Donatella NavaIstituto Zooprofilattico Sperimentale del Mezzogiorno

DefinizioneLa citrometria a flusso è un metodo di conteggio, ed

eventualmente di selezione e isolamento, di elementi corpuscolati (cellule) che, dopo essere state marcate con un colorante,vengono fatti passare singolarmente attraverso un sistema ottico di rilevazione a flusso laminare e quindi conteggiate.

Per utilizzare la citometria nella ricerca di target non corpuscolati, quali gli allergeni, è necessario farli adsorbire a strutture cromaticamente inerti, aventi dimensioni assimilabili a quelle di una cellula (microsfere in lattice).

Principio di funzionamentodella citometria a flusso

1) Le cellule di una popolazione eterogeneavengono aspirate dalla provetta e immessein una camera di flusso dove vengonoseparate le une dalla altre.

2) Ogni singola cellula viene poi attraversatada un fascio di luce che eccita i fluorocromi edetermina l’emissione di un segnaleFluorescente

3) Il segnale passando attraverso un sistema di filtri e specchi raggiunge un rivelatore.

4) Viene quindi processato elettronicamente,trasformato da analogico a digitale e inviatoall’analizzatore, che elabora il dato e lovisualizza tramite un grafico.

5) Attraverso piastre di deflessione le celluleanalizzate possono essere raccolteseparatamente tramite un processo definito“sorting”.

In seguito alla riorganizzazione dell’Istituto, non è stato possibile esaminare i campioni nei nostri

laboratori. L’analisi è stata effettuata dal laboratorio di immunologia della facoltà di Agraria

di Portici.

E’ stato utilizzato un FACScan flow cytometer (Becton Dickinson USA)

L’analisi è stata eseguita seguendo il protocollo messo a punto nel laboratorio per la

ricerca della gliadina

Diagramma di flusso

Estrazione in etanolo

Diluizione estratto

Adsorbimento sulle microsfere

Aggiunta anticorpi anti target

Incubazione con anticorpi anti IgG di ratto marcati

Lettura al citofluorimetro

L’approccio diagnostico è basato sull’utilizzo di particelle in latex di 3 µm (Polysciences, Warrington, PA, USA) trattate con 1 ml di estratto in etanolo (60%) del campione in esame.

Quindi lavate 2 volte in PBS e trattate con soluzione di arresto (Kirkegaard & Perry Laboratory).

Le microsfere venivano incubate in successione con anticorpi di ratto (1:50 PBS) verso i target ricercati (anti b-

lattoglobulina o anti ovoalbumina) (Sigma-Aldrich) specifici verso l’antigene, quindi con anticorpi anti IgG di ratto

marcati con isotiocianato (RαG - FITC) (Sigma-Aldrich) diluito 1:600 in PBS

L’indagine è stata eseguita esclusivamente sui campioni di biscotti e polpette di carne inviati al

laboratorio per l’esecuzione dei test immunoenzimatici.

Alcuni campioni non sono stati sottoposti all’analisi citofluorimetrica in quanto utilizzati interamente

per i saggi ELISA.

La titolazione è stata effettuata diluendo β-lattoglobulina e ovoalbumina (Sigma-Aldrich) in PBS

Come controllo negativo si è utilizzato un campione nel quale gli anticorpi marcati erano sostituiti con

PBS

Le indagini sono state eseguite separatamente per la ricerca di lattoglobulina e ovolabumina.

OVOALBUMINE - BISCOTTI

ELISA Test Cf analysis

ppm First replicate (ppm)

Sec. replicate (ppm) Third replicate (ppm)

mean SD

0 0 0 0 0 0

5 NE NE NE NE  NE

15 18,28456 13,65489 21,98547 17,97497333 4,173909883

30 35,25647 31,25658 39,32654 35,27986333 4,035030859

60 65,21455 68,29865 61,25455 64,92258333 3,531114499

OVOALBUMINE - BISCOTTI

Biscuits

020406080

L0 L1 L2 L3 L4

Samples

ELISA test

Citofluorimetricanalysis

POLPETTE - LATTE

ELISA Test Cf analysis

ppm First replicate

(ppm)Second replicate

(ppm)Third replicate

(ppm) mean SD

0 0 0 0 0 0

1 NE NE NE NE  NE

3 8,26599 5,32221 9,36598 7,651393333 4,173909883

6 10,25648 13,23254 8,23658 10,5752 4,035030859

12 14,14897 12,65984 15,25885 14,02255333 3,531114499

POLPETTE - LATTE

Meat

05

101520

L0 L1 L2 L3 L4

Samples

ELISA test

Citofluorimetricanalysis

La citometria a flusso sembra più sensibile dell’ELISA, anche se il divario rilevato con il test immunoenzimatico in relazione alla ricerca delle ovoalbumine, pone il dubbio

di una possibile tendenza alla sovrastima dell’analisi citofluorimetrica.

Ha però il limite di prevedere protocolli più sofisticati e dispendiosi che non ne giustificano l’impiego nella

routine diagnostica.

In questo lavoro sono stati posti i preliminari per una futura applicazione della citofluorimetria nella ricerca

degli allergeni in diagnostica

CONCLUSIONI

I campioni sono stati omogeneizzati (2 min in un omogeneizzatore a lame ) e quindi trattati con etanolo.

Come controllo positivo sono stati allestiti campioni (1 mg) di carne e sfarinati, uova-latte free, contaminati con l’aggiunta di latte e uova (da 1 a 10-3 ppm), sono stati utilizzati e trattati per l’estrazione come sopra descritto.

Particelle in latex (105) con un diametro di 3 micron (Polysciences) sono state incubate overnight con 1 ml di proteine standard di uovo o latte (Sigma-Aldrich), quindi cimentate con 1 ml di estratto ottenuto come sopra descritto.