Per approfondimentihttp://www.bdbiosciences.com/eu/s/training/e-learning

Cos’e un citofluorimetro?

Come si desume dal nome, il citofluorimetro è uno strumento che analizza le cellule (o le particelle) contenute in un fluido misurandone le proprietà ottiche e di fluorescenza.

Origine della citoflurimetria a flussoLa comparsa della citofluorimetria a flusso avvenne intorno agli anni ‘70,determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente era limitata alla misura di 1-2 parametri: uno per le misure fisiche e l’altro per la fluorescenza.

La citofluorimetria nacque principalmente come strumento per la ricerca e l’analisi in campo ematologico ed immunologico e portò un grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali marcati con fluoresceina (FITC). La grande complessità del sistema immunitario e la presenza di diverse subpopolazioni stimolarono:– lo sviluppo di anticorpo monoclonali (MoAb) sempre più specifici– la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli anticorpi– la creazione di citofluorimetri multiparametriciSolo in tempi più recenti la disponibilità di strumenti affidabili ed a costo contenuto ne ha consentito una diffusione anche in altri settori.

Come Funziona?Il sistema fluidico avvia la sospensione di cellule verso la cella di flusso facendo in modo che esse si allineino singolarmente e con un flusso di liquido costante e predeterminato in modo da consentire la misura della concentrazione.

Il sistema ottico, costituito da un apparato di eccitazione ed uno di rilevazione del segnale, misura le propietà ottiche delle singole cellule che transitano nella cella di flusso:• Forward scattering• Side scattering• Fluorescenza

Il sistema elettronico, converte la rivelazione ottica in un segnale elettrico e lo digitalizza, consentendone l’elaborazione da parte del computer

Schema della cella di flusso

Cell SortingIl sistema fluidico del citofluorimetro prevede normalmente lo scarto dei liquidi e dei campioni analizzati.Alcuni strumenti (di categoria e costo superiore) sono però dotati della capacità di separare e recuperare le cellule in funzione di alcuni parametri preimpostati (cell sorting).In questo caso lo strumento prende il nome di FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter).

Nel FACS, un dispositivo fa in modo che il flusso di liquido che esce dalla cella venga frammentato in singole goccioline contenenti le singole cellule analizzate. Nel caso la cellula risponda ai valori preimpostati il flusso viene caricato elettricamente in modo che la carica sia ritenuta dalla la goccia corrispondente al momento del distacco.

La traiettoria della goccia passerà in mezzo ad un campo elettrico generato dalle placche di deflessione. A seconda della sua carica la goccia potrà essere deviata in una o nell’altra direzione per essere raccolta in una provetta, oppure proseguire verso il contenitore dei reflui.

N.B.: Lo strumento di cui ci siamo dotati non è un FACS ma un citofluorimetro analitico

Tipologie di campione e caratteristiche che si possono misurare

Esempi di campioni analizzabili

Intervallo di dimensioni delle particelle

Caratteristiche misurabili

Caratteristiche ottiche

Il raggio della sorgente di eccitazione principale (solitamente un laser ad Argon blu a 488nm) colpisce la cellula che sta transitando nella cella di flusso.Esso può essere: A) parzialmente assorbito/ leggermente rifratto oppure B) disperso/diffuso.Questi due comportamenti vengono misurati da due distinti rilevatori posizionati rispettivamente in posizione opposta alla sorgente di eccitazione (Forward Scattering – FSC) o in posizione ortogonale (Side Scattering – SSC).

FSC e SSCDai valori di FSC è perciò possibile ottenere

indicazioni sulla dimensione e sull’indice di rifrazione

della particella mentre i valori di SSC ci indicano la

presenza di granuli o la torbidità del citoplasma che

comportano dispersione della luce.N.B.: questo tipo di analisi non richiede colorazione del campione.

Proprietà di FSC ed SSC di una popolazione di leucociti umani

Analisi in fluorescenza Altre caratteristiche della cellula possono essere

evidenziate mediante proprietà di autofluorescenza

o utilizzando fluorocromi ad hoc.

L’espressione di particolari antigeni può essere

evidenziata mediante l’utilizzo di anticorpi coniugati

con una molecola fluorescente

Alcune molecole, come gli acidi nucleici possono

essere rilevate mediante la colorazione diretta con

fluorocromi specifici.

L’uso di fluorocromi con differente permeabilità

attraverso la membrana cellulare consente anche di

valutare l’integrità di questa struttura.

Analisi per un parametro

L’espressione di un antigene può essere rappresentata come un grafico di distribuzione che mette in relazione l’intensità della fluorescenza ed il numero di cellule che ricade in ogni intervallo.

Analisi per più parametriL’utilizzo di molteplici sorgenti di eccitazione e/o di diversi filtri di emissione, consente di valutare contemporaneamente fenomeni di fluorescenza differenti.Questo consente di utilizzare contemporaneamente fluorocromi diversi per evidenziare diversi parametri.

Ficoeritrina

Fluoresceina isotiocianato

Alloficocianina

BD Accuri: Fluorocromi com

patibili

BD Accuri: Fluorocromi compatibili

BD Accuri C6 Plus fluorochrome supportAll fluorochromes in the table can be detected by the BD Accuri C6 Plus equipped with standard filters. Optional filters can be used to increase resolution or to separate fluorochromes with overlapping signals, like GFP and YFP.

Analisi multiparametrica

Four-color whole blood immunophenotyping panel on the BD Accuri C6 PlusWhole blood was stained with fluorescent antibodies to CD3, CD56, CD14, and CD19 and acquired and analyzed on a BD Accuri C6 Plus. Side scatter and CD14 expression were used to discriminate lymphocyte and monocyte populations. Within the lymphocyte gate, percentages of T cells, NKT cells, NK cells, and B cells were quantified based on expression of CD3, CD56, and CD19. In all, five blood cell populations were identified in a single tube using four colors.

L’espressione di più antigeni può essere rappresentata come un grafico a due dimensioni che mette in relazione di volta in volta l’espressione di una due parametri.

Una sottopopolazione di cellule può essere ulteriormente selezionata per visualizzare l’espressione di altre caratteristiche

Analisi della vitalità in popolazioni batteriche

Bacterial viability on the BD Accuri C6 PlusSYBR® Green and propidium iodide (PI) were used to discriminate live vs dead E. coli bacteria after treatment with varying concentrations of ethanol. Ethanol’s bactericidal effect on cellviability was dose-dependent. Cell counts were similar using direct volume measurement in BD Accuri C6 Plus software compared to a normalized internal reference bead control.

La doppia colorazione del DNA con fluorocromi permeanti o non permeanti la membrana cellulare evidenziano lo stato di integrità della stessa, che è correlato alle condizione di vitalità della cellula (i.e.: cellule vive vs. morte)