Basi della citofluorimetria a flusso

Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso una camero di flusso

Riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza

La luce emessa viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer

Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila.

granulocito

linfocito

monocito

Nel caso del campione riportato in figura, viene analizzata una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti

Scatter Frontale(Forward Angle Light Scatter, FALS)

Laser

granulocito

linfocito

monocito

Sensore per il FALS

Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad

un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce

dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul

volume cellulare.

Quando viene utilizzata una sorgente laser, la

quantita’ di luce “scatterata” nella direzione frontale

(lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce

laser) viene raccolta nel canale del Forward Scatter

L’intensita’ del Forward Scatter e’ proporzionale alla

dimensione, forma, ed omogeneita’ ottica delle

cellule (o delle altre particelle analizzate)

Scatter Laterale(90 Degree Light Scatter)

Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello Scatter Laterale, a 90 gradi e che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser

granulocito

linfocito

Sensore FALS

Laser

monocito

Sensore per il 90O LS

Quando si utilizza una sorgente laser, la quantita’ di

luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse

attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel

canale del Side Scatter

Anche l’intensita’ del side scatter e’ proporzionale

alla dimensione, forma ed omogeneita’ ottica

delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

Il Forward Scatter tende ad essere piu’ sensibile

alle proprieta’ della superficie cellulare delle particelle

e pertanto puo’ essere usato per distinguere cellule

vive da cellule morte

Il Side Scatter tende ad essere piu’ sensibile alle

inclusioni presenti all’interno della cellula e pertanto

puo’ essere usato per distinguere cellule granulate

da quelle non-granulate.

Proprietà tipiche del Forward e del Side Scatter

Sistema ottico del citofluorimentro

cella di flusso filtri dicroici

filtri bandpass

Fotomoltiplicatori(PTMT)

I fotomoltiplicatori, che raccolgono ed amplificano il segnale

luminoso filtrato e ricevuto. In questo specifico caso, il PMT1

funziona come scatter a 90 gradi, e raccoglie la luce

rifratta/diffratta (“scatterata”) dalle cellule.

I filtri dicroici, i “bandpass” filtri permettono il passaggio della luce solo ad una certa lunghezza d’onda.

Filtri ottici: rilevamento dei parametri fisici

Sorgente luminosa Luce trasmessa

Forward Scatter

Filtro dicroico/specchio a 45 gradi

Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico

Forward Scatter

90 D

egre

e S

catt

er

si possono facilmente identificare tre popolazioni: - linfociti, - monociti - granulociti.

Si puo’ disegnare un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolazione scelta

Leucociti del sangue periferico

Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC.

Nuclei di linfociti normali o apoptotici

Forward scatter

90 D

egre

e s

catt

er

I filtri ottici hanno il compito di pemettere il passaggio della luce emessa dai fluorocromi eventualmente legati alle cellule soltanto ad una certa lunghezza d’onda.

Esempi di filtri ottici

Standard Long Pass Filters

520 nm Long Pass Filter

Sorgente luminosa Luce trasmessa

Il filtro raccoglie la luce verde (tipicamente designata FL1),

Standard Short Pass Filters

575 nm Short pass Filter

Sorgente luminosa Luce trasmessa

Il filtro raccoglie la luce arancione (FL2).

< 575 nm

Standard Band Pass Filters

630 nm Band Pass Filter

Sorgente luminosa Luce trasmessa

620-640 nm

Un terzo filtro può raccogliere la luce emessa ad una lunghezza

d’onda ancora maggiore (in questo caso, nella regione del rosso

profondo).

In questo esempio, riferito ad un paziente con infezione da HIV, sono stati identificati i linfociti in base al Forward e Side scatter, e su queste cellule è stata fatta l’analisi delle sottopopolazioni con anticorpi anti-CD3 (in FL1), anti-CD4 (in FL2) ed anti-CD8 (in FL3).

Raccolta della fluorescenza da una popolazione

Fluorescence detectors

Laser

Il “Sorting cellulare”

FALS sensor

Fluorescence detector

Piastre cariche elettricamente

Cellule singole separate dentro diverse provette

FACS:FluorescenceActivatedCellSorting