ESERCITAZIONI BUSB 2012

Reagenti selettivi per i mitocondriI marcatori usati per studiare il potenziale di membrana sono carichi positivamente; perciò si accumulano nell’interno elettronegativo del mitocondrio. Modificazioni del potenziale di membrana possono essere misurate mediante diversi tipi di tecniche in fluorescenza quali la citofluorometria a flusso e l’imaging della fluoresccenza. I reagenti selettivi per i mitocondri permettono ai ricercatori di saggiare l’attività, localizzazione e abbondanza dei mitocondri, nonché di monitorare gli effetti di agenti farmacologici, quali gli anestetici o sostanze ossidanti che alterano la funzione mitocondriale.

1) Esempio di fluorocromo selettivo per i mitocondri

JC-1

http://products.invitrogen.com/ivgn/product/M34152

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Analysis/Flow-Cytometry/Cell-Health-and-Viability-Assays-for-Flow-Cytometry/Apoptosis-Assays-for-Flow-Cytometry/JC-1-Dye-Mitochondrial-Membrane-Potential-Probe.html#details

Formula chimica: 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (CAS Name/Number: 1H-Benzimidazolium, 5,6-dichloro-2-[3-(5,6-dichloro-1,3-diethyl-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-ylidene)-1-propenyl]-1,3-diethyl-, iodide). C25H27Cl4IN4

PM: 652.23

Il JC-1 penetra nel citosol delle cellule eucariotiche ed esibisce un accumulo dipendente dal potenziale nei mitocondri, che è indicato da un spostamento di emissione di fluorescenza dal verde (~529 nm) al rosso (~590 nm). Perciò, la depolarizzazione è indicata da una diminuzione del rapporto di intensità rosso/verde.

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Fluorescence SpectraJC-1/pH 8.2:

Spettri di assorbimento ed emissione di fluorescenza (eccitata a 488 nm) del JC-1 in tampone a pH 8.2 contenente 1% (v/v) DMSO.

Studiare la “salute” dei mitocondri Il fluorocromo JC-1, lipofilico e quindi permeabile attraverso le membrane, è ampiamente usato in studi sull’apoptosi per monitorare la “salute” dei mitocondri. Il JC-1 esibisce un accumulo nei mitocondri dipendente dal potenziale di membrana, indicato da uno spostamento dello spettro di emissione di fluorescenza dal verde (~529 nm) al Rosso (~590 nm). Perciò, la depolarizzazione del potenziale è indicata da una diminuzione del rapporto di intensità di fluorescenza rosso/verde. Questo spostamento di emissione sensibile al potenziale è dovuto alla formazione dipendente dalla concentrazione di aggregati accatastati (aggregati J) che emettono nel rosso.

Aggregati J

Un aggregato J è un tipo di colorante che una banda di assorbimento che si sposta verso una lunghezza d’onda superiore (spostamento batocromico) e si restringe (aumentato coefficiente di assorbimento) quando si aggrega sotto l’influenza di un solvente o di una sostanza aggiunta o della concentrazione come risultato di auto-organizzazione sopramolecolare. Il colorante può essere ulteriormente caratterizzato da un piccolo “Stokes shift” con una banda più stretta. Il J si riferisce alla persona, E.E. Jelley, che ha scoperto il fenomeno nel 1936. (http://en.wikipedia.org/wiki/J-aggregate)

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Figura. Attuale modalità per misurare il ΔΨm. Il colorante JC-1 è stato un "golden standard" per la misura del ΔΨm durante la scorsa decade. Il colorante è catturato dalle cellule e si accumula specificamente all’interno dei mitocondri a causa della sua natura lipofilica e cationica in proporzione all’intensità del ΔΨm. Nei mitocondri normali la fluorescenza del JC-1 si sposta da 527 nm a 590 nm quando forma aggregati. Questo rapporto dei fluorescenza verde vs fluorescenza rossa con eccitazione a 488 nm è usato per rivelare modificazioni di ΔΨm. http://lcbim.epfl.ch/research

La versatilità del fluorocromo JC-1

Il JC-1 può essere usato come indicatore del potenziale mitocondriale in molti tipi cellulari diversi, incluso miociti e neuroni, nonché in tessuti intatti e mitocondri isolati. Il JC-1 è più specifico per il potenziale di membrane dei mitocondri che non per quello della membrana plasmatica e più consistente nella risposta alla depolorizzazione di altri coloranti cationici quali il DIOC6(3) e la Rodamina 123. Il rapporto fra l’intensità di fluorescenza rosso/verde dipende soltanto dal potenziale di membrane e non da altri fattori quail le dimensioni forma o densità dei mitocondri, che possono influenzare segnali di fluorescenza con una solo componente. L’uso di rivelatori raziometrici permette quindi ai ricercatori di fare misure comparative del potenziale di membrana e determinare la percentuale di mitocondri in una popolazione che risponde ad uno stimolo applicato.

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TECNICA CHE ADOPEREREMO

• Fluorocromo: JC-1 (Invitrogen), diluito nel terreno di coltura delle cellule HeLa: (concentrazione finale 10g/ml).

• Incubare le cellule in termostato a 37°C, al buio, per 15 min, con 5% CO2.

• Lavaggio in PBS

• Montare il vetrino copri-oggeti in cui sono state coltivate le cellule incubate col JC-1 con PBS e osservarlo immediatamente al microscopio in fluorescenza (ecc: Blu (488 nm)). I mitocondri con elevato potenziale di membrana mostreranno fluorescenza rossa, dovuta alla formazione di aggregati J e quelli con minore potenziale fluorescenza contengono i monomeri di JC-1 e fluorescono nel verde.

L’immagine mostra mitocondri colorati con JC-1 in una cellula normale (panel a sinistra) e il collasso del potenziale di membrane indotto dal perossido di idrogeno in cellule NIH-3T3 (A: stato basale; B: dopo aggiunta di Perossido di idrogeno).

http://www.med.unipg.it/imagelab/mitoch.html

Trattamento ossidante (perossido di idrogeno; H2O2):

• Con il vetrino sotto il microscopio si mette una goccia di acqua ossigenata fra il vetrino copri-oggetti in cui sono state coltivate le cellule e quello porta-oggetto. Si osservano al microscopio le alterazioni dell’emissione di fluorescenza dei mitocondri.

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