Citosc Microf BUSB stud · 2012-04-25 · alla membrana plasmatica: La maggiore concentrazione di...

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Citoscheletro ‐Microfilamenti

BUSB

PROPRIETA’ DEI MICROTUBULI, FILAMENTI INTERMEDI E FILAMENTI DI ACTINA

Da G. Karp, BIOLOGIA CELLULARE E MOLECOLARE, 3a ed, CORRETTA

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Microfilamenti _ 1I filamenti di actina (noti anche come microfilamenti) consistono di subunità della proteina actina collegate in polimeri formati da filamenti doppi attorcigliati come una corda. ‐‐‐‐ LEGAMI NON‐COVALENTI

Essi hanno un diametro di circa 5‐10 nm, sono dotati di grande flessibilità e formano una grande diversità di reti bi‐ o tri‐dimensionali.

Microfilamenti _ 2

Anche se i filamenti a base di actina si possono trovare quasi dappertutto nella cellula, essi spesso si concentrano nelle zone spigolose della cellula, appena sotto la membrana plasmatica. In questa sede essi possono irrigidire i contenuti liquidi del citoplasma, formando la corteccia cellulare, spesso dando alla membrana plasmatica delle cellule animali la loro forma caratteristica:

Estensioni sottili, appuntite: MICROSPINELamelle: LAMELLIPODIPieghe o infossature della membrana plasmatica, simili a quelle che si formano durante la divisione cellulare (citochinesi)

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Corteccia cellulare

http://www.basic.northwestern.edu/g‐buehler/glossary.htm

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Monomero di α‐actina _1

http://www.med.upenn.edu/dominguez/Gallery.html

La molecola di actina è ripiegata in due domini che sono stabilizzati dal legame con un nucleotide adeninicoche si inserisce fra di essi.Il polipeptide di 375 residui si incrocia due volte fra i due domini, con i N‐ e C‐terminali localizzati vicino uno all’altro.I due domini sono ripiegati in modo simile, suggerendo che il gene dell’actina è sorto per duplicazionedi un gene ancestrale.

La struttura dei filamenti di actina

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La molecola di actina ‐ 2

L’actina si lega all’adenosina trifosfato (ATP) o all’adenosina difosfato (ADP) ed a un catione divalente, Ca2+ o Mg2+, con affinità nanomolare.L’affinità dell’actina per l’ATP è maggiore che per l’ADP, e così, data la maggiore concentrazione di ATP nelle cellule, l’actina non polimerizzata è satura di ATP.Il nucleotide legato viene scambiato molto lentamente con il nucleotide del mezzo.Proteine che legano i monomeri di actina possono inibireoppure accelerare lo scambio di nucleotidi.Il nucleotide legato stabilizza la molecola ma non è necessario per la polimerizzazione in vitro.L’ATP‐actina e la ADP‐actina polimerizzano con velocità diverse.

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L’intrappolamento dell’ADP in un filamento di actina

Una molecola di actina ha una struttura che è correlata a quella dell’enzima ubiquitario esochinasi, con domini che sono imperniati attorno al sito di legame con l’ATP. L’ATP legato viene idrolizzato ad ADP immediatamente dopo che la molecola viene incorporata nel filamento di actina. Affinchè l’ADP sia sostituito con ATP, il cardine dovrebbe aprirsi. Ma nel filamento di actina i due domini di ogni molecola di actina sono trattenuti da interazioni con le subunità vicine, che quindi mantengono il cardine chiuso e intrappolano l’ADP nel filamento di actina finchè il filamento non depolimerizza.

Actina: Polimerizzazione

http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/actin

Assemblaggio e disassemblaggio dei microfilamenti (1)

Prima di potere essere incorporata in un filamento, una molecola di actina globulare lega una molecola di ATP.La molecola di actina è una ATPasi (come la tubulina è

una GTPasi).L’ATP associata al monomero di actina viene idrolizzata ad ADP in un momento successivo alla sua incroporazione nel filamento in crescita.Perciò la maggior parte del filamento di actina consiste di subunità di actina‐ADP.

BUSB2011 ‐Microfilamenti completo 12

Polimerizzazione dell’actina

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Assemblaggio e disassemblaggio dei microfilamenti (2)

La fase iniziale della polimerizzazione avviene lentamente perchè ha bisogno che si formino piccoli aggregati di subunità che fungono da innesco per la polimerizzazione – fase di nucleazione.La fase seguente di allungamento avviene molto rapidamente.Una delle estremità del filamento ha maggiore affinità per le subunità e le incropora ad una velocità 5‐10 volte superiore (estremità «più») rispetto all’altra subunità (estremità «meno»).Mediante «decorazione» con teste (frammento S1) della proteina motore miosina si vede che l’estremità sfrangiata (a barbigli; «più») è l’estremità a crescita più rapida, mentre l’estremità «appuntita» è quella a crescita lenta)

La sequenza teporale della polimerizzazione dell’actina in provetta. (A) La polimerizzazione inizia quando si aumenta la concentrazione salina in una

soluzione di subunità di actina pura.(B) In questo caso la polimerizzazione inizia nello stesso modo, ma invece di

monomeri di actina si aggiungono frammenti preformati che agiscono come nuclei di polimerizzazione per la crescita dei filamenti.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26862/figure/A2965/

Schema dell’assemblaggio dell’actina in vitro. Tutte le subunità arancione appartengono al filamento preformato originario, mentre le rosse erano presenti in soluzione all’inizio dell’incubazione. Quando la concentrazione di monomeri ha raggiunto uno stato stazionario le unità vengono aggiunte all’estremità «più» alla stessa velocità con cui vengono rilasciate dall’estremità «meno». Perciò le subunità «filano» («treadmilling») attraverso il filamento in vitro. (N.B. Non sono evidenziate le subunità che legano ATP da quelle che legano ADP).

Estremità +Estremità ‐

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Estremità appuntite (‐) e a barbigli/sfrangiate (+)

Un filamento di actinadecorato con teste di miosina. (Sinistra): Fotografia al microscopioelettronico. (Destra) I frammenti di testa di miosina producono il pattern a testa di freccia visibili nella fotografia al microscopio

Mathews et al: Biochemistry, 3rd Ed., Addison‐Wesley Publishing Co

o estremità sfrangiata

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“Treadmilling”

Processo mediante il quale un monomero incorporato in una estremità di filamenti di F‐actina per polimerizzazione si muove lungo il filamento finchè non viene alla fine perso dall’altra estremità per depolimerizzazione. Esiste un equilibrio fra la polimerizzazione ad un’estremità (dipendente dalla concentrazione di monomeri liberi) e la depolimerizzazione dall’altra estremità (forse anche essa dipendente dalla concentrazione di monomeri liberi [att.ne: sembra in contradizione con Cooper]).

Questo cambiamento di posizione delle estremità in crescita e in accorciamento dei filamenti di actina permette un certo grado di flessibilità nella forma e posizione delle reti di filamenti di actina all’interno di una cellula)

ActinaProteine associate

(incluso proteine motore)20

PROTEINE CHE LEGANO L’ACTINA

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Proteine che inducono la formazione di fasci di actina

I filamenti di actina possono formare due tipi di fascimediante l’azione di proteine diverse:

La fimbrina ha due domini di legame con l’actina adiacenti (ABD; “actin‐binding domains”) e induce la formazione di legami crociati nell’actina producendo fasci paralleli impacchettati molto strettamente in cui i filamenti sono distanziati di circa 14 nm.Vice versa, i due domini separati di legame

con l’actina dei dimeri dell’ α‐actininaformano legami incrociati nei filamenti di actina tali da produrre fasci contrattili distanziati in modo più lasso in cui i filamenti sono separati da circa 40 nm.Sia la fimbrina che l’ α‐actinina contengono

due domini correlati di legame con il Ca2+, e l’ α‐actinina contiene quattro domini distanziatori (“spacer”) ad α‐elica.




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Frammentazione e incappucciamento


Actina

Formazione di fasci e gel


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BUSB2011 ‐Microfilamenti completo 30

Microfilamenti

Nucleazione

Nucleazione dei microfilamentiMentre la nucleazione dei microtubuli avviene nella profondità del citoplasma, quella dell’actina ha luogo frequentemente sulla o vicino alla membrana plasmatica:

La maggiore concentrazione di actina nella maggior parte delle cellule si trova alla periferia cellulare: CORTECCIA CELLULARE.

Qui i filamenti di actina determinano la forma e i movimenti della superficie cellulare:

MicrovilliFilopodiLamellipodi, ecc.

Microfilamenti _ Nucleazione

La posizione dei filamenti di actina nella corteccia e la loro direzione è controllata di piccoli “siti di nucleazione” sulla membrana stessa. Siti diversi e zone differenti della membrana organizzano i filamenti di actina in modi diversi e la corteccia complessivamente è molto sensibile a segnali esterni che arrivano sulla superficie esterna della membrana plasmatica.

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Nucleazione dei filamenti di actina ‐1

• La nucleazione spontanea di nuovi filamenti a partire dai monomeri di actina è intrinsecamente sfavorevole e ulteriormente inibita dalla profilina, quindi le cellule usano fattori di nucleazione per specificare dove e quando si formano i nuovi filamenti:– Formine– Complesso Arp2/3– Spire

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Nucleazione – 3(Pollard et al., 2° ed)

Segnali esterni frequentemente regolano la nucleazione dei filamenti di actina sulla membrana plasmatica, permettendo alla cellula di cambiare la sua forma e rigidità rapidamente in risposta a cambiamenti dell’ambiente esterno. La nucleazione può essere catalizzata da diversi tipi di fattori di regolazione:

Complesso ARPFormine

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Complesso di nucleazione ARP(Alberts, 5° ed.)

Complesso proteico che include due “Actin‐related proteins” (Arps) ciascuna delle quali ha un’omologia di circa 45% rispetto all’actina.Il complesso ARP (o complesso Arp 2/3) nuclea la crescita dei filamenti a partire dall’estremità (‐), permettendo un rapido allungamento dell’estremità (+).Il complesso può inoltre collegarsi lateralmente ad un altro filamento di actina così costruendo una sorta di ragnatela di filamenti di actina.Negli animali, il complesso ARP è associato a strutture sul fronte di avanzamento delle cellule migratorie.

E’ localizzato in regioni a rapida crescita dei iflamenti di actina (es. Lamellipodi).Molecola di segnalamento intracellulare e componenti della faccia citoslica della membrana plasmatica regolano la sua attività di nucleazione.

L’attivazione regolata del complesso ARP nelle cellule animali tende a portare alla formazione di reti ramificate di actina, formando una struttura gelificata.

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Formine(Alberts, 5° ed.)

Grande famiglia di proteine dimeriche (circa 15 formine distinte nel genoma del topo).Ogni subunità delle formine ha un sito di legame per il monomero di actina e il dimero di formina sembra nucleare la polimerizzazione catturando due monomeri.Man mano che i filamenti nucleati crescono il dimero di formina rimane associatoall’estremità (+) in rapida crescita, ma sempre permettendo il leagame di nuove subunità a quella estremità per allungare il filamento.

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http://jcb.rupress.org/content/172/4/486.full.pdf+html 37

Firat‐Karalar EN, Welch MD. New mechanisms and functions of actin nucleation. Curr Opin Cell Biol. 2011

Feb;23(1):4‐13.

Firat‐Karalar EN, Welch MD. New mechanisms and functions of actin nucleation. Curr Opin Cell Biol. 2011 Feb;23(1):4‐13. Firat‐Karalar EN, Welch MD. New mechanisms and functions of actin nucleation. Curr Opin Cell Biol. 2011 Feb;23(1):4‐13.

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Firat‐Karalar EN, Welch MD. New mechanisms and functions of actin nucleation. Curr Opin Cell Biol. 2011 Feb;23(1):4‐13.

MICROVILLIMicrofilamenti

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26809/figure/A3025/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9908/figure/A1776/

Organization of microvilliThe core actin filaments of microvilli are crosslinked into closely packed bundles by fimbrin and villin. They are attached to the plasma membrane along their length by lateral arms, consisting of myosin I and calmodulin. The plus ends of the actin filaments are embedded in a cap of unidentified proteins at the tip of the microvillus.

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Proteine associate all’actina

Proteine motore

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Miosine ‐ a

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Miosine ‐ b

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Miosine, cMov_2

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Struttura della miosina II (1)

La miosina II è il motore molecolare che genera la forza nei vari tipi di tessuti muscolari ed anche in una varietà di processi non muscolari quali la citocinesi.Tutte le molecole di miosina II contengono una coda lunga, a forma di bastoncello, con attaccate ad una estremità due teste globulari.

La miosina II è la proteina motore che costituisce i filamenti spessi dei muscoli striati

Univ Arapaho

Struttura della miosina II (2)

Le teste sono il sito di legame con i filamenti di actina, idrolizzano l’ATP e subiscono i cambiamenti conformazionali richiesti per la generazione di forza.Il colo probabilmente agisce come il braccio di una leva che amplifica i cambiamenti conformazionali della testa.Le code fibrose mediano l’assemblaggio della miosina in filamenti bipolari.La maggior parte delle miosine non convenzionali ha una sola testa e domini di coda variabile ed è impegnata nella motilità cellulare e nel trasporto di organelli.

Actina

Contrazione muscolare

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Il tessuto muscolare scheletrico è composto da fasci di cellule muscolari multinucleate, o miofibre. Ogni cellula muscolare ha un citoplasma infarcito di fasci di filamenti di actina e di miosina organizzate in miofibrille che si estendono per tutta la lunghezza della cellula.Organizzati sequenzialmente si trovano catene di sarcomeri, le unità funzionali della contrazione. L’organizzazione interna dei filamenti dà alle cellule muscolari la tipica morfologia striata.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21670/figure/A5200/?report=objectonly

Struttura generale del muscolo scheletrico

Muscolo scheletrico

E’ composto da una disposizioneordinata di actina e miosina

I filamenti spessi sono di miosina II myosin III filamenti sottili sono di actinafilamentosa

Il sarcomero è una unità funzionaleche si ripete:

Bande A e zona H zone (miosina)Bande I e disco Z (actina)

Ogni filamento spesso contienecentinaia di molecole di miosina

Le singole molecole di miosina sono raggruppate mediante legami di idrogeno e interazioni idrofobiche

Univ Arapaho

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Sarcomero(dal Greco sárx = “carne", méros = "parte")

I sarcomeri danno ai muscoli cardiaco e scheletrico la loro apparenza striata tipica.Un sarcomero è definito come il segmento fra due linee Z vicine (dischi Z; dal Tedesco "Zwischenscheibe", il disco fra le bande I). In microscopia elettronica pappare come una serie di bande scure.Attorno alla linea Z vi è la banda I (da isotropica).Dopo la banda I c’è la banda A (da anisotropica). Così designata dalla sue proprità al microscopio polarizzatore.All’interno della banda A vi è una zonas più chiara, la banda H (dal Tedesco “heller”, più chiara). Finalmente, all’interno della zona H vi è una sottile linea M (dal Tedesco "Mittelscheibe", il disco mezzo al sarcomero) formato da elementi che intercollegano gli elementi del citoscheletro.

Contrazione

I filamentispessi di miosina e ifilamenti sottilidi actinascivolano unosull’altro


Uni Texas


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The titin‐nebulin filament system stabilizes the alignment of thick and thin filaments in skeletal muscle(a) A titin filament attaches at one end to the Z disk and spans the distance to the middle of the thick filament. Thick filaments are thus connected at both ends to Z disks through titin. Nebulinis associated with a thin filament from its (+) end at the Z disk to its (−) end. The large titin and nebulin filaments remain connected to thick and thin filaments during muscle contraction and generate a passive tension when muscle is stretched. (b) To visualize the titin filaments in a sarcomere, muscle is treated with the actin‐severing protein gelsolin, which removes the thin filaments. Without a supporting thin filament, nebulincondenses at the Z disk, leaving titinstill attached to the Z disk and thick filament.


Calcio

La contrazione muscolare è scatenata da un aumentodel Ca2+ citosolico(proveniente dai depositiintracellulari di Ca2+all’interno del reticolosarcoplasmatico)

Controllo della contrazione del muscolo scheletrico da parte della troponina

(A) Un filamento sottile di una cellula di muscolo scheletrico, mostrando le posizioni della tropomiosina e della troponinalungo il filamento di actina. Ogni molecola di tropomiosina ha sette regioni regolarmente distanziate con sequenze simili di aminoacidi; si ritiene che ciascuna di queste si leghi ad una subunità di actina nel filamento. (B) Un filamento sottile illustrato trasversalmente, che illustra il modo come si pensa che il Ca2+ (legato alla troponina) rilasci il blocco della troponina dall’interazione fra actina e testa della miosina.

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http://www.colorado.edu/intphys/Class/IPHY3430‐200/image/12‐3f.jpg


Actina

Citocinesi, citodieresi

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Citocinesi


Dopo il completamento dellamitosi (divisionenucleare) un anello contrattile, che consiste in filamenti di actina e miosina II divide la cellulain due.

Uni Texas

LISTERIA MONOCYTOGENES: UN BATTERE CHE SFRUTTA LA POLIMERIZZAZIONE DELL’ACTINA PER INVADERE LA CELLULA EUCARIOTICA


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The actin‐based movement of Listeria monocytogeneswithin and between host cells(A) These bacteria induce the assembly of actin‐rich tails in the host cell cytoplasm, which enable them to move rapidly. Motile bacteria spread from cell to cell by forming membrane‐enclosed protrusions that are engulfed by neighboring cells. (B) Fluorescence micrograph of the bacteria moving in a cell that has been stained to reveal both bacteria and actin filaments. Note the comet‐like tail of actin filaments (green) behind each moving bacterium (red). Regions of overlap of red and green fluorescence appear yellow.

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Actina

Strisciamento cellulare(“Cell crawling”)

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Filamenti di actina e movimento cellulare

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Strisciamento cellulare

Il movimento di striscimento di una cellula lungo unasuperficie può essere visto come tre stadi di movimenticoordinati: (1) estensione del fronte di avanzamanto, (2) legame del fronte di avanzamento al substrato, e (3) retrazione dell’estremità posteriore verso il corpocellulare.(Cooper)

http://www.biophysik.uni‐bremen.de/radmacher/research/cellmigration.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26809/figure/A3032/ 88

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89http://www.nsf.gov/news/mmg/media/images/actin_macrophage_h.jpg 90

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