Immunologia e Immunopatologia

IMMUNOLOGIA DIAGNOSTICA

Tecniche Immunologiche

• La maggior parte delle tecniche di laboratorio biomedico si basano sull’utilizzo degli anticorpi.

• Gli anticorpi sono utilizzati come reagenti ad elevata specificità.

• Gli anticorpi possono essere prodotti per riconoscere ogni tipo di molecola biologica o chimica:

- Proteine - Acidi nucleici - Lipidi - Polisaccaridi - Sostanze chimiche

Anticorpi Monoclonali e Policlonali

  Ogni immunoglobulina riconosce un determinante antigenico diverso (epitopo)

  Ogni antigene possiede numerosi epitopi.

1 clone = 1 epitopo = 1 antigene 1 antigene = n epitopi = n cloni

Reazioni Antigene (Ag)/Anticorpo (Ab)

•  Modello Chiave-Serratura

•  Legami non covalenti: -  Legami Idrogeno -  Legami Elettrostatici - Legami Idrofobici

•  Molti legami tra Ag e Ab

•  Processo Reversibile

Interazione Lisozima/Anti-Lisozima

H L

Ag

Affinità = Somma delle forze attrattive e repulsive

Ab

Ag

Alta Affinità

Ab

Ag

Bassa Affinità

Affinità Anticorpale •  La forza della reazione tra un singolo determinante

antigenico ed un singolo sito di legame dell’anticorpo

Reazione Incrociata (Cross- Reazione)

•  La capacità di un singolo anticorpo di reagire contro più determinanti antigenici.

•  La capacità di una popolazione di anticorpi di reagire contro piu’ antigeni.

Anti-A Ab

Ag A

Anti-A Ab

Ag B

Epitopo condiviso

Anti-A Ab

Ag C

Epitopo simile

Cross-Reazioni

Specificità dell’anticorpo

  La capacità per un singolo anticorpo di reagire contro un solo determinante antigenico.

  La capacità per una popolazione di anticorpi di reagire contro un solo antigene.

Applicazioni degli anticorpi monoclonali

• Gli anticorpi monoclonali sono attualmente utilizzati: - Nei laboratori di ricerca biologica e biomedica - Nei laboratori di diagnostica - Nelle terapie mediche

• Gli anticorpi monoclonali permettono di:

- Determinare la presenza di un antigene (Test qualitativo)

- Misurare la quantità di un antigene (Test quantitativo)

- Purificare l’antigene desiderato (Molecole o Cellule Intere)

Concetto di antigene nelle applicazioni pratiche

Dal punto di vista biologico l’antigene è sempre una molecola riconosciuta da un anticorpo, ma diventa utile per individuare/quantificare cellule, batteri, virus e molte sostanze presenti nel sangue:

 Marker CD = Linfociti e altre cellule del sangue

 Ag batterici e virali = 1. Immunodiagnosi per infezioni 2. Titolo anticorpale

 Marker tumorali = Diagnostica per immagini

 Proteine del sangue = Diagnostica di laboratorio clinico

Test Basati sulle Reazioni Ag/Ab

  Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab permettono di misurare piccole quantità degli immunocomplessi.

  Tutti i test basati sulle reazioni Ag/Ab possono essere utilizzati per misurare l’antigene o l’anticorpo presenti nel campione.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA):

Saggio di Immunoassorbimento Legato ad Enzima

Principio dell’ELISA •  1 componente (Ag o Ab) immobilizzato su piastra

•  1 componente (Ag/ Ab / Anti-Ig) marcato con enzima

•  L’enzima (perossidasi) reagisce con il substrato

•  La reazione produce una colorazione misurabile

Piastra ELISA Ag

Ab specifico

Anti-Ig marcato

Substrato incolore

Substrato dopo la reazione

Enzima

ELISA Diretto per Ag

• Rilevamento dell’Ag 1.  Immobilizare l’Ab 2.  Incubare con il campione

da misurare 3.  Aggiungere l’Ab marcato

con un enzima 4.  La quantita’ di Ab legato

e’ proporzionale alla quantita’ di Ag nel campione del paziente.

  Test Quantitativo

Fase Solida

Ag Immobilizato

Ag nel campione del paziente

Ab marcato

ELISA Diretto per Ab

• Rilevamento dell’Ab 1.  Immobilizare l’Ag 2.  Incubare con il campione

da misurare 3.  Aggiungere l’anti-Ig

marcato con un enzima 4.  La quantita’ di anti-Ig

legato e’ proporzionale alla quantita’ di Ab nel campione del paziente.

  Test Quantitativo

Fase Solida

Ag Immobilizato

Ab nel campione del paziente

Anti-Ig marcato

Immunofluorescenzae

Citofluorimetria

Immunofluorescenza •  Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag?

Antigeni sulla membrana citoplasmatica:

-direttamente accessibili

Antigeni intracellulari:

-inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione

Immunofluorescenza

•  Preparazione dei campioni → Marcatura Ab

Traccianti Fluorescenti:

-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag

- Da 1 a 4 traccianti diversi per un campione

Fluorescenza e Fluorocromi

•  I fluorocromi sono molecole utilizzate come coloranti fluorescenti:

-Assorbono l’energia della luce → Eccitazione -Emettono fluorescenza nel visibile → Emissione

Fluorocromo Eccitazione (nm) Emissione (nm)

Fluoresceina (FITC) 495 519

Rodammina 550 573

Ficoeritrina (PE) 565 578

Texas Red 589 615

Immunofluorescenza

•  Diretta –  L’anticorpo che riconosce l’antigene e’ marcato con un fluorocromo (molecola fluorescente)

Ag

Ab marcato con fluorocromo

Sezione di un tessuto

Immunofluorescenza

  Indiretta   L’Ab che riconosce l’Ag non

e’ marcato   Viene utilizzato un anti-Ig

marcato con un fluorocromo per rilevare il legame del primo Ab.

 Test Qualitativo/Semi-Quantitativo

Ag

Anti-Ig marcato con fluorocromo

Sezione di un tessuto

Ab non marcato

Immunofluorescenza

Area T (Paracorticale)

Area B (Follicoli)

Linfociti T e B all’interno di un linfonodo

Immunofluorescenza

•  Analisi di Tessuti •  Analisi di Singole Cellule

Citofluorimetria

•  Preparazione dei campioni → Accessibilita’ Ag?

Antigeni sulla membrana citoplasmatica:

-direttamente accessibili

Antigeni intracellulari:

-inaccessibili senza trattamento preventivo 1) Fissazione 2) Permeabilizzazione

Citofluorimetria

•  Preparazione dei campioni → Marcatura Ab

Traccianti Fluorescenti:

-1 tracciante per singolo Ab = 1 tracciante per singolo Ag

- Da 1 a 16 traccianti diversi per un campione

Citofluorimetria •  La sospensione di cellule da analizzare viene marcata

con una molecola fluorescente. •  La marcatura avviene con Fluorescenza Diretta o

Indiretta. •  Il campione di cellule viene analizzato con un

citofluorimetro (FACS)

Citofluorimetria

•  Analisi del campione al FACS

Intensità Fluorescenza Verde

Num

ero

di C

ellu

le

Cellule non marcate

Cellule fluorescenti

Istogramma con 1 Parametro

Intensità Fluorescenza Rossa

Inte

nsità

Flu

ores

cenz

a Ve

rde

Istogramma con 2 Parametri

1 2

3 4

Citofluorimetria

•  Esempio: Analisi cellule da sangue periferico

- Miscela di linfociti, monociti e granulociti

- Colorazione con Ab monoclonali:

1) Anti-CD14 (specifico per monociti) marcato con ficoeritrina (PE)

2) Anti-CD45 (presente su tutti i leucociti: linfociti>monociti>granulociti) marcato con fluoresceina (FITC)

Citofluorimetria •  Analisi cellule da sangue periferico (con 1 parametro)

CD14=monociti

Intensita’ Fluorescenza

CD14 PE

CD45=linfociti>monociti>granulociti (1) (2) (3)

CD45 FITC

1 2

3

Citofluorimetria

•  Analisi cellule da sangue periferico (con 2 parametri)

CD45 FITC

CD

14 P

E

CD14=monociti CD45=linfociti>monociti>granulociti

R1=monociti (CD14+) R2=linfociti (CD45>monociti) R3=granulociti (CD45<monociti)