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I

Citometria a flusso

La citometria a flusso è una metodica per l’analisi e caratterizzazione di particelle microniche, soprattutto di origine biologica.

• Una sospensione di particelle (ad esempio cellule) viene convogliata da un sistema fluidico laminare di trasporto in un capillare fino al punto di misura.

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Principio di funzionamento

• Un fascio luminoso focalizzato intercetta il flusso di particelle e vengono generati segnali dall’incontro di ogni singola particella con la radiazione elettromagnetica.

• I segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai rispettivi trasduttori che li convertono in segnali elettrici.

• Questi segnali elettrici vengono amplificati ed elaborati da un analizzatore che provvede alla rappresentazione grafica e all’analisi statistica.

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software

Schema di un citometro a flusso

Sorgente luminosa

raggio

capillare

fotomoltiplicatore

particella

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Sistema fluidico

Il sistema fluidico è di fondamentale importanza in quanto può influenzare il segnale letto dal rilevatore.

Poiché il citofluorimetro rilevi una ad una le particelle presenti nel campione di partenza in maniera omogenea è necessario che lo strumento sia dotato di un sistema che immetta nel capillare ogni singola particella nello stesso punto.

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I

E’ necessario che nel capillare si instauri un flusso laminare (non turbolento).

In condizioni di flusso laminare le forze di inerzia idrodinamica esercitate sulle particelle le mantengono durante il loro moto al centro del capillare (idrofocalizzazione del flusso).

Flusso laminare

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I

In tali condizioni di flusso si possono considerare due regimi fluidici coassiali: quello interno (core flow) contiene le particelle, quello esterno (sheat flow) mantiene queste ultime lungo l’asse ideale di flusso.

particella flusso interno

flusso esterno

Flusso laminare/2

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PE

RS

I

Agendo sul sistema pneumatico di trasporto che controlla la differenza di velocità tra il flusso interno e flusso esterno si regola la velocità di flusso delle particelle all’interno del capillare per ottenere segnali per singole particelle.

Flusso laminare/3

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I I segnali originati sono solitamente di tre tipi:

1) Diffusione a basso angolo (Forward scatter)2) Diffusione a 90° (Side scatter)3) Fluorescenza

Tali segnali sono quindi legati alle caratteristiche fisiche della particella e alla eventuale presenza di molecole fluorescenti localizzate in esse.

Tipi di segnale

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Forward Scatter

raggio

fotomoltiplicatore

particella

raggi diffratti

(intensità dipendente dalle dimensioni della particella)

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PE

RS

I Il segnale di Forward Scatter non dipende solo dalle dimensioni delle cellule, ma anche dalla posizione del capillare nel il laser colpirà la particella

Particelle delle medesime dimensioni che generano due

segnali di Forward Scatter differenti

Forward Scatter/2

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Side Scatter

Il Side Scatter è in relazione con le caratteristiche superficiali della particella in quanto il segnale è in relazione alla riflessione della luce incidente da parte della superficie della particella.

SS

FS

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I La citometria a flusso è in larga parte utilizzata per la caratterizzazione di cellule intere.

In questi casi la sorgente utilizzata è laser ad Argon, di potenza tra i 15 mW e 5 W, centrata su una lunghezza d’onda di 488 nm (blu).

La sorgente al laser Ar possiede una elevata intensità, permette la focalizzazione della radiazione su di una sezione molto ridotta (dimensioni cellulari) e l’ eccitazione di numerosi fluorofori.

Sorgenti luminose

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I La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette l’emissione ad un ridotto numero di lunghezze d’onda: 514, 488 e 345 nm.

Altri tipi di sorgenti laser a differenti sono impiegate in citometria a flusso:

• Kripton• Elio• Neon

Sorgenti al laser

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I Una sorgente di radiazione più economica e policromatica è la lampada a vapori di mercurio.

Tale sorgente ha questi svantaggi per l’impiego in citometria a flusso:

• radiazione poco potente • scarsa stabilità nella luce di emissione• sistemi elettronici di compensazione• rapido decadimento

Altre sorgenti

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I Segnali legati alle caratteristiche cellulari:

• Volume (diametro) o dimensioni

• Rapporto nucleo/citoplasma

• Granulosità interna

• Rugosità di membrana

FS SS

Citometria a flusso di cellule

Fluorescenza•Presenza di marcatori di superficie

•Indicatori di attività enzimatica intracellulare•Indicatori di vitalità

Coulter Cytometry

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Cella del citometro a flusso

Injector Tip

FluorescenceFluorescencesignalssignals

Focused laserFocused laserbeambeam

Sheath fluid

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Tipi di immunofluorescenza per FC

DIRETTA INDIRETTA

singola doppia tripla

La fluorescenza è ottenuta mediante il legame di uno o più anticorpi marcati con un fluorocromo ad uno o più antigeni di membrana.

Queste tecniche vengono definite “tecniche di immunofluorescenza diretta e indiretta”

Coulter Cytometry

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PMT

PMT

PMT

PMT

Filtridicroici

Filtri abanda passante

Ottica a tripla fluorescenza

Laser

1

2

3

4

Cella a flusso

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Analisi dei dati

Dalla combinazione dei due tipi di segnali si ottiene un particolare diagramma bidimensionale detto “citogramma a dot–plot”

In un citogramma ogni punto rappresenta un evento contato, dotato di un definito valore correlato ai parametri misurati.

I citogrammi mettono in relazione correlazione 2 differenti parametri rilevati, solitamente 2 tipi di fluorescenza oppure una fluorescenza ed uno scattering (FS o SS)

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488 nm laser

+-Charged Plates

Single cells sortedinto test tubes

FS Sensor

Fluorescence detector

Citometro a flusso come selettore cellulare

Coulter Cytometry

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Citofluorimetro analizzatore

Coulter Cytometry

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Citofluorimetro selezionatore cellulare