotto nel mangime dipende dalla concentrazione

di L-isoleucina naturalmente presente nella componente del mangime e dalle richieste nutrizionali delle differenti specie animali.

Registro: rimanda ad regolamento di autorizzazione in cui non ci sonoindicazioni di min/max

N.1 Dossier valutato CRL – Metodi raccomandati per mangimi e premiscele:

� Commission Regulation (EC) N. 152/2009� EN ISO 13903:2005 (validazione mediante ring-trial del metodo in

Reg. EC 152/2009) Tecnica: Analizzatore di aminoacidi o HPLC scambio ionico 570 nm

(derivatizzazione post colonna con ninidrina)Nota: Il metodo è applicabile per la determinazione di L-isoleucina

libera (sintetica e naturale) e totale (libera e legata in formapeptidica) – non distingue tra le forme L- e D- né tra L-isoleucinaaggiunta o naturalmente presente

� Method AOAC 999.13 � VDLUFA method 4.11.6 (Association of German Agricultural

Analytical Research Institues)Nota: i due metodi consentono la determinazione quantitativa di aminoacidi liberi.

Acido guanidinacetico

3c aminoacidi, loro sali e analoghi

Uso: 600 – 1200 mg/kg mg di sostanza attiva/kg di mangime completo (tutte le specie).

Registro: 600 mg/kg min/max (polli da carne)N.2 Dossier valutati CRL – Metodi raccomandatiper mangimi e premiscele: � metodo validato in house e verificato da un secondo lab. Tecnica: cromatografia ionica con rivelazione UV (IC-UV)

- LOQ 55 mg/kg

6-fitasi 4a promotori della digestioneUso: concentrazione variabile a seconda della specie e della

formulazione (incluso microorganismo produttore). Avicoli e suiniRegistro: solo tenore minimo 100 – 500 FTU (unità di attività)/kg mangime completo600 – 1500 FYT/kg mangime completo250 PPU/kg mangime completo125-250 OTU/kg mangime completo

N.11 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione)

Metodi raccomandati per mangimi e premiscele: � EN ISO 30024:2009 Tecnica: misura dell’attivitàenzimatica (quantità di enzima che rilascia 1µmol di fosfato inorganico dal fitato al minuto in condizioni definite) mediante metodo colorimetrico.

Fitato: sale dell’acido fitico (chim.: mio-inositolo esafosfato - riserva di fosforo nei vegetali)

3-fitasi 4a promotori della digestioneUso: concentrazione variabile a seconda della specie e della formulazione (incluso microorganismo produttore). Avicoli e suini

Registro: 250 – 350 RPU (unità di attività)/kg mangime completo

N.3 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione)

Metodi raccomandati per mangimi e premiscele:� 27.1.1 VDLUFA-Methodenbuch III, 4. Erg. 1997 -metodo validato mediante ring-trial

� Metodo validato in houseTecnica: misura dell’attività enzimatica (quantità di enzima che rilascia 1µmol di fosfato inorganico dal fitato al minuto in condizioni definite) mediante metodo colorimetrico

Endo-1,4-beta-xilanasi 4a promotori della digestione/1k 1 enzimi

Uso: concentrazione variabile a seconda della specie e della formulazione (incluso microorganismo produttore). Avicoli e suini

Registro: Differenti autorizzazioni/differenti unità di attività

N. Circa 20 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione) alcune formulazioni in associazione con altri enzimi

Metodi raccomandati per mangimi e premiscele:� Differenti Metodi validati in house e verificati da un secondo lab.

Tecniche: misura dell’attività enzimatica (espressa in unitàdiverse – dipende dalle condizioni operative) mediante metodo colorimetrico; metodo viscosimetrico (unità di concentrazione espressa in unità diverse – dipende dalle condizioni operative).

Saccharomyces cerevisiae1k2-microorganismi/4a promotori della digestione/4b stabilizzatori della flora intestinaleUso: concentrazione variabile a seconda della specie.Suini, conigli, cavalli.

Registro: varie autorizzazioni tenori espressi in CFU/kg mangime completo

N. 8 Dossier valutati CRL (diversi per ceppo di lievito produttore)

Metodo raccomandato per mangimi e premiscele:� EN 15789:2009 (Enumerazione del microorganismo) Tecnica: Enumerazione: conta su piastraIdentificazione del ceppo: reazione a catena della polimerasi (PCR)

Enterococcus faecium1k2-microorganismi /4b stabilizzatori della flora intestinaleUso: concentrazione variabile a seconda della specie.Avicoli da carne, bovini, suini, cani e gatti

Registro: diverse autorizzazioni per ceppo di Enterococcus faecium

N. 11 Dossier valutati CRL (diversi per specie e ceppo di microrganismo produttore e per tipologia di formulazione) alcune formulazioni in associazione con altri microorganismi

Metodo raccomandato per mangimi e premiscele:� EN 15788 (Enumerazione del microorganismo) Tecnica: Enumerazione: conta su piastraIdentificazione del ceppo: elettroforesi su gel in campo pulsato (PFGE)

Acido benzoico1j regolatore di aciditàUso: 1) 106,25 - 125 mg/kg (avicoli); 2) 5 g/kg (suinetti); 3) 250-375 mg/kg avicoli

Registro: suini da ingrasso 5000 – 10000 mg/kg mangime completo

N. 3 Dossier valutati CRL – Metodi raccomandati per mangimi e premiscele:

� 1) Metodo validato in house e verificato da un secondo lab. (HPLC-UV) – LOQ 10 mg/kg

� 2)Adattamento di ISO 9231:2008 – benzoic acid in milk and milk products (HPLC-UV) (verifica dell’applicabilità al mangime in house) - LOQ 0,5 g/kg

� 3) Metodo validato in house e verificato da un secondo lab. (GC-IDMS) – LOQ 85 mg/kg

Sodio benzoato 1a conservanti (antimicrobico)Uso: additivo per conservazione dell’insilato e del mangime (tutte le

specie);differenti formulazioni/ differenti dosaggi mangimi e insilato (da

3000 a 22000 mg/kg)Registro: 3000 - 22000 mg/kg cereali

N. 3 Dossier valutati CRL – Metodi raccomandati per mangimi e premiscele:

� Metodo validato in house e verificato da secondo lab. (HPLC-UV)� Metodo validato mediante ring-tial (HPLC-RI (indice di

rifrazione)/UV) � Metodo validato in house (HPLC-UV) dall’Agenzia per la Salute e

Sicurezza Alimentare (AGES) - Austria

Insilato: CRL-FA non raccomanda alcun metodo per il controllo ufficiale a causa delle intrinseche proprietà della matrice insilato

CONSIDERAZIONI:� Accesso alla Banca Dati (accesso alla documentazione riservata);

� Scelta del metodo: criteri (es.: Vitamina D3 metodo normato; acido benzoico vari metodi sviluppati in house);

� Validazione metodo scelto e armonizzazione dei controlli per gli additivi per cui non sono disponibili metodi ufficiali (LNR);

� Numero elevato di additivi - come scegliere gli additivi da controllare (tenori min/max definiti; tecnica analitica – chimico/biologico; rischio associato; esigenze specifiche)?

GRAZIE PER

L’ATTENZIONE