Citometria a flusso o Citofluorimetria

Dagli inizi anni 50 la citometria a flusso è diventata una tecnologia raffinata per l’esplorazione delle superfici della cellula. E’una tecnica che permetta la misurazione e la caratterizzazione delle cellule sospese in un mezzo fluido in modo molto rapido e dettagliato sia a livello quantitativo che qualitativo. Le misure di carattere quantitativo e qualitativo riguardano parametri biochimici espressi dalla cellula e qualificati indirettamente per mezzo di marcatori molecolari fluorescenti. Sulla base di ciò si può affermare che nell’arco di decenni la citometria a flusso è diventata una strumentazione indispensabile nel servizio del biologo nonché del patologo clinico.

Citometria a flusso

Citrometria a flusso è un metodo di conteggio, selezione e isolamento di particelle,le quali dopo essere state marcate con un colorante fluorescente in modo specifico,vengono singolarmente passate attraverso un sistema rivelatore ottico a flusso laminare e quindi conteggiate. Attraverso i parametri derivati da questi conteggi è possibile analizzare molte caratteristiche delle particelle,dove le proprietà in analisi possono essere selezionate dalla marcatura specifica.

PRINCIPIO DELLA CITOMETRIA

Questa tecnica consta di tre componenti principali : sistema fluidico che controlla la captazione cellulare e il flusso

cellulare,in questo processo le cellule in sospensione (sangue periferico,aspirato midollare, cellule in colture) vengono inniettate in singola fila nella camera di flusso

sistema ottico che interroga le cellule mentre attraversano un raggio laser, ogni singola cellula che attraversa un fascio di luce polarizzata del laser che riflette la luce e genera dei segnali,che vengono raccolti, filtrati e amplificati.

Sistema elettronico che controlla gli strumenti e raccoglie, raffigura ed analizza i dati, un softwer converte i segnali in valori digitali e li invia al pc quindi si ha una rappresentazione grafica e statistica.

Vediamo il funzionamento di ciascun elemento della citometria analizzandolo pezzo per pezzo in maniera dettagliata

Le cellule di una popolazione eterogenea( può essere sangue periferico, cellule in colture ecc.) vengono aspirate dalla provetta per mezzo di un ago e spinta da aria compressa in un capillare,all’uscita del quale incontra il liquido “guaina” e dopo aver attraversato il filtro salino di circa 0,45µ per eliminare le impurità viene inserito attraverso una pressione generata da una pompa ad aria nel citofluorimetro. Il liquido guaina guida il campione nella camera del flusso dove le cellule vengono separate, e trasportate fino alla regione del nozzle fino alla regione ottica.

Fig 1

All’interno della camera di flusso il campione viene avvolto dal liquido guaina ed entra in una prima regione chiamata nozzle dove viene sottoposto a un processo definito focalizzazione idrodinamica ( sarebbe un moto laminare dl fluido dove il flusso viene scomposto in tanti cilindri concentrici che scorrono intorno al core centrale senza che si mescolino con quest’ultimo,in modo che le particelle trasportate abbiano un orientamento longitudinale).

fig2

Vediamo nello specifico il funzionamento del lettore ottico La parte fondamentale del sistema è il banco ottico di lettura, costituito da

una sorgente di luce monocromatica di lunghezza d'onda =633 nm. (nella maggior parte degli strumenti viene impiegato un laser a ioni di Argon con lunghezza d’onda di 488nm(blu))

Specifici coloranti fluorescenti agiscono in modo combinato sulle cellule, per evidenziare i peculiari aspetti citomorfologici e l'accurata individuazione di:

Formula leucocitaria a cinque popolazioni Eritroblasti Reticolociti Piastrine

lettore ottico

Le cellule, dopo specifica colorazione, vengono trasportate con un fluido laminare nella cella di lettura dove attraversano, una dopo l'altra in un flusso focalizzato idrodinamicamente, il raggio di luce monocromatica. Opportuni sistemi ottici (fotodiodi, fotomoltiplicatori) rilevano la luce diffusa a diverse angolazioni da ciascuna cellula

Rifrazione Frontale (Forward Scattered Light) Rifrazione Laterale (Side Scattered Light) Fluorescenza (Side Fluorescence)

RIFRAZIONE FRONTALE ("Forward Scatter") La rifrazione frontale è misurata da un fotodiodo posto frontalmente al percorso ottico della luce laser. Quando il raggio luminoso monocromatico colpisce le cellule, una parte dei suoi raggi viene deviata in diverse direzioni e angolazioni. La quantità di luce che riesce a raggiungere il fotodiodo rilevatore è direttamente proporzionale alle dimensioni (volume) della cellula. La misura di rifrazione frontale è utilizzata per l'analisi di:

Globuli Bianchi e Granulociti Basofili Reticolociti e Piastrine Eritroblasti .

RIFRAZIONE LATERALE ("Side Scatter")La rifrazione laterale è rilevata da un tubo fotomoltiplicatore posto in posizione ortogonale alla sorgente luminosa. Esso quindi raccoglie in modo selettivo, per mezzo di uno specchio dicroico, la luce diffratta da ciascuna cellula ad un angolo di 90 gradi rispetto alla luce incidente. A tale angolazione la luce rifratta dalla cellula dipende da:

Regolarità di forma del nucleo Densità della cromatina nucleare Granularità del citoplasma

La quantità di luce rifratta lateralmente da un granulocita, pertanto, è molto più elevata della quantità di luce rifratta da un linfocita per la maggiore quantità di granulazioni citoplasmatiche e la maggiore irregolarità di forma del nucleo.La misura di rifrazione laterale e utilizzata per l'analisi di:

formula leucocitaria Globuli Bianchi e Granulociti Basofili

FLUORESCENZA ("Side Fluorescence") La coniugazione di specifici fluorocromi a particolari componenti chimici o strutturali delle cellule (proteine, materiale nucleare) consente di differenziare in modo accurato e sensibile le diverse popolazioni cellulari. Un fluorocromo, quando è eccitato da una luce monocromatica di idonea lunghezza d'onda, è in grado di emettere un raggio luminoso a una frequenza minore. Quindi, dopo essersi legato allo specifico componente cellulare, il colorante fluorescente emetterà in tutte le direzioni dello spazio una luce di lunghezza d'onda maggiore.Un tubo fotomoltiplicatore (posto ad un angolo di 90 gradi rispetto alla sorgente di luce laser) rileva la quantita di luce fluorescente emessa da ciascuna cellula, trasformandola in un segnale elettrico. Per rendere più sensibile e accurata tale misurazione, il tubo fotomoltiplicatore è preceduto da un filtro ottico che seleziona la lunghezza d'onda caratteristica del fluorocromo in esame.

La misura di fluorescenza è utilizzata per l'analisi di: formula leucocitaria eritroblasti reticolociti e piastrine Per ciascuna analisi viene utilizzato uno specifico colorante polimetinico

in grado di coniugarsi al DNA e all'RNA contenuto nel nucleo e negli organuli citoplasmatici.

L'intensità di fluorescenza emessa da ciascuna cellula, combinata alla quantità di luce rifratta lateralmente e/o frontalmente consente una eccellente classificazione delle diverse popolazioni cellulari del sangue e, all'interno della stessa popolazione, un ulteriore e più specifica classificazione in base al grado di immaturità cellulare.

fig3

Fig 4

PARAMETRI FISICI Quando viene colpita dal fascio di

luce emesso dal laser,la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche e morfologiche.La luce incidente sulla cellula dà origine ad uno scatter frontale che dà informazioni sul volume della cellula, ed uno scatter laterale che viene rilevato da un sensore di 90° che valuta la granularità cellulare. In questo modo si possono determinare il fenotipo, le dimensioni e la composizione citoplasmatica elle cellule.

Fig 5

FIG 6

I segnali di fluorescenza emessi dalla cellula vengono portati ciascuno a un diverso sensore, il quale trasforma l’energia luminosa raccolta i cosiddetti fotoni in intensità di corrente gli elettroni e li amplifica in modo da creare un logaritmo. Va precisato che prima dell’acquisizione di un campione , si va a stabilire un valore soglia al di sotto del quale il nostro strumento considera un processo come inesistente e quindi non lo va ad includere nella nostra analisi.

Dettaglio del sistema elettronico e dei risultati

L’elaborazione dei dati e’ eseguita grazie al computer collegato allo strumento,

che tramite specifici software provvede a tradurre i segnali in grafici e alla loro rappresentazione su display video in tempo reale

Fig 7

I dati da noi raccolti per mezzo di questo apparecchio vengono evidenziati per attraverso delle rappresentazioni grafiche quali possono essere o ISTOGRAMMI dove in ascissa viene riportata l’intensità di fluorescenza e in ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l’antigene

o il diagramma a dispersione punti, il quale correla due parametri, ogni punto rappresenta un singolo evento con un valore per ciascun parametro

FIG 8

FIIG 9

Compensazione: processo che ha lo scopo di sottrarre da un certo canale una quota fissa di segnale relativo all’emissione di un altro fluorocromo.

Nonostante il complesso sistema di lenti, specchi e filtri, e l’attenzione posta nella selezione di fluorocromi con spettri di emissione separati, succede infatti che una radiazione di una certa intensita’ di un fluorocromo si sovrappone alla lunghezza d’onda del fluorocromo successivo.

Compensazione

Si sottrae dal canale (rosso),una quota fissa di segnale dovuta alla interferenza (verde),e viceversa.

FIG10

Siamo giunti al fase finale del nostro strumnto di importanza fondamentale per le diagnosi ossia le analisi dei dati.

L’analisi dei dati consente di avere informazioni sui seguenti parametri:   1.Numero di cellule appartenenti ad una determinata popolazione rispetto

al numero totale di eventi acquisiti   2.Percentuale di cellule positive per un antigene di interesse   3.Intensità di espressione di un antigene

Analisi dei dati

Numero di cellule appartenenti ad una determinata popolazione

Vediamo alcuno esempi

FIG 11

Percentuale di cellule positive per un antigene di interesse

FIG 12

FIG 13

Intensità di espressione di un antigene

Alcune definizioni aderenti a questi risultatiFIG14

MEAN(media aritmetica): intensità media di un parametro in una popolazione, utilizzato per i valori in scala lineare

GEO MEAN (media geometrica): utilizzato per i valori in scala logaritmica, perché la media aritmetica è troppo sensibile a numeri ridotti di eventi ad alta intensità

CV(coefficiente di variazione):esprime l’ampiezza del picco MEDIAN(mediana):valore che divide esattamente a metà gli eventi PEAK CHANNEL: è il valore che compare più frequentemente nella

distribuzione dei dati, è una misura inaccurata del centro della distribuzione

Se la distribuzione degli eveni è ha un andamento di tipo Gaussiano, media, mediana e peak channel coincidono

Inserimento dei siti dove ho estrapolato le immaggini Figura 1 http://biotec.casaccia.enea.it Figura2 http://www.evsrl.it/vet.journal/approfondimento.php

?codnotizia=4133 Figura 3 http://www.ematologiainfluorescenza.it/cms/ita/32/

citometriaflusso.html Figura 4 http://www.ematologiainfluorescenza.it/cms/ita/32/

citometriaflusso.html Figure 5 e 6 scannerizzati dal libro metodologie di laboratorio Figure 7 8 9 10 http://smart.thinktag.org Figura 11 12 13 14 http://www.unife.it/scienze/lm.biomolecolare

/insegnamenti/biochimica-applicata/materiale-didattico/presentazioni-2010-11/16b0-18-maggio-lab-citometria.pdf

BIBLIOGRAFIA DELLE IMMAGGINI

grazie per la cortese attenzione