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7 | 1B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter,BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2015

Trascrizione dell’RNA e Traduzione delle Proteine


Flusso dell’informazione geneticaDogma centrale


RNA differisce da DNA per:

-zucchero, ribosio-zucchero non DEOSSI-basi azotate-a singolo filamento-struttura complessa anche se non a doppia elica


Sequenza equivalente a quella dell’RNA trascritto, stessa polarità 5’-3’


Differenze con la replicazione/duplicazione del DNA:

- RNA polimerasi- Trascritto di RNA a singolo filamento si stacca dalla doppia elica quasi subito e

quindi è possible sintetizzare nuove molecole- Frammenti corti- RNA polimerasi non utilizza innesco-primer- Tasso di errore 1x 10-4 (invece che 1x10-7 come nel DNA)


TIPI DI RNA

RNA messaggeri (mRNA) codificano le proteine

RNA ribosomiali (rRNA)formano il nucleo centrale del ribosoma e catalizzano la sintesi proteica

microRNA (miRNA) regolano l’espressione genica

RNA transfer (tRNA) fungono da adattatori tra l’mRNA e gli amminoacidi nella sintesi delle proteine

Altri RNA non codificanti attivi nello splicing, nella regolazione dei geni, nel mantenimento dei telomeri ein molti altri processi


La Trascrizione nei batteri.L’ RNA polimerasi è un complessomultiproteico contenente un fattoredetto sigma che è staccabile L’ RNApol si possono attaccare solodebolmente al DNA. Tuttavia quandol’RNA pol incontra una particolaresequenza di DNA definita sequenzapromotore vi si attacca con forza edinizia la trascrizione. Questaparticolare sequenza vienericonosciuta tramite il fattore sigma.Dopo questo fenomeno la pol apre ilDNA per un breve tratto ed uno deidue filamenti inizia a svolgere il ruolodi stampo. Dopo la sintesi dei primiribonucleotidi il fattore sigma si staccae la trascrizione avanza rapidamentefino a che la pol incontra un segnalesul DNA detto terminatore che la faprima fermare e poi staccare(preceduto da una sequenzasimmetrica che formerà una“forcina”). Nei batteri il segnaleterminatore è una serie di A e Tpreceduta da una sequenza simmetrica.


Non tutte le sequenze hanno le caratteristiche per essere riconosciute dal fattore sigma, la seriedelle caratteristiche che una sequenza deve avere per essere riconosciuta è definita consenso.La sequenza precisa di questa consenso determina la forza del promotore ossia la capacità diattrarre le polimerasi. I promotori dei geni più abbondanti sono più forti dei promotori deigeni più rari. Alla stessa maniera dei promotori, anche i terminatori contengono una vastagamma di sequenze. Nelle cellule eucariotiche la situazione è simile. Le sequenze deipromotori solitamente sono asimmetriche. Poiché il DNA ha due filamenti due molecole diRNA potrebbero essere trascritte da qualsiasi posizione usando ciascun filamento di DNAcome stampo. L’unica imposizione è che la trascrizione avvenga in direzione 5’>3’ e chequindi sia sempre lo stampo 3’>5’ ad essere impiegato. Chiaramente le direzioni sarannoopposte. La scelta del filamento stampo per ciascun gene è determinata dalla posizione edall’orientamento del promotore


Una differenza sostanziale tra i batteri e le cellule eucariotiche è rappresentata dal fatto chei procarioti hanno solo una RNA polimerasi mentre gli eucarioti ne possiedono tre: l’RNApolimerasi I, II e III. Nonostante esse abbiano certe sub-unità in comune, esse trascrivonogeni diversi. Le RNA polimerasi I e III trascrivono geni che codificano RNA transfer,RNA ribosomali e piccoli RNA. L’ RNA polimerasi II trascrive la maggioranza dei geniche codificano proteine.

La pol II eucariotica e quella batterica sonostrettamente correlate ma ci sono almeno duedifferenze sostanziali tra questi enzimi:1) Mentre la pol batterica più il fattore sigmapossono iniziare la trascrizione su uno stampo diDNA anche in vitro e senza altre proteine, la polII eucariotica richiede l’aiuto di diverse proteineaccessorie per iniziare a trascrivere. Questeproteine vengono dette Fattori trascrizionaligenerali.2) negli eucarioti l’inizio della trascrizione devetenere in conto lo stato di compattamento dellacromatina.


Per iniziare la trascrizione di un gene la RNApol II richiede molti fattori generali dellatrascrizione che servono èer piazzare la polsul promotore, iniziare la trascrizione erilasciare la pol dal promotore quando iniziala trascrizione TFIID serve per iniziarel’attacco del complesso di trascrizione ad unasequenza di DNA ricca di T ed A definitaTATA box piazzata 25 basi dall’inizio dellatrascrizione. Altri fattori vengono poiassemblati per consentire l’inizio dellatrascrizione formando un complesso d’inizioche guida la pol II sul promotore dopo di cheil fattore TFIIH permette alla pol II diaccedere al punto di inizio sullo stampo diDNA. La trascrizione in una cellulaeucariotica richiede un numero maggiore diproteine tra cui proteine regolatrici detteattivatori trascrizionali che legandosi aspecifiche sequenze di DNA aiutano la pol IIa posizionarsi sul punto iniziale dellatrascrizione. Per iniziare la trascrizione deveesistere un complesso poli proteico dettomediatore necessario a regolare le diverseproteine attivatrici richieste per questoprocesso.


Negli eucarioti la trascrizione rappresenta solamente un primo passaggio nellatrasmissione dell’informazione dal DNA alle proteine. Dopo che il filamento di RNA èstato trascritto viene sottoposto a modificazioni covalenti ad entrambe le estremità ealla rimozione delle sequenze introniche. Quest’ultimo fenomeno si chiama splicingdell’ RNA messaggero. Questa modificazione permette inoltre di generare diverseproteine dallo stesso gene semplicemente modificando lo schema dello splicing! Lemodificazioni dell’ estremità di una molecola di RNA riguardano l’ aggiunta di uncappuccio al 5’ della molecola definito Cap e di una coda di poly A all’estremità 3’


Non appena si sono prodotti i primi nucleotidi l’mRNA viene dotato di un cap attraverso unaserie si tre modificazioni:1) una fosfatasi toglie il fosfato in 5’. 2) una guanil transferasiattacca una GMP in modo inusuale ossia 5’-5’. 3) un a metil transferasi metila la G inposizione 7 sulla guanina. Nel nucleo questi cap sono associati ad un complesso proteicodetto CBC. Anche le estremità 3’ dei mRNA sono modificate. Sulla coda della pol IIviaggiano due complessi detti fattore di stimolazione del taglio (CStF) e fattore dispecificità del taglio e della poliadenilazione (CPSF). Quando questo complessi trovano lasequenza adeguata sull’RNA innescano altre proteine che per prima cosa tagliano ilmessaggero, quindi la poly-A polimerasi inizia a trasferire nucleotidi A alla catena di RNA.Dopo che l’estremità 3’ è stata tagliata la pol II continua ancora a valle la trascrizione delDNA. Presto però la pol II si stacca e questo RNA viene degradato.

5’Cap3’ polyA


Capping-aggiunta di cappuccio al 5’


Sequenze di splicing


ISOFORME DI mRNA


….. ma alcuni RNA non servono per codificare proteine. Si tratta di RNA che possiedonofunzioni alternative all’interno della cellula. Gli RNA più abbondanti sono quelli ribosomaliche formano il nucleo del ribosoma necessario alla traduzione proteica. Questi rRNA sonotrascritti dall RNA pol I. Per ottenere un numero molto grande di rRNA la cellula eucarioticapossiede copie multiple dei geni che codificano per l’rRNA (circa 200 copie per genomaaploide nell’uomo). Essi non vengono cappati e poliadenilati. Ci sono quattro tipi di rRNAnegli eucarioti definiti dalla loro velocità di sedimentazione espressa in Svedberg. Gli rRNA18S, 5,8S e 28S sono prodotti dalla modificazione di un rRNA precursore di grossedimensioni, mentre l’rRNA 5S è prodotto dalla RNA pol III trascrivendo un gene localizzatoin una regione diversa del genoma.

Lo svedberg (simbolo S) è un'unità di misura deltasso di sedimentazione che non fa parte delSistema Internazionale. Uno svedberg,dimensionalmente uguale ad una unità di tempo,è pari a 10-13 secondi. L'unità prende il nome dalquello del fisico e chimico svedese TheodorSvedberg, vincitore del Premio Nobel per lachimica nel 1926 per il suo lavoro sulla chimicadei colloidi e l'invenzione dell'ultracentrifuga.Nell'ultracentrifugazione, il tasso disedimentazione di una particolaremacromolecola è calcolato dividendo la velocitàdi sedimentazione costante (espressa in m/s) perl'accelerazione applicata (espressa in m/s2) emoltiplicando poi per 1013.


Il nucleolo è la più grande fabbrica diribosomi della cellula. Si tratta di ungrosso aggregato di macromolecolecomprendenti gli stessi geni checodificano per gli rRNA, i precursoridegli rRNA e le molecole maturesituato nel nucleo ma non separatoda membrane. Inoltre contiene tuttele molecole che sono necessarie per lamaturazione degli RNA ribosomali. Igeni codificanti per l’rRNA sonodistribuiti in 10 gruppi ciascunodisposto vicino alla punta di 5 coppiedi cromosomi diversi. Quando lacellula entra in mitosi i cromosomi sicondensano ed il nucleolo sidistrugge. Dopo la mitosi lacromatina ritorna al suo stato naturaleed il nucleolo si riforma.

Nucleolo


La traduzione negli eucarioti.La conversione dell’informazione contenuta nell’ mRNA in proteina viene definita traduzione.Poichè il DNA è scritto con un alfabeto fatto di quattro lettere mentre le proteine sono scrittecon un alfabeto fatto da venti lettere, per questa ragione la sequenza nucleotidica di unmessaggero deve essere tradotta in proteina seguendo determinate regole. Queste regole sonostate decifrate negli anni ’60 e rappresentano il codice genetico. Si scoprì che l’RNA è unpolimero fatto di 4 lettere e che ciascun amminoacido è codificato da una tripletta di tre lettere.Ma in questo modo le possibili combinazioni sarebbero 4X4X4=64, ben maggiori delle venticombinazioni necessarie. Per questa ragione alcune triplette non dovrebbero essere usate o ilcodice genetico dovrebbe presentare un fenomeno di ridondanza, ossia diverse triplettedovrebbero codificare per lo stesso amminoacido. Ciascuna tripletta si chiama codone erappresenta o un amminoacido o un segnale di stop al processo di traduzione.


La reazione fondamentale durante la sintesi proteica è la formazione di un legame covalente traun gruppo carbossilico all’estremità di una catena polipeptidica in crescita e un gruppoamminico libero su di un amminoacido libero in arrivo.


La tripletta codificante sull’ mRNA non si lega direttamente all’ amminoacido ma ad una molecolaadattatore che può riconoscere tramite un suo sito il codone e presentare all’altra estremitàl’amminoacido: RNA transfer o tRNA lunghe poco più di 80 nucleotidi e sono sintetizzati dalla RNA polIII. Queste molecole si ripiegano nello spazio in modo complesso ed assumono una forma a L. Una delledue estremità contiene l’anticodone che riconosce il codone sull’ mRNA mentre l’ atra estremità è usataper tenere legato l’amminoacido.


Ciascuna molecola di tRNA si lega ad uno dei 20 aa che rappresenta il suopartner ideale. L’enzima che catalizza questa reazione è l’amminoacil-tRNA sintetasi. Ovviamente per evitare errori il sistema possiede deimeccanismi di sicurezza che fanno si che ci siano meno di un errore ogni40000 accoppiamenti.


Nella traduzione proteicauna sequenza di nucleotidiviene tradotta in in unasequenza di amminoacidi.In linea di principio unasequenza di RNA puòessere letta in ognuno deitre quadri di lettura.Ovviamente ciò dipendedalla base scelta per lapartenza, ma esiste uncodice di punteggiaturache permette solo uno deitre quadri di lettura

Codone


tRNA iniziatore che porta l’aa Metionina è diverso da tutti gli altri tRNA per la Metionina.

E’ capace di legarsi al sito P del ribosoma subunità minore anche in assenza della subunità maggiore

Con i fattori di inizio della traduzione, il tRNA iniziatore riconosce il Capping dell’mRNA al 5’


La terminazione della traduzione

La fine del messaggio avviene quando il ribosomaincontra uno dei tre segnali di stop della traduzione:UAA; UAG; UGA che sono stati chiamati codonidi stop. Questi codoni non si appaiano ad un tRNAma si legano a fattori detti di rilascio. Quando inposizione A entra un fattore di rilascio la peptidiltransferasi è costretta a legare una molecola diacqua all’ultimo amminoacido. Questa reazionelibera l’estremità della catena peptidica e ilribosoma si separa rilasciando l’mRNA.


I poliribosomi

La sintesi della proteine prevede inizi multipli da parte dei ribosomi su ciascunamolecola di mRNA. Non appena il ribosoma ha tradotto una parte sufficiente diproteina l’estremita 5’ dell’RNA viene nuovamente agganciata da un altro ribosoma.Le molecole di mRNA si trovano nel citosol sotto forma di poliribosomi definitianche polisomi che altro non sono che grossi complessi composti da parecchiribosomi agganciati ad una molecola di mRNA

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