Immunologia e Immunologia Diagnostica -...

ANTICORPI: STRUTTURA E FUNZIONE

Immunologia e Immunologia Diagnostica

Le due vie dell’immunità adattativa

•  Microbi extracellulari: immunità umorale

! Anticorpi

•  Microbi fagocitati e intracellulari: immunità cellulare

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Caratteristiche dell’immunità adattativa


Anticorpi: Specificità, Diversità, Espansione

•  Specificità: 1 linfocita B (clone) 1 recettore 1 antigene

•  Diversità: ogni recettore è diverso dagli altri (>109)

•  Espansione clonale: ogni antigene seleziona un clone e lo moltiplica


Anticorpi: proprietà generali

•  Proteine plasmatiche della frazione gammaglobuline.

•  Anticorpi = Immunoglobuline (Ig)

•  Molecole specializzate per riconoscere un antigene.

•  Uniche cellule produttrici: linfociti B.

•  Due varianti biologiche: - Anticorpi di membrana (recettore linfociti B) - Anticorpi solubili (secrezione plasmacellule differenziate)

•  Anticorpi solubili : plasma, secrezioni mucosali e fluidi tissutali.


Struttura degli Anticorpi •  Tutti gli anticorpi hanno la stessa struttura molecolare, ma

grande variabilità nella regione che lega l’antigene.

•  Struttura simmetrica: - 2 catene polipeptidiche leggere (catene L) - 2 catene polipeptidiche pesanti (catene H)


Struttura degli Anticorpi •  Le catene H e L sono costituite da una serie di domini

proteici ripetuti: il dominio immunoglobulinico (Ig), circa 110 aminoacidi.

•  Le catene H e L sono caratterizzate da: - Regioni variabili (legame antigene) - Regioni costanti (funzioni effettrici)


Struttura degli Anticorpi •  Le catene H e L sono legate tra di loro in maniera covalente

da ponti disolfuro.

•  Anche le due catene H sono legate da ponti disolfuro: Nelle IgG si trovano vicino la “regione cerniera”, importante per la flessibilità dell’anticorpo.


Il sito di legame per l’antigene •  È formato dalla disposizione tridimensionale delle regione

variabili di una catena H e di una catena L.

•  Ogni monomero anticorpale possiede 2 siti di legame: 2 x (VH-VL)


Denominazione delle regioni funzionali

•  Il trattamento degli anticorpi IgG con enzimi proteolitici genera frammenti con caratteristiche distinte, che danno il nome alle diverse regioni dell’immunoglobulina.

•  Papaina: - Frammento monovalente con il sito di legame per l’antigene (Fragment antigen binding) = Fab - Frammento cristallizabile = Fc

•  Pepsina: - Frammento bivalente con il sito di legame per l’antigene = F(ab’)2


Denominazione delle regioni funzionali


Caratteristiche delle regioni variabili

•  La variabilità nelle sequenze aminoacidiche delle Ig si concentra nelle regioni ipervariabili e determina la specificità dei diversi anticorpi.

•  Regioni ipervariabili (∼10 aa): - 3 segmenti della regione VH - 3 segmenti della regione VL

•  Regioni ipervariabili = Regioni che determinano la complementarità (CDR): - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena H) - CDR1, CDR2 e CDR3 (catena L)


Caratteristiche delle regioni variabili

•  Le 6 regioni ipervariabili si associano in una struttura tridimensionale che forma il sito di legame per l’Ag.

•  L’impalcatura dell’Ig resta sempre la stessa.

•  La grande diversificazione delle sequenze CDR cambia la specificità di ogni anticorpo.


Importanza delle regioni ipervariabili

•  La capacità di legare l’Ag dipende principalmente dalle regioni CDR.

•  Gli aminoacidi che variano più frequentemente sono quelli che entrano in contatto con la molecola bersaglio.


Importanza delle regioni ipervariabili

Diversità delle regioni ipervariabili = Diversità del sito di legame per l’antigene = Diversità anticorpale


Caratteristiche delle regioni costanti

•  Ogni molecola anticorpale contiene due tipi di regioni costanti (C): - Regioni CH catene pesanti - Regioni CL catene leggere

•  Le regioni CH determinano: - la classe anticorpale (isotipo) - la funzione effettrice dell’anticorpo - la “flessibilità” dell’anticorpo (regione cerniera) - la forma di secrezione o di membrana


Forme secrete e di membrana •  La regione aminoacidica dell’ultima regione CH determina se

l’anticorpo è solubile o legato alla membrana citoplasmatica.

•  A seconda dell’isotipo, le forme secrete possono essere monomeriche o formare complessi multimerici.

•  I complessi multimerici sono legati alla catena J, una proteina che stabilizza e trasporta il complesso (epiteli).


Le classi anticorpali

•  Le immunoglobuline umane sono classificate in 5 isotipi: - IgA, IgD, IgE, IgG e IgM

•  Alcune classi sono ulteriormente suddivise in sottoclassi: - IgA IgA1 e IgA2 - IgG IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4

•  Per ogni isotipo/sottotipo: tutte le regioni costanti delle catene H hanno la stessa sequenza aminoacidica.

•  La sequenza aminoacidica è invece diversa nei vari isotipi/sottotipi.


Immunoglobuline A (IgA) •  Catene pesanti α (alfa).

•  Forme secrete: monomero, dimero, trimero.

•  Ruolo nell’immunità delle mucose:

-  secrete nel lume intestinale e respiratorio

-  neutralizzazione di microbi e tossine


Immunoglobuline D (IgD)

•  Catene pesanti δ (delta).

•  Nessuna forma secreta.

•  Immunoglobulina di membrana dei linfociti B naïve = Recettore dei linfociti B (BCR)

•  Ruolo nell’attivazione dei linfociti B plasmacellule


Immunoglobuline E (IgE) •  Catene pesanti ε (epsilon).

•  Forma secreta: monomero.

•  Ruolo fisiologico: difesa contro gli elminti

•  Ruolo immunopatologico:

reazioni di ipersensibilità immediata


Immunoglobuline G (IgG)

•  Catene pesanti γ (gamma).

•  Forma secreta: monomero.

•  Isotipo maggiormente abbondante nel siero

•  Molteplici funzioni effettrici


Immunoglobuline G (IgG)

•  Ruolo fisiologico: -  Neutralizzazione microbi e tossine -  Opsonizzazione antigeni -  Attivazione classica del complemento -  Citotossicità cellulare anticorpo-dipendente (ADCC) -  Immunità neonatale (via placenta)

•  Ruolo immunopatologico: - Autoimmunità - Ipersensibilità tipo II e III


Immunoglobuline M (IgM) •  Catene pesanti µ (mu). •  Due forme alternative:

-  Ig di membrana dei linfociti B naïve (BCR). -  Forma secreta: pentamero.


Immunoglobuline M (IgM)

•  Ruolo fisiologico: -  Attivazione dei linfociti B plasmacellule -  Attivazione classica del complemento

•  Ruolo immunopatologico: - Autoimmunità - Ipersensibilità tipo II e III


L’espressione dei geni per le Ig varia in dipendenza dello stadio di maturazione e attivazione dei linfociti B.

1.  Linfocita pre-B: catene pesanti µ + catene leggere surrogate

2.  Linfocita B immaturo: IgM complete di membrana

3.  Linfocita B maturo: IgM e IgD di membrana

4.  Linfocita B attivato: scambio isotipico e basso livello di secrezione

5.  Plasmacellula: elevato livello di secrezione anticorpale

Sintesi ed espressione degli anticorpi


Sintesi ed espressione degli anticorpi


Risposta primaria e secondaria dei linfociti B

•  La risposta primaria è la prima risposta ad un antigene, che attiva i linfociti naïve in grado di riconoscerlo.

•  Gli incontri successivi con lo stesso antigene stimolano le risposte secondarie, mediate dall’attivazione dei linfociti della memoria: -  più rapide -  più intense -  più efficaci

Ottimizzazione della risposta immunitaria: ogni incontro successivo con il patogeno genera nuove cellule memoria e attiva quelle ancora presenti.


Risposta primaria e secondaria dei linfociti B


Immunità Attiva e Passiva •  Esposizione ad un antigene Risposta immunitaria Immunità Attiva

•  Trasferimento di siero (anticorpi) o di cellule (linfociti) da un individuo immune ad uno non immune Immunità Passiva


Immunità Attiva: Esempi •  Fisiologico: tutte le risposte dell’immunità adattativa contro patogeni e tossine. •  Clinico: vaccinazioni contro le malattie infettive.


Immunità Passiva: Esempi •  Fisiologico: trasferimento degli anticorpi materni al feto (IgG via placenta) e al neonato (IgA via latte).

•  Clinico:

- Anticorpi anti-tossina (tetano, botulino, etc.)

- Anticorpi anti-ofidici (veleno di serpenti)

Caratteristiche del principio attivo   Frammenti di immunoglobulina purificati Fab o F(ab’)2

  Preparazione plasmatica di origine equina o ovina.   Rischio effetti collaterali: reazioni di ipersensibiltà, reazione anafilattica.


Anticorpi Monoclonali e Policlonali •  Ogni cellula B naïve (clone) esprime un recettore per l’antigene (BCR) con specificità diversa.

•  Ogni clone attivato differenzia in plasmacellule che secernono un’immunoglobulina con la stessa specificità.


Anticorpi Monoclonali e Policlonali •  Ogni recettore/immunoglobulina riconosce un determinante antigenico diverso (epitopo)

•  Ogni antigene possiede numerosi epitopi.

1 clone = 1 epitopo = 1 antigene 1 antigene = n epitopi = n cloni Immunologia e Immunologia Diagnostica

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Generazione di Anticorpi Monoclonali

•  Presupposto: i mielomi sono tumori delle plasmacellule e producono anticorpi monoclonali.

•  Conseguenza: immortalizzando i linfociti B specifici per un dato antigene, si possono generare anticorpi monoclonali specifici.

•  Metodo:

1.  Creare una fusione cellulare tra linfociti B e linee di mieloma.

2.  Selezionare le cellule fuse Ibridomi.

3.  Separare i singoli cloni di ibridoma.

4.  Analizzare gli anticorpi prodotti da ciascun clone di ibridoma.

5.  Individuare il clone/anticorpo di interesse.


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