Broadband Stimulated Raman Scattering: il ruolo delle...

Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e

Naturali

Corso di Laurea Magistrale in Chimica

Broadband Stimulated

Raman Scattering: il ruolo

delle risonanze elettroniche

nel caso della mioglobina.

Laureando: Relatore:Gaia Giovannetti Prof. Tullio Scopigno

ANNO ACCADEMICO 2017-2018

What Emanations,Quick vibrations

And bright stirs are there?

Henry Vaughan

Indice

1 Mioglobina 61.1 Ruolo e struttura della mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.2 Struttura elettronica della mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . 91.3 Modi normali di vibrazione della mioglobina . . . . . . . . . . . . 11

2 E�etto Raman 142.1 Raman spontaneo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.2 Raman stimolato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.3 Cenni di Raman risonante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.4 Trattazione quantistica dello scattering Raman stimolato . . . . 21

2.4.1 L'operatore densità . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.4.2 Evoluzione della matrice densità e dinamica nello spazio

di Liouville . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.4.3 Soluzione per hamiltoniane dipendenti dal tempo . . . . . 23

2.5 Equazioni di Maxwell e polarizzazione non lineare . . . . . . . . 272.5.1 Four wave mixing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.6 L'approccio diagrammatico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.6.1 Diagrammi di Feynman e FWMEL . . . . . . . . . . . . . 32

2.7 Il sistema a tre livelli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352.7.1 SRS(I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.7.2 SRS (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.7.3 IRS(I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.7.4 IRS(II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

2.8 Calcolo della polarizzazione per speci�che coppie di campi . . . . 372.8.1 Calcolo della polarizzazione per RRS(Icc) e IRS(Ica) . . 382.8.2 Calcolo della polarizzazione per HL(Icc) e HL(IIcc) . . . 41

3 Apparato sperimentale 453.1 Sorgente laser . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.2 Layout ottico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.2.1 Raman pulse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463.2.2 Stokes probe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.3 Sistema di rivelazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553.4 Calibrazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.5 Preparazione del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

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INDICE 3

4 Risultati e discussione 584.1 Evidenze sperimentali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584.2 Procedura di interpolazione, sottrazione della linea di base e

calibrazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 654.3 Conclusioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

A Electronic Resonances in Broadband Stimulated Raman

Spectroscopy 68

Introduzione

Negli anni Trenta Alfred E. Treibs isolò per la prima volta alcune metallopor-�rine dal petrolio, aprendo la strada allo studio di una delle classi di chelatimetallorganici di maggiore rilevanza in ambito biologico. Le metallopor�rinesono infatti protagoniste di un ampio spettro di funzioni nei sistemi biologiciche vanno dal trasferimento di elettroni, alla fotosintesi e al trasporto di ossige-no; esse costituiscono i centri di reazione di molti enzimi essenziali per la vita.In particolare nell'ultima parte del ventesimo secolo l'interesse della comunitàscienti�ca si è rivolto verso lo studio delle emoproteine, in virtù dell'importanzadel gruppo eme come gruppo prostetico o cofattore in alcune proteine chiave neiprocessi biologici fondamentali per la vita. Tra le emoproteine più importan-ti si annoverano l'emoglobina, la mioglobina, la neuroglobina e il citocromo-c;tuttavia esiste un'ampia varietà di emoproteine disponibili, che di�eriscono perla natura, lo stato di ossidazione e di spin dell'atomo centrale, per i ligandi as-siali e per i sostituenti periferici che introducono cambiamenti sistematici nellastruttura e quindi nello spettro elettronico e vibrazionale della proteina. L'emeinfatti conferisce a queste proteine non solo proprietà chimiche biologicamen-te rilevanti, ma anche caratteristiche spettroscopiche particolari. Non a casole emoproteine costituiscono una delle classi di molecole più studiate nell'eramoderna della spettroscopia Raman, poichè o�rono l'opportunità di investigareuna vasta gamma di e�etti di risonanza elettronica nel campo della luce visibile.

La spettroscopia basata sull'e�etto Raman spontaneo costituisce un ecce-zionale strumento per sondare la struttura vibrazionale di una molecola. Incondizioni di risonanza elettronica, la cross section può essere selettivamente in-crementata, rendendo la tecnica strutturalmente sensibile a speci�ci cromofori.Tuttavia, anche in condizioni di risonanza, il Raman spontaneo può presentareun basso rapporto segnale rumore ed una sezione d'urto ordini di grandezza in-feriore rispetto all'emissione di �uorescenza, che quindi può facilmente oscurarei segnali Raman. Tale inconveniente può essere aggirato ricorrendo alla tecnicadel cosiddetto Raman stimolato (SRS); tuttavia in quest'ultimo caso gli e�ettidi risonanza elettronica si manifestano in una forma più complessa e sono piùdi�cili da interpretare.

La presente trattazione si pone pertanto un duplice intento: da un lato ca-ratterizzare il gruppo eme di una nota emoproteina, la mioglobina, in terminidella sua struttura vibrazionale tramite la spettroscopia Raman stimolata; dal-l'altro, sfruttare questo esempio per proporre una procedura generale volta all'interpretazione degli e�etti di risonanza elettronica e alla estrazione del RamanExcitation Pro�le (REP) a partire da forme di riga complesse. Per questo è

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INDICE 5

necessario sviluppare un modello teorico, basato su una trattazione quantisticadella materia, che tramite uno sviluppo perturbativo al terzo ordine della matri-ce densità permetta di individuare i processi �sici responsabili del segnale SRS.

Per comprendere appieno lo scopo di questa tesi occorre avere una chiaraconoscenza della struttura chimica della mioglobina e una comprensione appro-fondita degli aspetti teorici e tecnici che caratterizzano la spettroscopia Ramanstimolata. Pertanto la tesi è strutturata come segue.

Nel Capitolo 1 è stata a�rontata una descrizione della mioglobina da unpunto di vista biologico. Dopo una breve descrizione del gruppo eme dal puntodi vista strutturale, particolare enfasi è stata data alla sua struttura elettronica.

Nel Capitolo 2 si introduce una accurata descrizione teorica della tecnica spe-rimentale utilizzata, introducendo dapprima il Raman stimolato da un punto divista classico e ricorrendo successivamente al formalismo della matrice densità,per descrivere quantisticamente la materia.

Nel Capitolo 3 è riportata un'illustrazione dello strumento utilizzato e unadescrizione della preparazione del campione.

Nel Capitolo 4 sono stati presentati i dati acquisiti con i risultati cui si èpervenuti. Il capitolo termina con una sintesi complessiva dei risultati ottenutie con alcune considerazioni su possibili sviluppi futuri.

In Appendice A è riportata per intero la pubblicazione che è stata �nalizzatanell'ambito di questo lavoro di tesi.

Capitolo 1

Mioglobina

1.1 Ruolo e struttura della mioglobina

La mioglobina è una proteina citoplasmatica espressa solamente nei mitocondricardiaci e nelle �bre ossidative dei muscoli scheletrici. La mioglobina fu cosìchiamata a causa della sua somiglianza strutturale e funzionale con l'emoglo-bina. Da un punto di vista evolutivo mioglobina ed emoglobina si originaronomolto probabilmente da un gene ancenstrale comune più di cinquecento milionidi anni fa. Come l'emoglobina, la mioglobina lega reversibilmente la molecoladi O2, facilitandone il trasporto dai globuli rossi ai mitocondri nei periodi dielevata attività metabolica; essa può inoltre agire da riserva di O2 in condizionidi anossia o ipossia. Tuttavia al contrario della mioglobina che, a causa dellasua struttura tetramerica, presenta una cinetica di saturazione sigmoidale perquanto riguarda il binding dell'ossigeno, la mioglobina monomerica lega la mo-lecola di O2 secondo una cinetica Michaelis-Menten, mostrando una curva disaturazione iperbolica.A partire dalla scoperta della sua struttura, la mioglobina è stata oggetto dinumersi studi volti ad investigarne le relazioni tra la sua struttura e la sua fun-zionalità. La mioglobina è infatti oggi nota per la sua capacità di immagazzina-re riserve di ossigeno nei muscoli, ruolo estremamente evidente nei mammiferimarini. In assenza di ossigeno inspirato l'ossigeno immagazzinato nelle moleco-le di mioglobina diventa disponibile per il rifornimento dei muscoli locomotoricoinvolti nell'attività di immersione; tale ruolo è confermato dal fatto che laconcentrazione di mioglobina nei muscoli dei mammiferi marini è dalle dieci alletrenta volte superiore a quella osservata in animali che non sperimentano apneeprolungate. Infatti, quando l'apporto di ossigeno termina durante l'immersionea respiro trattenuto, l'ossigeno legato alla mioglobina è rilasciato per sostenereil metabolismo anaerobico nei muscoli attivi. Inoltre è stato proposto per lamioglobina il ruolo di tampone nei confronti della concentrazione di ossigenointracellulare, la quale è mantenuta costante anche nei casi di forte aumento di�usso di ossigeno dai capillari ai mitocondri causato da un aumento di attivitàmuscolare.Recentemente la mioglobina è stata anche identi�cata come molecola in grado difacilitare la di�usione di O2 all'interno dei mitocondri, o�rendo un meccanismoparallelo e alternativo alla di�usione semplice di ossigeno. [1]

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CAPITOLO 1. MIOGLOBINA 7

La mioglobina è la prima proteina di cui è stata determinata la strutturatridimensionale tramite cristallogra�a ai raggi X (Kendrew, 1963). La sua strut-tura consiste in una singola catena polipeptidica formata da 154 amminoacidied è caratterizzata da una struttura secondaria organizzata in otto α − eliche(indicate con le lettere alfabetiche dalla A alla H), disposte in modo da formareuna proteina con struttura terziaria globulare di dimensioni approssimativamen-te pari a 44 x 44 x 25 Å3 (Fig. 1.1A). La mioglobina contiene un unico gruppoprostetico che consiste in gruppo eme di tipo B immerso in una tasca idrofobicatra le eliche E ed F. L' eme B (protopor�rina IX) è un complesso por�rinico delFe(II) (complesso ferro-por�rina) in cui un atomo di Fe è coordinato da cinqueligandi, quattro dei quali sono atomi di azoto appartenenti agli anelli pirrolicicooplanari dell'anello por�rinico, connessi tra loro da ponti metinici. La cate-na laterale imidazolica del residuo His93 (comunemente indicata come HisF8poiché si tratta dell'ottavo residuo dell'elica F) fornisce il quinto ligando e sta-bilizza il gruppo eme inducendo un lieve spostamento dell'atomo di Fe rispettoal piano dell'anello tetrapirrolico. Il complesso por�rinico è ulteriormente stabi-lizzato dalla catena laterale del residuo His64 (His E7) dell'apoproteina. Esistetuttavia anche una sesta posizione, non occupata nella mioglobina "deoxy", chefunge da sito di binding per potenziali ligandi (Fig 1.2B).

Figura 1.1: (A) struttura della mioglobina. Lo scheletro della proteina consistein otto α-eliche che circondano una tasca contenente il gruppo heme. (B) Ilgruppo protoeme è stabilizzato dai residui His93 e His64.

Il gruppo eme ha un ruolo centrale nella de�nizione delle proprietà chimichee spettroscopiche delle emoproteine. La presenza di questo gruppo prosteticoconferisce alla mioglobina la capacità di legare piccole molecole, come ad esem-pio O2, NO, CO e H2S, trasformandosi da mioglobina in forma "deoxy", ossiapriva di ligandi esogeni, nella forma "oxy" caratterizzata dalla sesta posizioneoccupata. In presenza di ossigeno, l'atomo di Fe(II) dell'eme isolato è ossidatoin maniera irreversibile a Fe(III) (stato di ossidazione che non è in grado dilegare O2) generando metamioglobina, che è la forma della proteina più sta-


bile all'aria. La componente proteica della mioglobina impedisce in molti casitale ossidazione, rendendo possibile la formazione di un legame reversibile conl'ossigeno molecolare. Il binding di O2 altera lo stato elettronico del complessoFe(II)-eme, come indica la variazione da rosso scuro (il colore dell'emoglobinae della mioglobina nel sangue venoso) a rosso scarlatto (tipico dell'emoglobinae della mioglobina del sangue arterioso). In determinate condizioni può tutta-via veri�carsi un'ossidazione della mioglobina a metamioglobina; a quest'ultimaproteina si deve il colore marrone della carne vecchia o del sangue secco. Inquest'ultimo caso, poiché gli anelli pirrolici chelano un atomo di Fe(III), il com-plesso Fe-por�rina prende il nome di "hemin" e presenta una carica formalepositiva che viene in genere stabilizzata dalla presenza di un anione, ad esempioil cloruro. Esiste tuttavia anche una sesta posizione, non occupata nella mio-globina "deoxy", che funge da sito di binding per potenziali ligandi come O2,NO e CO.La di�razione di RX ha evidenziato la presenza di cavità interne all'interno dellamolecola di mioglobina che si pensa possano servire a concentrare e orientarele molecole per favorirne il binding da parte dell'eme. Anche l'anello pirroli-co contribuisce alla funzionalità biologica della mioglobina; infatti sia i pontimetinici che connettono gli anelli pirrolici, sia i gruppi vinilici e i gruppi propio-nato che funzionalizzano l'anello por�rinico nell'eme B sono in grado di legarela mioglobina ad altre proteine (Fig. 1.2).

Figura 1.2: struttura molecolare del gruppo prostetico eme B (protopor�rinaIX). L'eme B consiste in un anello por�rinico funzionalizzato con gruppi vinilicie propionici.


1.2 Struttura elettronica della mioglobina

Lo spettro di assorbimento della mioglobina è mostrato in Fig. 1.3.

Figura 1.3: spettro di assorbimento nel visibile della mioglobina "deoxy".

La por�rina isolata, indipendentemente dalla presenza di un atomo centrale,è un macrociclo aromatico a 26 elettroni su�cientemente esteso da presentareuna con�gurazione elettronica caratterizzata da una separazione energetica tragli orbitali π e π∗ relativamente piccola (pari a circa 2 eV): pertanto le metallo-por�rine sono cromofori che assorbono fortemente la luce nella regione visibilee in quella del vicino ultravioletto dello spettro. Lo spettro di assorbimento diuna metallopor�rina presenta una banda molto intensa, detta banda Soret obanda B, centrata intorno a 400 nm e due bande meno intense tra 500 nm e 600nm, denominate rispettivamente Q0 e Qv, o più semplicemente α e β (Fig. 1.3).La natura di queste bande può essere meglio compresa facendo riferimento almodello a quattro orbitali di Gouterman illustrato in Fig. 1.4.


Figura 1.4: spettro di assorbimento nel visibile della mioglobina "deoxy". Inalto a destra è mostrato lo schema a quattro orbitali del modello di Gouterman.[2]

Assumendo per l'anello tetrapirrolico una simmetria idealizzata D4h, gli or-bitali π∗ non occupati a più bassa energia sono degeneri e hanno simmetria eg,mentre i due orbitali π occupati a più alta energia sono di simmetria a1u e a2u.Nonostante non siano degeneri, i due orbitali a più bassa energia hanno energiamolto simile. Ne deriva una forte interazione di con�gurazione tra le transizio-ni orbitaliche a1u→eg e a2u→eg; i dipoli di transizione associati a queste duetransizioni si combinano in fase per dare una intensa banda Soret, mentre inter-feriscono distruttivamente per dare una banda Q0 molto debole (la cui intensitàè nulla se i due orbitali a1u e a2u sono accidentalmente degeneri). La banda Qvè invece il risultato dell'accoppiamento vibronico tra la banda Soret e Q0: essacostituisce un inviluppo delle transizioni vibroniche indotte da un mescolamentodelle transizioni Soret e Q0. [2]

Risulta pertanto evidente il motivo per cui negli ultimi vent'anni le emopro-teine sono diventate una delle classi di molecole più studiate tramite la spet-troscopia Raman. Le transizioni elettroniche π-π∗ presentano una energia ditransizione relativamente bassa e pertanto risultano convenientemente eccitabilitramite luce laser visibile; inoltre i fenomeni di interazione di con�gurazione emixing vibronico tra queste transizioni producono una serie di interessanti ef-fetti di risonanza elettronica negli spettri Raman, che possono essere esaminatiselettivamente al variare la lunghezza d'onda di eccitazione.


1.3 Modi normali di vibrazione della mioglobina

Nelle Fig. 1.5 e 1.6 è riportato lo spettro Raman risonante della mioglobina"deoxy", rispettivamente di bassa e alta frequenza.

Figura 1.5: spettro Raman risonante di bassa frequenza della mioglobina"deoxy". [3]

Figura 1.6: spettro Raman risonante di alta frequenza della mioglobina "deoxy".[3]

In generale lo spettro Raman costituisce un �ngerprint speci�co della strut-tura vibrazionale della por�rina. Il gruppo eme all'interno della mioglobinamantiene gran parte delle caratteristiche vibrazionali della metallopor�rina iso-lata, con la di�erenza che le distorsioni introdotte dall'apoproteina riducono la


simmetria del sistema attivando nuovi modi normali. Di seguito si riporta unatabella contenente i modi normali di vibrazione della mioglobina "deoxy".

Figura 1.7: tabella dei modi normali della mioglobina "deoxy" misurati tramitespettroscopia Raman spontanea in condizioni di risonanza. In verde sono ripor-tati i modi di bassa frequenza, in giallo quelli di alta frequenza. L'assegnazionedei modi a 390, 482, 1133, 1175, 1398, 1427, 1455 cm−1 è ancora incerta. νindica un modo di stretching, δ indica un modo di bending, mentre γ indica unmodo di wagging fuori dal piano della por�rina. [3, 4]

La risonanza elettronica genera un aumento dell'intensità dei picchi Ramaned inoltre garantisce selettività strutturale, permettendo di isolare il contributoRaman proveniente esclusivamente dal cromoforo, la protopor�rina IX, rispettoa quello dell'apoproteina. L'e�etto Raman risonante (RR) verrà in dettagliospiegato nel Capitolo 3. E' tuttavia importante evidenziare che l'entità del-l'aumento della cross section di un particolare modo in condizioni di risonanzadipende dall'accoppiamento speci�co del modo con la transizione elettronica.Infatti, i vari modi subiscono un grado di ampli�cazione diversa a seconda dellalunghezza d'onda di eccitazione selezionata. Ad esempio, nel caso della mio-globina "deoxy", i modi caratterizzati da simmetria A1g (come ν3, ν4, e ν5)appaiono molto intensi quando la lunghezza d'onda di eccitazione corrispondeal massimo della banda Soret dello spettro di assorbimento, mentre appaiono


molto meno intensi quando la lunghezza d'onda di eccitazione corrisponde almassimo della banda Q. Viceversa, un'eccitazione in banda Q aumenta notevol-mente la cross section dei modi con simmetria B1g e A2g (ν10−28). Pertanto,regolando la lunghezza d'onda di eccitazione, è possibile ampli�care in manieraselettiva determinati modi di vibrazione per ottenere informazioni strutturalianche in condizioni di bassa cross section e in presenza di campioni a bassaconcentrazione [4]; inoltre, si può ottenere in questo modo uno spettro Ramanestremamente sempli�cato che facilita l'assegnazione delle frequenze dei moditramite sostituzione isotopica e studi comparativi. [5]

Capitolo 2

E�etto Raman

La spettroscopia Raman è una tecnica che si basa sulla di�usione anelasticadella luce da parte della materia e permette di studiare lo spettro vibrazionaledi un sistema con numerosi vantaggi rispetto alla spettroscopia di assorbimentoIR. Quando la lunghezza d'onda del laser è in risonanza con una transizioneelettronica caratteristica del campione si parla di Raman risonante (RR). Lacondizione di risonanza elettronica genera un incremento generale della sezio-ne d'urto del processo Raman e rende la tecnica strutturalmente selettiva neiconfronti di speci�ci cromofori presenti nel campione. La versione stimolatadell'e�etto Raman (SRS) consente di aumentare ulteriormente la sezione d'urtodi diversi ordini di grandezza rispetto al Raman spontaneo. Tuttavia il compor-tamento di uno spettro SRS in condizioni di risonanza elettronica è molto piùcomplesso di quello manifestato nel caso del Raman spontaneo, come si vedrànel Capitolo 4.Di seguito si riporta una trattazione classica del Raman spontaneo, seguita dauna descrizione delle caratteristiche principali della tecnica SRS; successivamen-te verrà trattato l'e�etto Raman stimolato dal punto di vista semiclassico.

2.1 Raman spontaneo

L'e�etto Raman spontaneo consiste nell'interazione anelastica della luce con lamateria. Quando una radiazione monocromatica a frequenza ω investe la ma-teria, parte della luce viene di�usa. Analizzando in frequenza la luce di�usasi trovano sia fotoni con frequenza pari a quella incidente, sia fotoni a nuo-ve frequenze ω′ = ω ± ωRi , dove ωRi è una delle frequenze rotovibrazionali delcampione. Lo scattering elastico non comporta un cambiamento della frequenzaed è detto e�etto Rayleigh, mentre lo scattering anelastico comporta la genera-zione di nuove frequenze ed è detto e�etto Raman. Le righe Raman sono detteStokes o anti-Stokes rispettivamente se la frequenza generata è minore o mag-giore di quella incidente. Dal punto di vista molecolare, lo scattering Rayleigho Raman comporta una transizione da uno stato iniziale a ad uno stato �naleb attraverso il passaggio per uno stato elettronico eccitato n che può essere vir-tuale o appartenere a un pacchetto di stati stazionari (in questo caso si parla diRayleigh o Raman risonante). Il fotone incidente non è dunque propriamenteassorbito, perché l'energia h̄ω del fotone in generale non corrisponde al gap tra

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CAPITOLO 2. EFFETTO RAMAN 15

due livelli energetici della molecola. Dalla conservazione dell'energia segue cheper lo scattering Rayleigh Eb = Ea, mentre per per lo scattering Raman Stokese anti-Stokes si ha rispettivamente Eb < Ea e Eb > Ea.

L'e�etto Raman spontaneo può essere spiegato in prima approssimazionecon argomentazioni classiche. [6]Si suppone di inviare su un insieme di N molecole biatomiche omonucleari iden-tiche un campo monocromatico a frequenza ω del tipo E(t) = Ae−iω1t + c.c.,dove A è l'ampiezza del campo elettrico costante nel tempo.Il momento di dipolo indotto dal campo è:

µ(t) = α(t)E(t) (2.1)

dove α(t) è la polarizzabilità della molecola; essa dipende dal tempo in virtù deimodi interni propri della molecola stessa. In generale la polarizzabilità di unamolecola è un tensore; per una molecola biatomica omonucleare è in particolareun tensore diagonalizzabile con due componenti ortogonali uguali e una compo-nente parallela diversa.Poiché l'oscillazione lungo la coordinata molecolare è piccola, è possibile espan-dere la polarizzabilità in serie di Taylor rispetto alla coordinata Q(t). Si ottiene:

α(t) = α0 +

∣∣∣∣ ∂α

∂Q(t)

∣∣∣∣Q=0

+ ... (2.2)

dove Q(t) è la coordinata del modo normale in approssimazione armonica. Inapprossimazione armonica, l'equazione del moto per la coordinata vibrazionaleQ(t) è

∂2Q(t)

∂t2+ 2γ

∂Q(t)

∂t+ ω2

vQ(t) = 0 (2.3)

che, trascurando lo smorzamento γ, ammette soluzione

Q(t) = 2Q0cos(ωvt+ iφ) = Q0(e−iωvt−iφ + e+iωvt+iφ) (2.4)

dove ωv è la frequenza di oscillazione caratteristica della molecola. La polariz-zazione totale indotta del sistema è la somma dei momenti di dipolo associati aciascun oscillatore molecolare; per un sistema di N oscillatori identici essa è:

P (t) = Nµ(t) (2.5)

Sostituendo la (2.4) nella (2.3), usando la (2.5) e ricordando la de�nizione dicampo elettrico si ottiene per la polarizzazione:

P (t) = Nα0Ae−iω1t +N

∣∣∣∣ ∂α∂Q∣∣∣∣Q=0

AQ0[e−i(ω1−ωv)t+iφ + e−i(ω1+ωv)t−iφ] + c.c.

(2.6)

Dalla precedente equazione è evidente che la polarizzazione indotta oscilla nonsolo alla frequenza ω1 del campo incidente, ma anche, per e�etto Raman, a duenuove frequenze ω1 ± ωv.


Da quanto detto segue che uno spettro Raman vibrazionale è costituito da unaserie di righe simmetriche a destra e sinistra della riga centrale Rayleigh, sposta-te rispetto a questa proprio di una quantità pari alla frequenza del modo normaleωv. Si nota inoltre che tale spettro esiste se e solo se la polarizzabilità non ècostante. In Fig. 2.1 si riporta lo spettro Raman spontaneo vibrazionale di unamolecola biatomica omonucleare: si nota che la riga anti-Stokes, corrispondentea una transizione che parte da uno stato vibrazionale eccitato popolato, è menointensa della riga Stokes, che invece corrisponde a una transizione che partedallo stato vibrazionale fondamentale, poiché a valori di temperatura �nita valela legge di Boltzmann:

NANB

= e−EA−EBKT (2.7)

dove NA e NB indicano le popolazioni dello stato A e dello stato B, K è lacostante di Boltzmann e T la temperatura. La di�erenza di intensità tra Stokese anti-Stokes rispetta il principio del bilancio dettagliato, secondo il quale:

IStokesIanti−Stokes

= eβh̄ωv (2.8)

dove β = 1KT . Pertanto il rapporto tra le intensità delle righe Stokes e anti-

Stokes costituisce una stima della temperatura locale del sistema (effetto termometro).

Figura 2.1: spettro Raman spontaneo per una molecola biatomica omonucleare.

L'e�etto Raman è un e�etto non lineare rispetto al campo che lo genera e per-tanto è molto meno intenso rispetto a fenomeni lineari come l'assobimento ol'emissione. Infatti è di�cile distinguere le righe Raman in presenza di �uore-scenza, poichè quest'ultima risulta molto più intensa e, come il Raman sponta-neo, è un processo incoerente che si manifesta in maniera isotropa, richiedendouna rivelazione integrata sull'intero angolo solido di emissione. Un fenomenoincoerente è tale per cui non esiste una relazione di fase �ssa tra i dipoli che


di�ondono la radiazione, pertanto la radiazione è di�usa in modo isotropo intutte le direzioni dello spazio. Inoltre, il Raman spontaneo manifesta una di-pendenza lineare dalla concentrazione del campione, in quanto l'intensità dellerighe Raman è direttamente proporzionale al numero N di oscillatori presentinel campione stesso; è anche un processo omodino, poiché le righe Raman simanifestano a frequenze non inizialmente popolate nella radiazione incidente.[6]Inoltre, nell'implementazione pump-probe della spettroscopia Raman per lo stu-dio delle dinamiche ultraveloci, dove è necessario utilizzare sorgenti impulsatedi durata su�cientemente breve rispetto ai processi �sici che si vogliono risol-vere, si ottiene necessariamente un allargamento spettrale del segnale in uscitache compromette la risoluzione in frequenza dell'esperimento. Infatti, in base alprincipio di indeterminazione per impulsi gaussiani (∆t∆ω ≥ 15 ps cm−1), se sivogliono risolvere righe spettrali di FWHM∼ 15 cm−1, occorre necessariamenteutilizzare impulsi di durata maggiore di un picosecondo.

2.2 Raman stimolato

Il Raman spontaneo presenta dunque le seguenti limitazioni:

• bassa sezione d'urto;

• competizione con altri processi, principalmente la �uorescenza;

• di�coltà di utilizzo negli esperimenti pump-probe nelle scale di tempotipiche dei processi chimici.

Queste di�coltà possono essere superate utilizzando un secondo fascio ester-no, detto Stokes probe, per stimolare il processo Raman tramite una tecni-ca chiamata Scattering Raman stimolato (SRS). Quando due impulsi luminosi,Raman pulse a frequenza ωR e Stokes probe a frequenza ωS , incidono su un cam-pione che presenta un modo normale di vibrazione a frequenza ωv = ωR − ωSsi ottiene luce coerente di�usa collinearmente al probe con una sezione d'ur-to maggiore di diversi ordini di grandezza e proporzionale a all'intensità delloStokes probe. Come si vedrà più avanti nella discussione, il Raman stimolatoè un processo al terzo ordine, comporta cioè tre interazioni con i campi. Se ilsegnale è rivelato nella stessa direzione del probe, la conservazione del momento(phase matching) richiede interazioni del tipo:

−→k sig =

−→k Raman −

−→k Raman +

−→k Stokes. Questo permette di ottenere segnali di intensità elevata e distinguibilidalla �uorescenza, purché sia selezionata la direzione di acquisizione del segnalecollineare allo Stokes probe, con angolo solido piccolo a piacere. Infatti, mentrela �uorescenza è un segnale emesso su tutto l'angolo solido, il segnale SRS nascesolo lungo la direzione di propagazione dello Stokes probe e quindi può essereselettivamente rivelato.

Una versione particolarmente utile della tecnica SRS è quella ottenuta apartire da un Raman pulse a banda stretta (e quindi lungo in tempo) e daun probe ultracorto (quindi largo in frequenza), detta Broadband StimulatedRaman Scattering (B-SRS). Questo permette di sondare un'ampia zona dellospettro con lo Stokes probe, in modo da stimolare l'e�etto Raman contempora-neamente per tutti i modi normali del campione. Si ottengono così una serie di


Figura 2.2: geometria di un esperimento SRS. Il fascio blu rappresenta il Ramanpulse, quello rosso lo Stokes probe. Solo quest'ultimo raggiunge il detector.

picchi, positivi e negativi in condizioni di non risonanza elettronica, sullo spettrodello Stokes probe, in corrispondenza delle frequenze vibrazionali del campione.Solitamente si usa rappresentare il Raman gain (RG) in funzione del Ramanshift ωshift = ωS − ωR, con il RG de�nito come

RG(λ) =IStokes(λ)Raman ON − IStokes(λ)Raman OFF

IStokes(λ)Raman OFF=

∆ISIS0

(2.9)

dove IStokes(λ)Raman ON e IStokes(λ)Raman OFF sono, rispettivamente, l'inten-sità dello Stokes probe in presenza di Raman pulse acceso e spento.

Figura 2.3: spettro SRS del cicloesano con Raman pulse acceso; si noti che ipicchi Raman risultano positivi sul lato rosso rispetto al Raman pulse (in blu),negativi sul lato blu del Raman pulse (in verde).

Stimolare il processo Raman signi�ca introdurre un termine forzante nell'e-quazione dell'oscillatore (2.3):

∂2Q(t)

∂t2+ 2γ

∂Q(t)

∂t+ ω2

vQ(t) =F (t)

m= α′v|E(r, t)|2 (2.10)


Figura 2.4: spettro SRS del cicloesano con Raman pulse spento. In assenza diRaman pulse, la risposta Raman è nulla.

Figura 2.5: Raman gain per il cicloesano.

Il campo totale E(r, t) è dato dalla somma dei campi associati allo Stokes probee al Raman pulse:

E(r, t) = E(r, t)Raman + E(r, t)Stokes (2.11)

L'SRS è quindi un processo non lineare, poiché la generazione del segnale richie-de una tripla interazione con i campi. E' una tecnica coerente, poiché esiste unaforzante introdotta dalla frequenza di�erenza tra i campi entranti, ωv = ωS−ωRche impone una oscillazione in fase di tutti i dipoli del materiale. L'SRS è inol-tre una tecnica eterodina, in quanto il segnale Raman si manifesta a modi di


campo già popolati nel campo Stokes in ingresso. [6]

Usando le equazioni di Maxwell e la (2.10) si può ottenere la soluzione classi-ca per il campo SRS. [7] Nella prossima sezione verrà presentata una trattazionequantisitca dell'SRS, mediante il formalismo della matrice densità, che permet-terà di spiegare molti fenomeni che riguardano l'interazione radiazione materianon contemplati dall'approccio classico. La trattazione quantistica permetteràinfatti di spiegare, a patto di considerare il campo del vuoto al posto dello Stokesprobe, la di�erenza di intensità tra Stokes e anti-Stokes nel Raman spontaneoe gli e�etti della risonanza elettronica sia nel caso del Raman spontaneo sia inquello dell'SRS.

2.3 Cenni di Raman risonante

Quando la frequenza del probe Raman coincide con quella di una transizio-ne elettronica del campione si parla di Raman Risonante (RR). I meccanismispettroscopici che contribuiscono al segnale Raman risonante sono due, rappre-sentati dai termini di scattering A e B che costuiscono i due termini principalidell'espansione di Taylor della polarizzabilità Raman rispetto alla coordinatavibrazionale Q. Il termine A è

A =µ2e

h̄

∑v

Fv∆νv + iΓv

Fv = 〈j|v〉〈v|i〉 (2.12)

dove µe è il momento di dipolo elettrico di transizione per lo stato eccitato edi cui v identi�ca un particolare livello vibrazionale; ∆νv è la di�erenza tra lafrequenza del livello v, di larghezza Γv e la frequenza di eccitazione del laser(la condizione di risonanza elettronica si raggiunge quando ∆νv=0). Fv è ilprodotto degli integrali di Franck-Condon tra il livello intermedio e i livelliiniziali e �nali i e j, che in genere sono rispettivamente i livelli vibrazionali 0 e1 dello stato elettronico fondamentale. Il termine A è il termine di scatteringrisonante dominante nel caso di transizioni elettroniche permesse con grandivalori di µ2

e. L'aumento di intensità relativo per di�erenti modi normali divibrazione dipende dai valori degli integrali di Franck-Condon, che a loro voltadipendono dallo spostamento geometrico nello stato eccitato lungo la coordinatavibrazionale. Solo i modi totalsimmetrici hanno prodotti di Franck-Condon nonnulli e subiscono l'e�etto di ampli�cazione relativo al termine A. Il termine Bcontiene la derivata del momento di transizione rispetto alla coordinata normale,∂∂Qµe=µ

′e

B =µeµeh̄

∑v

Fv∆νv + iΓv

F ′v = 〈j|Q|v〉〈v|i〉+ 〈j|v〉〈v|Q|i〉 (2.13)

In questo caso la funzione di overlap contiene integrali che dipendono da Q eintegrali di Franck-Condon; essa è diversa da zero per vibrazioni non totalsim-metriche. Quando la transizione elettronica non è permessa µ′e può superareµe se nelle vicinanze c'è una transizione s fortemente permessa che può tra-sferire intensità alla transizione tramite mixing vibronico. Nella formulazioneHerzberg-Teller

µ′e = µs〈s|∂H∂Q |e〉h̄(νs − νe)

(2.14)


dove ∂H∂Q è la derivata dell'hamiltoniana rispetto al modo normale e νs e µs sono

rispettivamente la frequenza e il momento di dipolo di transizione dello stato dimixing. Il valore di µ′e diminuisce all'aumentare della separazione in frequenzatra i due stati. Le vibrazioni attive sono quelle in grado di dare un mixinge�ciente tra i due stati e questo dipende dalla loro geometria: le simmetriepermesse sono date dal prodotto delle rappresentazioni. L'e�etto Jahn-Tellerè un caso limite di scattering vibronico, relativo a due transizioni elettronicheche diventano degeneri. Le vibrazioni che prendono parte al mixing, detti modiJahn-Teller attivi, subiscono una forte ampli�cazione. Lo scattering Jahn-Tellerpuò essere visto come un caso particolare dello scattering di tipo A, con µe = µs.[2]

2.4 Trattazione quantistica dello scattering Ra-

man stimolato

La trattazione quantistica dello scattering Raman stimolato ricorre al formali-smo della matrice densità. In questa sezione verranno introdotti gli strumen-ti matematici necessari che successivamente verranno applicati al calcolo dellapolarizzazione non lineare e quindi della risposta Raman.

2.4.1 L'operatore densità

Si consideri uno stato quantistico descritto dalla funzione d'onda |Ψ(t)〉. Ilvalore atteso di un qualunque operatore A è dato da:

〈A〉 = 〈Ψ(t)|A|Ψ(t)〉 (2.15)

Sviluppando |Ψ(t)〉 in una base arbitraria {|n〉} e considerandone il coniugato,si può scrivere:

〈A〉 =∑n,m

cn(t)c∗m(t) 〈m|A|n〉 =∑n,m

cn(t)c∗m(t)Amn (2.16)

Si introduce l'operatore densità, de�nito come

ρ(t) = |Ψ(t)〉〈Ψ(t)| (2.17)

Sviluppato nella base {|n〉}, ρ diventa

ρ(t) =∑n,m

cn(t)c∗m(t) |n〉〈m| =∑n,m

ρnm(t) |n〉〈m| (2.18)

dove sono de�niti gli elementi della matrice densità ρnm(t) = 〈n|ρ|m〉 = cn(t)c∗m(t).Il valor medio di A, scritto in termini di matrice densità, assume la forma:

〈A〉 =∑n,m

Anmρnm(t) = Tr[Aρ(t)] (2.19)

La traccia gode di alcune importanti proprietà:

1. la traccia è invariante sotto permutazioni cicliche: Tr(ABC)=Tr(CBA)=Tr(BCA);2. la traccia del commutatore è nulla: Tr([A;B])=0;


3. la traccia è invariante sotto trasformazioni unitarie Tr(U−1AU) = Tr(A).

L'utilizzo della matrice densità permette di ampliare la de�nizione di statoquantistico: nel formalismo delle funzioni d'onda uno stato quantistico è rappre-sentato da un vettore, mentre in quello dell'operatore densità da una matrice.Un sistema che può essere rappresentato da una funzione d'onda è detto esserein uno stato puro. Gli stati puri sono completamente de�niti dal primo postu-lato della meccanica quantistica. Un sistema in generale può anche non esserein uno stato puro e non essere rappresentabile da una funzione d'onda: se siconsidera un insieme di stati con probabilità Pk = 0 di essere nello stato |Ψk(t)〉si può ancora de�nire l'operatore densità come:

ρ(t) =∑k

Pk |Ψk(t)〉〈Ψk(t)| (2.20)

ma non è possibile descrivere il sistema tramite un solo ket (a meno che Pk =0 ∀ k 6= i, Pi = 1 per cui si ha uno stato puro). I sistemi non descrivibili dauna funzione d'onda sono detti miscele statistiche o stati misti. L'operatoredensità presenta le seguenti proprietà [8], che derivano direttamente dalla suade�nizione e dalle proprietà della traccia:

1. l'operatore densità è hermitiano: ρ = ρ†;2. gli elementi diagonali della matrice densità sono reali e non negativi;3. gli elementi fuori della diagonale sono in generale complessi;3. Tr(ρ) = 1 (dalla normalizzazione della Pk);4. Tr(ρ2) ≤ 1 (l'uguaglianza vale solo per stati puri).

Gli stati la cui matrice densità ha elementi solo sulla diagonale sono detti dipopolazione; se la matrice densità ha elementi fuori della diagonale, lo stato èdetto di coerenza. Ricaviamo adesso l'equazione di Liouville, che descrive comela matrice densità evolve nel tempo.

2.4.2 Evoluzione della matrice densità e dinamica nellospazio di Liouville

Se si considera lo stato puro |Ψ(t)〉, la derivata temporale della matrice densitàè data da:

∂ρ(t)

∂t=

∂

∂t

(|Ψ(t)〉〈Ψ(t)|

)=

(∂

∂t|Ψ〉

)· 〈Ψ(t)|+ |Ψ(t)〉 ·

(∂

∂t〈Ψ(t)|

)(2.21)

L'evoluzione del ket |Ψ(t)〉 è descritta dall'equazione di Schrödinger:

∂

∂t|Ψ(t)〉 = − i

h̄[H; ρ] (2.22)

Quella del bra 〈Ψ(t)| è data dall'hermitiana coniugata:

∂

∂t〈Ψ(t)| = +

i

h̄〈Ψ(t)|H (2.23)

Inserendo la (2.22) e la (2.23) nella (2.21) si ricava l'equazione di Liouville-Von Neumann:

∂ρ(t)

∂t= − i

h̄[H; ρ(t)] (2.24)


Poiché l'operatore densità per uno stato misto è una sovrapposizione di operatoridensità per gli stati puri, le equazioni (2.19) e (2.24), che sono lineari in ρ,valgono anche per stati misti. E' utile a questo punto introdurre lo spazio diLiouville. Per un sistema a N livelli, l'operatore densità ha N2 elementi ρij .Ogni elemento di matrice obbedisce all'equazione di Liouville-Von Neumann:

∂ρ(t)

∂t= − i

h̄

∑m

(Himρmj − ρimHmj) (2.25)

La precedente equazione può essere riscritta come

∂ρij(t)

∂t= − i

h̄

∑m,n

Lij,mnρmn (2.26)

o, in forma operatoriale, come

∂ρ(t)

∂t= − i

h̄Lρ (2.27)

L'equazione (2.27) de�nisce la rappresentazione di Liouville. Nello spazio diLiouville, l'operatore densità ρ è scritto come un vettore colonna e l'operatore[H; ρ(t)] come una matrice a quattro indici, ovvero come un superoperatoreL. L'equazione di Liouville è formalmente identica a quella di Schrödingerpertanto i risultati che si ottengono nello spazio delle funzioni d'onda possonoessere applicati anche alla matrice densità. L'importanza di questo formalismorisiede nel fatto che l'equazione di Liouville permette di trattare il concetto didephasing. Il dephasing è il processo per cui uno stato di coerenza, indotto dauna perturbazione, decade nel tempo mentre il sistema rilassa verso lo statoiniziale. I termini relativi al dephasing Γij possono essere inseriti direttamentenell'equazione di Liouville (2.27) che diventa:

∂ρ(t)

∂t= − i

h̄Lρ − Γρ (2.28)

dove Γ è una matrice a quattro indici contenente i termini Γij .

2.4.3 Soluzione per hamiltoniane dipendenti dal tempo

Si consideri un sistema soggetto all'hamiltoniana dipendente dal tempo H(t).L'operatore di evoluzione temporale o propagatore U(t, t0) è de�nito come

|Ψ(t)〉 = U(t, t0) |Ψ(t0)〉 (2.29)

Il propagatore soddisfa le seguenti proprietà:

1. U(t, t0) = 1;2. U(t2, t0) = U(t2, t1)U(t1, t0);3. U−1 = U† da cui si ricava U†(t, t0) = U(t0, t);4. U(t, t0) dipende solo dall'intervallo t− t0.

Inserendo la de�nizione di propagatore nell'equazione di Schrödinger si ot-tiene l'equazione:

∂U(t, t0)

∂t= − i

h̄H(t)U(t, t0) (2.30)


che può essere risolta integrando ambo i membri tra t0 e t e usando la proprietà1. Si ottiene:

U(t, t0) = 1− i

h̄

∫ t

t0

dt′H(t

′)U(t

′, t0) (2.31)

Risolvendo ora per U(t′, t0):

U(t, t0) = 1− i

h̄

∫ t

t0

dt′H(t

′) +

(− ih̄

)2 ∫ t

t0

dt′∫ t′

t0

dt”H(t′)H(t”)U(t

′, t0)

(2.32)

Questa equazione può essere risolta in maniera iterativa, suddividendo l'inter-vallo totale [t0, t] in n intervalli in�nitesimi di integrazione e sommando poi sun:

U(t, t0) = 1 +

∞∑n=1

(− ih̄

)n ∫ t

t0

dtn

∫ tn

t0

dtn−1...

∫ t2

t0

dt1H(tn)H(tn−1)H(t1)

(2.33)

Poiché le hamiltoniane che compaiono nella (2.33) sono calcolate a tempi diversiesse in generale non commutano. Pertanto la serie non può essere ricondotta adun esponenziale. Inoltre, per grandi valori di n, la serie diverge ad in�nito. Datal'analogia tra tra lo spazio delle funzioni d'onda e quello di Liouville, quantodetto si applica anche alla matrice densità, semplicemente sostituendo |Ψ(t)〉con ρ e H con L.Si de�nisce il propagatore di Liouville U tramite la relazione:

ρ(t) = U(t, t0) = − ih̄

L(t)U(t, t0) (2.34)

U(t, t0) soddisfa l'equazione di Liouville:

∂U(t, t0)

∂t= − i

h̄L(t)U(t, t0) (2.35)

formalmente analoga alla (2.30). Si può quindi scrivere:

U(t, t0) = 1 +

∞∑n=1

(− ih̄

)n ∫ t

t0

dtn

∫ tn

t0

dtn−1...

∫ t2

t0

dt1L(tn)L(tn−1)...L(t1)

(2.36)Sfruttando la de�nizione di L, si ricava l'espressione per ρ(t):

ρ(t) = U(t, t0)ρ(t0) = ρ(t0) +

∞∑n=1

(− ih̄

)n ∫ t

t0

dtn

∫ tn

t0

dtn−1...

∫ t2

t0

dt1

[H(tn), [H(tn−1, ...[H(t1)ρ(t0)]...]] (2.37)

Questa espressione risulta inutilizzabile poiché la serie non converge. Per ricava-re un'espressione convergente del propagatore occorre passare alla rappresenta−zione di Dirac o rappresentazione di interazione per la funzione d'onda, per poiestendere i risultati alla matrice densità. La rappresentazione di Dirac si applica


ad hamiltoniane che soddisfano la teoria perturbativa, ossia che possono esserescritte come:

H(t) = H0(t) +H′(t) (2.38)

dove del termine H0 è noto il propagatore U0, mentre il termine H ′ è piccolo ri-spetto ai parametri del problema e può essere trattato come una perturbazione.Poiché in particolare si vuole trattare l'interazione della radiazione elettroma-gnetica con la materia, si assume che H0 sia costante e che H'(t) descriva laperturbazione indotta dal campo elettromagnetico esterno in approssimazionedi dipolo, secondo l'espresisone H ′(t) = E(t) · µ. Il propagatore U0 è dato da:

U(t, t0) = e−ih̄H0(t−t0) (2.39)

De�niamo la funzione d'onda nella rappresentazione di Dirac come:

|ψ(t)〉 = U0(t, t0) |ΨI(t)〉 (2.40)

dove il pedice I indica la rappresentazione di Dirac e |Ψ(t)〉 è la funzione d'on-da scritta nella rappresentazione di Schrödinger che pertanto evolve secondol'hamiltoniana completa H. Inserendo la (2.40) nell'equazione di Schrödinger ericordando che U0 è unitario, si ottiene

∂|ΨI(t)〉∂t

= − ih̄H ′I(t) |ΨI(t)〉 (2.41)

dove H ′I(t) comeH ′I(t) = U†0 (t, t0)H ′(t)U0(t, t0) (2.42)

La dipendenza temporale di H ′I deriva sia dalla dipendenza di H ′ che da U0, ilquale svolge il ruolo di trasformazione dalla rappresentazione di Dirac a quellasi Schrödinger. La rappresentazione di Dirac è una rappresentazione intermediatra quella di Schrödinger e quella di Heisenberg. Nella rappresentazione diSchrödinger le funzioni d'onda sono dipendenti dal tempo mentre gli operatorisono costanti (a meno che l'osservabile non presenti una dipendenza dal tempoesplicita); in quella di Heisenberg, invece, sono gli operatori ad evolvere neltempo, mentre le funzioni d'onda non evolvono. Nella rappresentazione di Diracgli stati evolvono con l'hamiltoniana di perturbazioneH ′(t), mentre gli operatorievolvono con l'hamiltoniana imperturbata H0.Nella rappresentazione di Dirac il propagatore è de�nito da:

|ΨI(t)〉 = UI(t, t0) |ΨI(t)〉 (2.43)

Utilizzando la (2.41) e la (2.42) si può quindi scrivere

∂UI(t, t0)

∂t= − i

h̄H ′I(t)UI(t, t0) (2.44)

Come per la (2.30), anche questa equazione si può risolvere iterativamentecon integrazioni successive. Facendo agire il propagatore sullo stato |ΨI(t)〉si ottiene:

|ΨI(t)〉 = |ΨI(t0)〉+

∞∑n=1

(− ih̄

)n


∫ t

t0

dtn

∫ tn

t0

dtn−1...

∫ t2

t0

dt1H(tn)H(tn−1)H(t1) |ΨI(t0)〉 (2.45)

Si procede tornando nella rappresentazione di Schrödinger usando la (2.40), la(2.42) e la proprietà 2 dei propagatori e notando che |ΨI(t0)〉 = |Ψ(t0)〉:

|ΨI(t)〉 =∣∣∣Ψ(0)(t0)

⟩+

∞∑n=1

(− ih̄

)n ∫ t

t0

dtn

∫ tn

t0

dtn−1...

∫ t2

t0

dt1

U0(t, tn)H ′(tn)U0(tn, tn−1)H ′(tn−1)...U0(t2, t1)H ′(t1)U0(t1, t0) |Ψ(t0)〉 (2.46)

dove∣∣Ψ(0)(t)

⟩= U0(t, t0) |Ψ(t0)〉 è la funzione d'onda che evolve soggetta solo

ad H0. La di�erenza di questo risultato rispetto a quello ottenuto ricorrendoesclusivamente al formalismo di Schrödinger sta nel fatto che ora lo sviluppoè scritto in termini di potenze della perturbazione H' e non dell'hamiltonianacompleta H. Poiché il termine di interazione è piccolo, è possibile un approccioperturbativo, con

∣∣Ψ(0)(t)⟩funzione d'onda all'ordine zero della perturbazione.

La (2.46) si presta ad una interpretazione �sica diretta: il sistema propaga libe-ro da perturbazioni �no al tempo t1, come descritto dal propagatore U0(t1, t0).Al tempo t1 il sistema interagisce con la perturbazione H ′(t1). Successivamenteesso propaga di nuovo liberamente �no a t2, istante in cui agisce la perturba-zione H ′(t2). Lo stesso procedimento si ripete per ogni ti.

E' possibile utilizzare i risultati �n qui ottenuti per ricavare lo sviluppoperturbativo della matrice densità. La separazione dell'hamiltoniana nella (2.38)corrisponde alla separazione del superoperatore L di Liouville:

L = L0(t) + L′(t) (2.47)

doveL0A = [H0(t), A] L′(t)A = [H ′(t), A] (2.48)

Si de�nisce ora la matrice densità per uno stato puro nella rappresentazione diDirac:

ρ(t) = |Ψ(t)〉〈Ψ(t)| = U0(t, t0) · |ΨI(t)〉〈ΨI(t)| · U†0 (t, t0)

= U0(t, t0) · ρI(t) · U†0 (t, t0) (2.49)

Dalla linearità in ρ segue che la (2.49) vale anche per gli stati misti. Inoltre,sfruttando l'equivalenza formale tra spazio delle funzioni d'onda e spazio diLiouville, si ricava facilmente:

ρI(t) = ρI(t0) +

∞∑n=1

(− ih̄

)n ∫ t

t0

dtn

∫ tn

t0

dtn−1...

∫ t2

t0

dt1

U0(t, t0) · [H ′I(tn); [H ′I(tn−1); ...[H ′I(t1); ρ(t0)]...]] · U†0 (t, t0) (2.50)

L'espressione (2.50) si può interpretare �sicamente come la (2.46) consideran-do inoltre che, poiché la matrice densità contiene ket e bra, l'interazione può


avvenire su entrambi. Questo aspetto giusti�cherà nella prossima sezione l'intro-duzione dei diagrammi di Feynman bidimensionali . Assumendo che ρ(t0) rap-presenti uno stato all'equilibrio, ovvero che non evolva nel tempo sotto l'azionedell'hamiltoniana H0, si può mandare t0 → −∞ e scrivere:

ρ(t) = ρ(0)(−∞) +

∞∑n=1

ρ(n)(t) (2.51)

Ricordando che H ′(t) = E(t) · µ, si de�nisce l'operatore di dipolo nella rappre-sentazione di Dirac:

µI(t) = U†0 (t, t0)µU0(t, t0) (2.52)

Poiché nella rappresentazione di Schrödinger µ è costante, mentre dipende daltempo in quella di Dirac, è possibile omettere gli indici I e scrivere µ(t) o µper riferirsi all'una o all'altra rappresentazione. L'ordine n-esimo della matricedensità in termini di E(t) e µ(t) è dato quindi da:

ρ(n)(t) =

(− ih̄

)n ∫ t

−∞dtn

∫ tn

−∞dtn−1...

∫ t2

−∞dt1 (2.53)

E(tn)E(tn−1)...E(t1)U0(t, t0) · [µ(tn); [µ(tn−1); ...[µ(t1); ρ(−∞)]...]] · U†0 (t, t0)

2.5 Equazioni di Maxwell e polarizzazione non

lineare

Questa sezione è dedicata allo sviluppo di una teoria capace di spiegare feno-meni ottici non lineari, come l'SRS, che si manifestano quando l'intensità dellarisposta di un sistema dipende in modo non lineare dall'intensità del campoapplicato. L'elettromagnetismo classico a�erma che quando un'onda elettro-magnetica attraversa un materiale, la variazione nel tempo della polarizzazioneagisce come sorgente secondaria e produce luce di�usa. A basse intensità delcampo incidente, se il campo è monocromatico o in generale stretto in frequenza,la polarizzazione è una funzione lineare del campo:

P = ε0χ(1)E (2.54)

Quando l'intensità aumenta (ad esempio con l'utilizzo di sorgenti laser), questonon è più vero ed è necessario espandere la polarizzazione in potenza di E:

P = ε0(χ(1)E + χ(2)E ·E + χ(3)E ·E ·E + ...) (2.55)

dove χ(1) è la suscettività ottica lineare, mentre χ(n) con n ≥ 2 è la suscettivitàottica non lineare all'ordine n-esimo. Poiché il campo è un vettore, la suscet-tività è un tensore. Tuttavia ci si pone nel caso di materiali isotropi, per cuila suscettività è un tensore diagonalizzabile con tre componenti uguali e quindiriconducibile ad una quantità scalare. Nei sistemi che godono della simmetria diinversione, le suscettività di ordine pari sono nulle. Quindi, per tali sistemi, noticome materiali Kerr , l'ordine non lineare più basso è dato dalla χ(3) e prevededunque tre interazioni con il campo.


Si cerca ora una forma esplicita del campo generato dalla variazione tempora-le della polarizzazione, inserendo la (2.55) nelle equazioni di Maxwell. Le equa-zioni di Maxwell per i mezzi non magnetici e neutri, per cui la magnetizzazioneM e la densità di carica ρ sono nulle, sono:

∇×E = −µ0∂H

∂t(2.56)

∇×H = ε0∂E

∂t+∂P

∂t+ J (2.57)

∇ ·E = − 1

ε0∇ ·P (2.58)

∇ ·H = 0 (2.59)

Applicando il rotore alla (2.56), facendola derivata temporale della (2.57) euguagliando le espressioni che si ottengono per ∇ × ∂H

∂t si arriva all'equazionegenerale delle onde:

∇×∇×E = ∇2E = − 1

c20

∂2E

∂t2− µ0

∂2P

∂t2− µ0

∂J

∂t(2.60)

dove è stata usata la relazione c0 =√

1µ0ε0

. Sfruttando una nota proprietà

vettoriale, si scrive: ∇×∇×E = ∇(∇·E)−∇2E. Quando esiste una relazionelineare tra E e P, il termine ∇(∇ ·E) è nullo in virtù della (2.58). In ottica nonlineare questo invece non accade, tuttavia nei casi di maggior interesse ∇(∇·E)è comunque trascurabile. Si restringe quindi il caso a quello di onda trasversa,per il quale questo termine è identicamente nullo. Se si considerano inoltre mezzinon conduttori la (2.60) diventa:

∇2E(r, t)− 1

c20

∂2E(r, t)

∂t2= µ0

∂2P(r, t)

∂t2(2.61)

La polarizzazione macroscopica è data dal valore atteso dell'operatore di dipolo;usando la (2.19) si ottiene:

P = Tr (µρ(t)) (2.62)

nella quale l'evoluzione della matrice densità è data, come visto precedentemen-te, dalla (2.24) o dalla (2.28) se si considerano anche i termini di dephasing.Raccogliendo i termini di uguale ordine nella (2.51) e nella (2.55) si ottiene:

P (n) = Tr(µρ(n)(t)

)(2.63)

Si può quindi scrivere la polarizzazione non lineare inserendo la (2.53) nella(2.62):

P (n)(t) =

(− ih̄

)n ∫ t

−∞dtn

∫ tn

−∞dtn−1...

∫ t2

−∞dt1E(tn)E(tn−1)...E(t1)

Tr

(µ(t) · [µ(tn); [µ(tn−1); ...[µ(t1); ρ(−∞)]...]]

)(2.64)

dove è stata usata la de�nizione del momento di dipolo nella rappresentazione diDirac µ(t) = U†0 (t, t0)µU0(t, t0) e l'invarianza della traccia sotto trasformazioni


cicliche. A questo punto in genere è conveniente e�ettuare un cambio di varia-bili che permetta di passare dagli istanti di tempo ti (in cui agiscono i campi)agli intervalli di tempo τi, durante i quali la matrice densità evolve libera daperturbazioni:

t1 = 0

τ1 = t2 − t1 (2.65)

τ2 = t3 − t2 (2.66)

... (2.67)

τn = t− tn (2.68)

Figura 2.6: Intervalli e istanti temporali.

Inoltre si può introdurre la funzione risposta non lineare S(n) de�nita come:

S(n)(τn, ..., τ1) =

(− ih̄

)nTr(µ(τn + ...+ τ1)[µ(τn−1 + ...+ τ1); ...[µ(0); ρ(∞)]...])

(2.69)La polarizzazione non lineare (2.64) diventa quindi:

P (n)(t) =

∫ ∞0

dτn

∫ ∞0

dτn−1...

∫ ∞0

dτ1

E(τ − τn)E(τ − τn − τn−1)... E(τ − τn − τn−1...− τ1) · S(n)(τn, ... , τ1) (2.70)

Si noti che nell'equazione precedente l'ultima interazione µ(τn + ... + τ1) nonfa parte del commutatore. Svolge infatti un ruolo di�erente: le interazioniprecedenti preparano uno stato di coerenza della matrice densità che al tempoτn + ...+ τ1 emette luce.

2.5.1 Four wave mixing

Si vuole ora ottenere una soluzione della (2.61). Da qui in poi la trattazioneè sempli�cata dall'uso dell'approssimazione scalare, ossia si considera un'ondapiana che si propaga lungo l'asse z. I risultati ottenuti sono tuttavia generali.Si ottiene quindi:

∂2E(z, t)

∂z2− 1

c20

∂2E

∂t2= µ0

∂2P

∂t2(2.71)

Si scrive la polarizzazione come somma di una parte lineare e una non lineare:

P (z, t) = PL(z, t) + PNL(z, t) (2.72)


La polarizzazione lineare comporta un cambiamento di velocità di propagazionedell'onda:

∂2E(z, t)

∂z2− 1

c20

∂2E

∂t2= µ0ε0χ

(1) ∂2E

∂t2+ µ0

∂2PNL∂t2

⇒

∂2E(z, t)

∂z2− 1

c2∂2E

∂t2= µ0

∂2PNL∂t2

(2.73)

dove c = c0√1+χ(1)

. Si scrive il campo E nella forma

E(z, t) = A(z, t)ei(ω0t−k0z) (2.74)

e la polarizzazione come

PNL(z, t) = pNL(z, t)e(iω0t−kpz) (2.75)

dove A(z ) e p(z ) sono gli inviluppi spaziali rispettivamente del campo e dellapolarizzazione. Inserendo la (2.74) e la (2.75) nella (2.73) e usando la Slo-wing Varying Approximation (SVEA)

∂2A

∂z2� k0

∂A

∂z(2.76)

Si ottiene l'equazione di propagazione non lineare

∂A

∂z= −iµ0ω0c

2n0pNLe

−i∆k z (2.77)

dove n0 = ck0

ω0e ∆k = kp − k0. Scriviamo ora il campo E come sovrapposizione

di quattro campi a frequenze ω1, ω2, ω3, ω4 con la condizione di conservazionedell'energia ω1 + ω2 + ω3 = ω4 (four wave mixing).

E(z, t) =1

2[A1(z, t)ei(ω1t−k1z) +A2(z, t)ei(ω2t−k2z)+ (2.78)

+A3(z, t)ei(ω3t−k3z) +A4(z, t)ei(ω4t−k4z) + c.c.]

Nel caso di mezzi che godono di simmetria di inversione e arrestando lo sviluppoal terzo ordine, la polarizzazione non lineare è

PNL = ε0χ(3)E3(z, t) (2.79)

Sostituendo la (2.79) nella (2.77) si ottiene per il campo e a frequenza ω4:

∂A4

∂z= −iα4χ

(3)A1(z, t)A∗2(z, t)A3(z, t)ei∆k z (2.80)

dove α4 = 3ω4

4cn4. Si applica ora la teoria �n qui trattata al caso dell'SRS e si

ottiene:ω1 = ω2 = ωR ω3 = ω4 = ωS (2.81)

Per l'SRS la condizione di phase matching è dunque automaticamente soddi-sfatta: ∆k = k4 + k2 − k1 − k3 = 0. Quindi si può scrivere:

∂AS∂z

= −iαSχ(3)|AR|2AS (2.82)


Integrando l'equazione precedente tra 0 e L, dove L è la lunghezza del mezzo,nelle ipotesi AR ≈ cost. e AS(0) = AS0

, si ha

AS(L) = AS0e−iαSχ(3)|AR|2L (2.83)

che sviluppato in serie diventa

AS(L) = AS0− iαSχ(3)|AR|2AS0

L = AS0+ ∆AS (2.84)

A�nché lo sviluppo (2.84) valga, ∆AS deve essere piccolo. Questo è vero nelcaso di un' emissione Raman. Nel caso del Raman stimolato il segnale è uncampo che si manifesta come un piccolo guadagno (che in generale può essere siapositivo che negativo) sovrapposto alla frequenza dello Stokes. Si parla in questocaso di self-heterodyne detection. Tuttavia la grandezza che si è e�ettivamentein grado di misurare è l'intesità del segnale, che si ottiene dal modulo quadrodel campo:

IS(L) ∼= |AS(L)|2 = |AS0+ ∆AS |2 = |AS0

|2 + |∆AS |2 + 2Re(A∗S0∆AS) (2.85)

Trascurando |AS(L)|2 poichè piccolo e sostituendo ∆AS = −iαSχ(3)|AR|2AS0L

si ottiene:IS = IS0

+Re(−iAS0A∗S0

L|AR|2αSχ(3) =

= IS0 +Re(−i|AS0 |2L|AR|2αS [χ(3)Re + iχ

(3)Imm] = (2.86)

= IS0 + αSχ(3)ImmIS0IRL

dove χ(3)Re e χ(3)

Imm sono, rispettivamente, la parte reale e la parte immaginariadella suscettività ottica. Si de�nisce quindi il Raman gain

RG =∆ISIS0

= αSχ(3)ImmIRL (2.87)

Pertanto il Raman gain è proporzionale alla parte immaginaria della suscettivitàottica e presenta inoltre una dipendenza lineare dall'intensità del Raman pulsee dalla lunghezza del campione L. La dipendenza lineare da L è responsabiledella dipendenza lineare del segnale Raman stimolato dalla concentrazione, nelcaso in cui il mezzo sia un sistema di molecole in soluzione.

2.6 L'approccio diagrammatico

Nel precedente paragrafo si è evidenziato che il segnale Raman stimolato è pro-porzionale alla parte immaginaria della suscettività ottica al terzo ordine, χ(3)

Imm.E' necessario pertanto scrivere esplicitamente il commutatore nella (2.64) ovve-ro calcolare la funzione risposta non lineare (2.69). La tecnica diagrammatica èun potente strumento che permette di scrivere esplicitamente in modo semplicela funzione risposta e in generale la polarizzazione per qualunque con�gurazionedei campi. Dopo aver introdotto i diagrammi di Feynmann e i diagrammi deilivelli (FWMEL) verrà in particolare discusso il caso di un sistema a tre livellicon una particolare con�gurazione dei campi.


2.6.1 Diagrammi di Feynman e FWMEL

La polarizzazione al terzo ordine è:

P (3)(t) =

∫ ∞0

dτ3

∫ ∞0

dτ2

∫ ∞0

dτ1 E(t−τ3)E(t−τ3−τ2)E(t−τ3−τ2−τ1)S(3)(τ1, τ2, τ3)

(2.88)in cui S(3) è la funzione risposta

S(3)(τ1, τ2, τ3) =

(− ih̄

)3

Tr(µ(τ3+τ2+τ1)[µ(τ1+τ2); [µ(τ1+τ2); [µ(τ1; [µ(0); ρ(−∞)]]]])

(2.89)Sviluppando i commutatori, si ottengono otto termini:

Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)[µ(τ1 + τ2); [µ(τ1); [µ(0); ρ(−∞)]]]) = (2.90)

= Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1 + τ2)µ(τ1)µ(0)ρ(−∞))+ → R4

−Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1 + τ2)µ(τ1)ρ(−∞))µ(0))+ → R∗1

−Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1 + τ2)µ(0)ρ(−∞)µ(τ1))+ → R∗2

+Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1 + τ2)ρ(−∞)µ(0)µ(τ1))+ → R3

−Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1)µ(0)ρ(−∞)µ(τ1 + τ2))+ → R∗3

+Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1)ρ(−∞)µ(0)µ(τ1 + τ2))+ → R2

+Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(0)ρ(−∞)µ(τ1)µ(τ1 + τ2))+ → R1

−Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1))ρ(−∞)µ(0)µ(τ1)µ(τ1 + τ2)) → R∗4

I termini R∗i sono gli hermitiani coniugati dei termini Ri cambiati di segno:infatti, considerando ad esempio il termine R1 e sfruttando l'invarianza del-la traccia sotto permutazioni cicliche e l'hermitanietà della matrice densità edell'operatore di dipolo:

R†1 = (+Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(0)ρ(−∞)µ(τ1)µ(τ1 + τ2)))† =

= Tr(µ(τ1 + τ2)µ(τ1)ρ(−∞)µ(0)µ(τ3 + τ2 + τ1)) = (2.91)

= Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(τ1 + τ2)µ(τ1)ρ(−∞)µ(0)) = −R∗1

Per comprendere meglio il signi�cato �sico dei termini Ri, occorre scriverli inun modo più esplicito. Ragionando sul termine R1 e utilizzando ancora le pro-prietà della traccia viste a pagina 20 e 21, la de�nizione di operatore di dipolonella rappresentazione di Dirac (2.52) e le proprietà del propagatore elencate apagina 22 e 23, si assume U(ti, t0) = U(τi) e si torna nella rappresentazione diSchrödinger. Si ottiene quindi:

Tr((µ(τ3 + τ2 + τ1)µ(0)ρ(−∞)µ(τ1)µ(τ1 + τ2)) =

= Tr(U†(τ3)U†(τ2)U†(τ1)µ(τ3 + τ2 + τ1)U(τ3)U(τ2)U(τ1)µ(0)ρ(−∞)

U†(τ1)µ(τ1)Uτ1U†(τ1)U†(τ2)µ(τ1 + τ2)U(τ1)U(τ2)) (2.92)

= Tr(µ(τ3+τ2+τ1)U(τ3)U(τ2)U(τ1)µ(0)ρ(−∞)U†(τ1)µ(τ1)U†(τ2)µ(τ1+τ2)U†(τ3))


Quest'ultima equazione permette di comprendere l'andamento temporale dellaperturbazione:

Tr

(µ(τ3 + τ2 + τ1)︸︷︷︸

(7)

U(τ3)︸︷︷︸(6)

U(τ2)︸︷︷︸(4)

U(τ1)︸︷︷︸(2)

µ(0)︸︷︷︸(1)

ρ(−∞)

U†(τ1)︸︷︷︸(2)

µ(τ1)︸︷︷︸(3)

U†(τ2)︸︷︷︸(4)

µ(τ1 + τ2)︸︷︷︸(5)

U†(τ3)︸︷︷︸(6)

)(2.93)

1. Il dipolo agisce sul ket della matrice densità (ossia agisce "da sinistra");2. dopo la perturbazione questa evolve libera durante l'intervallo τ1;3. il dipolo agisce sul bra della matrice densità (ossia agisce "da destra");4. la matrice densità evolve libera durante τ2;5. il dipolo agisce sul bra;6. la matrice densità evolve libera durante τ3;7. in�ne il dipolo agisce sul ket e si calcola la traccia.

Pertanto il termine R1 descrive tre interazioni temporalmente ordinate cheagiscono sul ket, sul bra e di nuovo sul bra della matrice densità, la qualeevolve libera negli intervalli tra le interazioni. L'ultima interazione, descrit-ta al punto (7), è invece quella che rappresenta l'emissione di luce di�usa(free induction decay) da parte della matrice densità, che è stata portata inuno stato di coerenza alle tre interazioni precedenti. [9]Per calcolare facilmente i termini Ri è possibile ricorrere alla tecnica diagramma-tica. I diagrammi di Feynman a due dimensioni consistono in due linee verticaliparallele che rappresentano il ket (linea sinistra) e il bra (linea destra) della ma-trice densità e da una serie di frecce che rappresentano le interazioni con i campi(Fig. 2.7).

Figura 2.7: diagramma di Feynman bidimensionale del termine R1.

I diagrammi coniugati sono �sicamente equivalenti. Infatti poiché hannosegni diversi, il contributo della loro somma alla parte immaginaria della pola-rizzazione è uguale al doppio contributo del singolo diagramma. Per convenzioneverranno di seguito mostrati i diagrammi che hanno l'ultima interazione sul lato


ket. Tuttavia, in principio l'ultima interazione può avvenire, per ciascun dia-gramma, equivalentemente sul ket o sul bra della matrice densità in virtù delleproprietà della traccia. I diagrammi sono interpretabili in base alle regole diseguito riportate:

1. Il tempo scorre dal basso verso l'alto;

2. al tempo iniziale la matrice densità è nello stato di popolazione |i〉〈i| checomporta un fattore P (i) nel calcolo della funzione risposta;

3. l'ultima interazione è il segnale generato da Tr(µ(τ3 + τ2 + τ1)ρ(3)(t)

).

Questa interazione è di natura diversa dalle altre quindi è rappresentatacon una freccia diversa;

4. ogni diagramma porta un segno (−1)n dove n è il numero di interazionisul lato bra, non contando l'ultima interazione. Questa regola tiene contodei segni introdotti dal commutatore;

5. una freccia che punta a destra rappresenta un campo E(t) = ε(t)e−iωt+ikr,mentre una che punta a sinistra un campo E(t) = ε∗(t)e+iωt−ikr (si ricordiche un campo elettrico è una quantità reale che può quindi essere scrittacome somma di una parte analitica e di una parte complessa coniugata).Tenendo conto dei segni, il campo emesso (rappresentato dall'ultima frec-cia), ha frequenze uguali alla somma delle frequenze e vettore d'onda parialla somma dei vettori d'onda dei campi interagenti a causa della conser-vazione dell'energia e del momento;

6. una freccia che punta verso la linea verticale del ket o del bra rappresentauna campo che induce un'eccitazione; una freccia che invece punta fuoridal diagramma rappresenta una campo che induce una diseccitazione. Diconseguenza l'ultima freccia punta sempre verso l'esterno;

7. tra due interazioni, il sistema evolve sotto l'azione dell'hamiltoniana im-perturbata H0. Dunque gli intervalli tra due interazioni contribuisconocon fattori (dati dall'equazione di Liouville) del tipo e−iωijτ−Γijτ , dove gliindici i e j sono dati dallo stato della matrice densità e Γ è la matrice dellecostanti di dephasing (o di popolazione se i = j).

8. l'ultima interazione deve portare la matrice densità in uno stato di popo-lazione (altrimenti la traccia è nulla).

Un metodo alternativo per visualizzare i processi χ(3) è quello dei diagrammidei livelli o Four Wave Mixing Energy Level (FWMEL). Questa tecnica permet-te di descrivere più facilmente esperimenti che coinvolgono sistemi a più livelli,anche se lo stato della matrice densità è meno esplicito. I diagrammi FWMEL


consistono in più linee orizzontali, che rappresentano i livelli energetici della mo-lecola, e quattro frecce verticali, che rappresentano le interazioni con il campo.

Figura 2.8: diagramma FWMEL del termine R1 per un sistema a tre livelli.

Si riportano di seguito le regole per interpretarli:

1. Il tempo scorre da sinistra verso destra;

2. le frecce che puntano verso l'alto rappresentano eccitazioni, mentre quelleche puntano verso il basso rappresentano diseccitazioni;

3. le frecce continue rappresentano interazioni con il ket, quelle tratteggiatecon il bra;

4. negli intervalli tra le interazioni, la matrice densità evolve libera sottol'azione di H0.

Riassumendo, senza fare alcun tipo di assunzione sulla natura dei campi o delsistema, il terzo ordine prevede quattro diagrammi più i loro complessi coniugati.In generale sviluppando i commutatori nella (2.64) per un'interazione di ordinen si ottengono 2n−1 termini più i complessi coniugati. Tuttavia, considerandole caratteristiche dei campi il numero dei diagrammi aumenta notevolmente.

2.7 Il sistema a tre livelli

Si consideri un sistema a tre livelli a, c e b, con Ea < Ec < Eb (dove b è unlivello virtuale nel caso non risonante). Si può pensare che a e c siano duelivelli vibrazionali dello stato elettronico fondamentale e b uno stato elettronicoeccitato. Si impone che all'istante iniziale il sistema popoli lo stato |a〉, ovveroche la matrice densità al tempo iniziale sia |a〉〈a|. La scelta più generale per ilcampo E è la sorvapposizione di due onde che rappresentano il campo Ramane il campo Stokes. Si impone nella (2.88) che:

E(t) = ER(t) + ES(t) = εR(t)e−iωRt + εS(t)e−iωSt + c.c. (2.94)

dove gli indici S e R stanno per Stokes probe e Raman pulse e εS/R(t) è l'ampiez-za reale del campo (è stato sottointeso il termine spaziale e±ikr che non dipendedal tempo e può essere portato fuori dall'integrale). Si sceglie inoltre di rivelare


il segnale nella direzione dello Stokes probe, per cui la condizione di phase mat-ching è ksig = kR − kR + kS . In questo caso sono possibili otto diagrammi diFeynman (più i complessi coniugati), raggruppabili in quattro famiglie: due peril Raman diretto (SRS(I) e SRS(II)), i cui diagrammi presentano due interazionisul bra e una sul ket, e due per il Raman inverso (IRS(I) e IRS(II)), in cui invecele interazioni con gli impulsi esterni sono tutte sul ket. Si vedrà successivamenteche questa nomenclatura è giusti�cata dal fatto che il Raman diretto è respon-sabile di guadagni positivi sul pro�lo del probe, mentre, in condizioni di nonrisonanza, il Raman inverso è responsabile di guadagni negativi.A seconda della loro natura i diagrammi mostrano contributi larghi o stretti infrequenza, centrati alle frequenza ωR (Rayleigh) o ωR ± (ωc − ωa) (lato blu elato rosso). La forma del segnale dovuto ad una famiglia è data dalla somma deicontributi dei singoli diagrammi. Alla �ne di questo capitolo vengono riportatigli otto diagrammi di Feynman per il sistema a tre livelli appena descritto coni relativi diagrammi FWMEL (Fig. 2.9-2.15). Le frecce in rosso rappresenta-no il Raman pulse, quelle in blu lo Stokes probe. La freccia verde ondulataè il segnale generato dall'e�etto Raman al tempo t. Dopo ogni interazione èriportato lo stato della matrice densità. I diagrammi per cui la matrice densitàpassa per la popolazione |b〉〈b| sono detti hot luminescence (HL) e questo statodi popolazione è evidenziato in giallo. Nel presentare le forme di riga attribuiteai diagrammi, si assume la condizione di non risonanza elettronica (livello bvirtuale). Il caso risonante verrà trattato in seguito.Di seguito si elencano le quattro famiglie di diagrammi, le cui ra�gurazioni sonoriportate alla �ne di questo capitolo (Fig. 2.9-2.15).

2.7.1 SRS(I)

Questa famiglia comprende tre diagrammi, di cui uno in cui la matrice densitànon è mai nello stato di popolazione |b〉〈b| (RRS(I), Fig. 2.9) e due in cui lamatrice densità passa per |b〉〈b| (HL(I), Fig. 2.10 e HL(II), Fig. 2.11). Per ognidiagramma la matrice densità al tempo t può essere |a〉〈a| o |c〉〈c|; l'RRS(Iaa) èresponsabile di un picco Rayleigh stretto, l'RRS(Icc) di un picco Raman strettosul lato rosso, mentre i diagrammi hot luminescence producono spettri larghi incondizioni di non risonanza elettronica.

2.7.2 SRS (II)

Questa famiglia è composta da un diagramma RRS (RRS(II), Fig. 2.12) e dadue hot luminescence (HL(III), Fig. 2.13 e HL(IV), Fig. 2.14). La matricedensità al tempo t è sempre |a〉〈a| ed è responsabile di un guadagno largo infrequenza in condizioni di non risonanza.

2.7.3 IRS(I)

Questa famiglia è composta da un solo diagramma di Feynman che però puòcoinvolgere o meno il livello vibrazionale c. Nel primo caso il segnale è dato daun picco negativo sul lato blu in condizioni di non risonanza, nel secondo da unpicco negativo Rayleigh (Fig. 2.15).


2.7.4 IRS(II)

Questa famiglia è composta da un solo diagramma ed è responsabile di un gua-dagno negativo largo in frequenza (Fig. 2.16).

Dai diagrammi si vede che per l'SRS(I) lo Stokes probe è responsabile di unadiseccitazione. Sotituendo al probe il campo del vuoto, questi diagrammi de-scrivono anche l'e�etto Raman spontaneo. I diagrammi delle famiglie SRS(II),IRS(I) e IRS(II) sono invece proibiti nel Raman spontaneo perchè lo Stokesprobe è responsabile di una eccitazione che non può essere causata dal campodel vuoto. Questo spiega perchè non sono presenti forme negative nel Ramanspontaneo. La natura "lato rosso" o "lato blu" del picco Raman dipende dallostato iniziale della matrice densità. Se lo stato vibrazionale c è popolato inpartenza, la matrice densità all'istante iniziale può essere |c〉〈c|; per esempio inquesto caso l'RRS(Icc) produce un guadagno sul lato blu, mentre l'IRS(Ica) unaperdita sul lato rosso. [9]

E' interessante notare come alcune delle proprietà delle forme di riga possa-no essere dedotte direttamente dai diagrammi, prima di essere confermate daicalcoli. Ad esempio ci si può aspettare che eventuali righe spettrali strette sianopossibili solo se nel diagramma che si sta considerando la matrice densità pas-sa per uno stato caratterizzato da un tempo di dephasing abbastanza lungo (equindi per uno stato di popolazione o di coerenza vibrazionale): in questo casoil sistema oscilla meno bruscamente e durante la successiva interazione si trovaa passare per un range di frequenze non molto largo. Osservando i diagrammisi nota che questo può avvenire solo nell'intervallo τ2: infatti la prima e la terzainterazione portano necessariamente la matrice densità in uno stato di coerenzaelettronica.

I diagrammi RRS(I) e IRS(I) presentano durante τ2 lo stato di popolazione|a〉〈a| o di coerenza vibrazionale tra a e c e sono infatti responsabili di picchistretti. Nella prossima sezione ci si occuperà principalemente di questi duediagrammi. Al contrario RRS(II) e IRS(II) danno luogo a forme di riga larghe infrequenza che seguono l'andamento del campo di Stokes probe. Questo è dovutoalla larghezza spettrale del probe che agisce subito prima del free inductiondecay. Le hot luminescence costituiscono invece un caso diverso: sebbene |b〉〈b|sia uno stato di popolazione, fuori risonanza b è uno stato virtuale e quindidotato di vita media breve; tuttavia in condizioni di risonanza questi diagrammipossono contribuire con forme di riga strette.

2.8 Calcolo della polarizzazione per speci�che cop-

pie di campi

Per calcolare la polarizzazione indotta associata ad un particolare diagrammaoccorre assumere una forma matematica speci�ca per i campi ER/S(t). Perun sistema a tre livelli, in letteratura il problema si trova trattato nel caso diStokes probe e Raman pulse gaussiani. [10, 11] Tuttavia in presenza di impulsigaussiani il calcolo non è risolvibile analiticamente e viene quindi trattato in


modo numerico. In questa tesi verranno invece presentati i risultati analiticiottenuti nel caso:

• Raman pulse monocromatico;

• Stokes probe istantaneo.

Sotto questa condizione si calcoleranno i contributi alla polarizzazione di duediagrammi hot luminescence e dei due diagrammi Raman RRS(Icc) e IRS(Ica).Lo scopo di tale calcolo è quello di mostrare che in condizioni di non risonan-za elettronica e in assenza di particolari dinamiche del sistema, i contributialla polarizzazione totale dovuti a tutti i diagrammi presentati nella sezioneprecedente si annullano, con eccezione per RRS(Icc)) e IRS(Ica)). Successiva-mente verrà presentato il calcolo dei diagrammi Raman e�ettivamente rilevantiai �ni della risposta spettroscopica (RRS(Icc) e IRS(Ica)), evidenziandone ilcomportamento in condizioni di risonanza elettronica.

2.8.1 Calcolo della polarizzazione per RRS(Icc) e IRS(Ica)

Si riporta di seguito il calcolo per il diagramma RRS(Icc), riportato in Fig. 2.19Dati due campi monocromatici

ER(t) = εR(t)e−iωRt

ES(t) = εS(t)e−iωSt (2.95)

si scrive la funzione risposta, dove valgono le seguenti de�nizioni:

- ω̃ij = ωij − iΓij = ωi − ωj − iΓij ,- ωij = −ωji è la di�erenza di frequenza tra i livelli i e j;- Γij = Γji è il rate di dephasing della coerenza indotta |i〉〈j|;- µij è il momento di dipolo di transizione tra gli stati i e j;- a indica lo stato elettronico fondamentale;- b indica uno stato elettronico eccitato;- c è un generico stato vibrazionale eccitato nello stato elettronico fondamentale.

Al tempo t1 il campo Raman interagisce con il lato bra della matrice densità;la freccia nel diagramma punta a sinistra, quindi il campo comporta un fattoreε∗R(t1) eiωRt1 e un momento di dipolo µab. L'evoluzione durante τ1 comporta unfattore e−iω̃abτ1 . La seconda freccia, che rappresenta l'interazione con il probe altempo t2 punta vero destra; si ha dunque un fattore ε(t2)e−iωSt2 ed un momen-to di dipolo µcb. Si aggiunge poi un fattore e−iω̃acτ2 per descrivere l'evoluzionedurante τ2. L'ultima interazione è con il campo Raman e la freccia punta versodestra: si ha quindi un fattore εR(t3)e−iωRt3 ed un momento di dipolo µba. In�-ne il sistema evole durante τ3 ed emette il segnale al tempo t: si introduce quindiil fattore e−iω̃bcτ3 ed un ulteriore dipolo µcb. E�ettuando il cambio di variabileda istanti temporali ad intervalli e considerando che µab = µ∗ba e µbc = µ∗cb, siscrive la polarizzazione indotta al terzo ordine per il diagramma RRS(Icc):

P(3)RRS(Icc)

(t) =

(− i

h̄

)3

(−1)2|µab|2|µcb|2∫ ∞

0

dτ1

∫ ∞0

dτ2

∫ ∞0

dτ3


ε∗R(t− τ3 − τ2 − τ1)εS(t− τ3 − τ2)εR(t− τ3)×

eiωR(t−τ3−τ2−τ1)e−iωS(t−τ3−τ2)e−iωR(t−τ3)e−iω̃abτ1e−iω̃acτ2e−iω̃bcτ3 (2.96)

Scrivendo i campi in funzione della propria trasformata di Fourier e calcolando latrasformata di Fourier della polarizzazione si passa nel dominio delle frequenze:

P(3)RRS(Icc)

(ω) =

(− i

h̄

)3

(−1)2|µab|2|µcb|2∫ ∞

0

dτ1

∫ ∞0

dτ2

∫ ∞0

dτ3

∫ +∞

−∞dt eiωt

∫ +∞

−∞dω1

∫ +∞

−∞dω2

∫ +∞

−∞dω3 ε

∗R(ω1)εS(ω2)εR(ω3)×

eiωR(t−τ3−τ2−τ1)e−iωS(t−τ3−τ2)e−iωR(t−τ3)e−iω̃abτ1e−iω̃acτ2e−iω̃bcτ3×

eiω1(t−τ3−τ2−τ1)e−iω2(t−τ3−τ2)e−iω3(t−τ3) (2.97)

dove ω1, ω2, e ω3 sono le variabili coniugate di τ1, τ2 e τ3. Assumendo il Ramanpulse monocromatico (ossia εR(t)= 1) e lo Stokes probe istantaneo (εS(t) =δ(t)), si ottiene:

P(3)RRS(Icc)

(ω) =

(− 1

h̄

)3

|µab|2|µcb|21

(ω̃bc − ω)(ωR + ω̃ac − ω)(ωR + ω̃ab)(2.98)

Inglobando il segno negativo, ricordando che ω̃ij = ωij − iΓij e sapendo cheωij = −ωji e che Γij = Γji, si ha

P(3)RRS(Icc)

(ω) =

(1

h̄

)3

|µab|2|µcb|21

(ωbc − ω − iΓbc)(−ωR + ωca + iΓac+ ω)×

1

(ωR − ωba − iΓab)(2.99)

Si può procedere analogamente per il calcolo del diagramma IRS(Ica), riportatoin Fig. (2.15).Al tempo t1 il campo Stokes interagisce con il lato ket della matrice densità;la freccia nel diagramma punta a destra, quindi il campo comporta un fattoreεS(t1) e−iωSt1 e un momento di dipolo µba. L'evoluzione durante τ1 comportaun fattore e−iω̃baτ1 . La seconda freccia, che rappresenta l'interazione con il Ra-man pulse al tempo t2 punta vero sinistra; si ha dunque un fattore ε∗R(t2) eiωRt2

ed un momento di dipolo µcb. Si aggiunge poi un fattore e−iω̃caτ2 per descriverel'evoluzione durante τ2. L'ultima interazione è con il campo Raman e la frecciapunta verso destra: si ha quindi un fattore εR(t3) e−iωRt3 ed un momento didipolo µab. In�ne il sistema evole durante τ3 ed emette il segnale al tempot: si introduce quindi il fattore e−iω̃baτ3 ed un ulteriore dipolo µab. E�ettuan-do il cambio di variabile da istanti temporali ad intervalli e considerando cheµab = µ∗ba e µbc = µ∗cb, si scrive la polarizzazione indotta al terzo ordine per ildiagramma IRS(Ica):


P(3)IRS(Ica)(t) =

(− i

h̄

)3

(−1)2|µab|2|µbc|2∫ ∞

0

dτ3

∫ ∞0

dτ2

∫ ∞0

dτ1

εS(t− τ3 − τ2 − τ1)ε∗R(t− τ3 − τ2)εR(t− τ3)×

e−iωS(t−τ3−τ2−τ1)eiωR(t−τ3−τ2)e−iωR(t−τ3)e−iω̃baτ1e−iω̃caτ2e−i ˜ωbaτ3 (2.100)

Scrivendo i campi in funzione della propria trasformata di Fourier e calcolando latrasformata di Fourier della polarizzazione si passa nel dominio delle frequenze:

P(3)IRS(Ica)(ω) =

(− i

h̄

)3

(−1)2|µab|2|µbc|2∫ ∞

0

dτ1

∫ ∞0

dτ2

∫ ∞0

dτ3

∫ +∞

−∞dt eiωt

∫ +∞

−∞dω1

∫ +∞

−∞dω2

∫ +∞

−∞dω3 εS(ω1)ε∗R(ω2)εR(ω3)×

e−iωS(t−τ3−τ2−τ1)eiωR(t−τ3−τ2)e−iωR(t−τ3)e−iω̃baτ1e−iω̃caτ2e−i ˜ωbaτ3×

e−iω1(t−τ3−τ2−τ1)eiω2(t−τ3−τ2)e−iω3(t−τ3) (2.101)

dove ω1, ω2, e ω3 sono le variabili coniugate di τ1, τ2 e τ3.Assumendo il Raman pulse monocromatico (ossia εR(t)= 1) e lo Stokes probeistantaneo (εS(t) = δ(t)), si ottiene:

P(3)IRS(Icc)

(ω) =

(− 1

h̄

)3

|µab|2|µcb|21

(ω̃ba − ω)(ωR + ω̃ca − ω)×

1

(−ω + ω̃ba)(2.102)

Inglobando il segno negativo, ricordando che ω̃ij = ωij − iΓij e sapendo cheωij = −ωji e che Γij = Γji, si ha

P(3)IRS(Ica)(ω) =

(1

h̄

)3

|µab|2|µcb|21

(ω − ωba + iΓba)2×

1

(ω − ωR − ωca + iΓca)(2.103)

In generale il Raman gain può essere ottenuto dalla P (ω) secondo la seguenteespressione:

RG(ω) ∝− Im[E∗S0

(ω) P (3)(ω)]

|E∗S0|2

(2.104)


2.8.2 Calcolo della polarizzazione per HL(Icc) e HL(IIcc)

RRS(Icc) e IRS(Ica) sono gli unici due diagrammi che contribuiscono al segnaleSRS netto. Di seguito si riportano i contributi alla polarizzazione al terzo ordinedovuti ai diagrammi HL(Icc) (Fig. 2.10) e HL(IIcc) (Fig. 2.11).

P (3)(ω)HL(Icc) =1

h̄3 |µab|2|µbc|2

1

(ωR + ωab − iΓab)×

1

(−iΓbb)(ω − ωbc + iΓbc)(2.105)

P (3)(ω)HL(IIcc) =1

h̄3 |µab|2|µbc|2

1

(−ωR + ωba − iΓba)×

1

(−iΓbb)(ω − ωbc + iΓbc)(2.106)

in cui l'e�etto di divergenza nel caso di Γbb → 0 scompare nel caso di unRaman pulse non perfettamente monocromatico. Una volta calcolato il RG se-condo l'equazione (2.104), si osserva che in condizioni di risonanza i contributidi questi due diagrammi sono larghi in frequenza (poiché non determinano se-gnali Raman ma hot luminescence) e presentano RG di segno opposto, pertantosi elidono e non contribuiscono allo spettro. In condizioni di risonanza questicontributi possono essere a banda stretta ma soprattutto presentano RG conlo stesso segno, pertanto si sommano. In ogni caso, non rappresentando unsegnale di tipo Raman, non contribuiscono allo spettro SRS �nale poiché ven-gono rimossi nel processo di sottrazione della baseline dovuto al meccanismo dirivelazione eterodino.Nelle tre pagine successive si riportano i gra�ci relativi agli otto diagrammi.


Figura 2.9: diagrammi per RRS(I). A sinistra il diagramma di Feynman, alcentro RRS(Iaa), a destra RRS(Icc).

Figura 2.10: diagrammi per HL(I). A sinistra il diagramma di Feynman, alcentro HL(Iaa), a destra HL(Icc).

Figura 2.11: diagrammi per HL(II). A sinistra il diagramma di Feynman, alcentro HL(IIaa), a destra HL(IIcc).


Figura 2.12: diagrammi per RRS(II). A sinistra il diagramma di Feynman, adestra quello FWMEL.

Figura 2.13: diagrammi per HL(III). A sinistra il diagramma di Feynman, adestra quello FWMEL.

Figura 2.14: diagrammi per HL(IV). A sinistra il diagramma di Feynman, adestra quello FWMEL.


Figura 2.15: diagrammi per IRS(I). A sinistra il diagramma di Feynman, alcentro IRS(Iaa), a destra IRS(Ica).

Figura 2.16: diagrammi per IRS(II). A sinistra il diagramma di Feynman, adestra quello FWMEL.

Capitolo 3

Apparato sperimentale

3.1 Sorgente laser

Il sistema si basa su un oscillatore a 80 MHz, che è il seed per un ampli�catorerigenerativo (RGA) con un repetion rate di 1 KHz. Il seed è ottenuto da unoscillartore Micra, che è un oscillatore laser basato su un cristallo di Ti:za�ro(Ti:Sa) in grado di produrre in regime di modelocking impulsi utracorti con unalarghezza di banda superiore agli 80 nm. In particolare il fascio uscente dalMicra (seed) ha circa 400 mW di potenza ed è centrato a 800 nm con una bandache va circa da 30 nm a 100 nm. L'impulso di pompa per l'oscillatore Micra èil fascio in uscita da un laser Verdi di potenza pari a 5 W e centrato a 532 nm.Anche l'RGA (Coherent Legend Elite) è basato su un cristallo Ti:za�ro. L'ec-citazione ottica del cristallo è raggiunta pompando il cristallo con un laser Evo-lution 15. L'ampli�cazione del seed è raggiunta tramite due celle di Pockels cheintrappolano nel risuonatore solo un singolo impulso del seed. Dopo un certonumero di round trip, tipicamente 10 o 15, si applica un potenziale alla cella diPockels di uscita e l'impulso è espulso dal risuonatore. Mentre è intrappolatonel risuonatore, l'impulso ha attraversato più volte il cristallo in Ti:za�ro speri-metando un guadagno pari a un fattore 106. L'output del Legend ha le seguenticaratteristiche:

• una lunghezza d'onda centrata a circa 800 nm;

• una durata temporale di 50 fs;

• un repetition rate di 1 KHz;

• una energia di circa 3.5 mJ.

3.2 Layout ottico

Il layout schematico del set-up sperimentale è riportato in Fig. 3.1. Il campioneinteragisce con due fasci laser:

• un Raman pulse a banda stretta con durata nel ps;

• uno Stokes probe a banda larga (supercontinuo) con durata temporale alfs.

45

CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE 46

3.2.1 Raman pulse

Il fascio di probe Raman è caratterizzato da una lunghezza d'onda tunabile.La generazione del fascio Raman inizia in un OPA a doppio stadio (TOPAS-C). L'energia del fascio in entrata è di circa 1.7 µJ e l'output a 880 nm èdi circa 60 µJ. Recentemente è stata dimostrata una semplice tecnica, dettadi compressione spettrale (SC) che permette una sintesi e�ciente di impulsitunabili al ps a partire da impulsi al fs. SC si basa sulla generazione di secondaarmonica (SHG) in presenza di un elevato group delay mismatch (GDM) trala frequenza fondamentale (FF) e l'impulso di seconda armonica (SH) [12, 13],che risulta in un fascio SH a banda stretta dato all'incirca dall'inverso dellaGDM. Poiché la banda di phase-matching del processo SHG è molto bassa inpresenza di grande GDM, ci si aspetterebbe che solo una piccola frazione dellospettro dell'impulso FF sia convertito nell'impulso SH, ottenendo così un bassogrando di conversione. Tuttavia, con un impulso FF a banda larga, le frequenzedell'impulso SH possono essere generate anche da un processo di generazionedi frequenza somma (SFG) tra le componenti spettrali dell'impulso FF che soosimmetriche rispetto alla frequenza di phase-matching ωFF , ossia ω1 + ω2 =2ωFF = ωSH , dove ω1=ωFF + ∆ω e ω2=ωFF − ∆ω. In questo caso si puòscrivere:

k(ω1) = k(ωFF ) +

(∂k

∂ω

)FF

∆ω +1

2

(∂2k

∂ω2

)FF

∆ω2 + ... (3.1)

k(ω1) = k(ωFF )−(∂k

∂ω

)FF

∆ω +1

2

(∂2k

∂ω2

)FF

∆ω2 + ... (3.2)

Il phase mismatch del processo SFG è

∆k = k(ω1) + k(ω2)− k(ωSH) ≈(∂2k

∂ω2

)FF

∆ω2 (3.3)

e la larghezza di banda dell'impulso FF che può essere posta in condizioni diphase-matching è

∆νFF = 0.8861(

2π∣∣ ∂2k∂ω2

∣∣FF

)1/2(3.4)

Quest'ultima equazione mostra che per il processo SFG è garantita la condizionedi phase-matching al primo ordine, pertanto il processo è in grado di convertiremolto e�cacemente l'impulso a banda larga FF in un impulso SH a bandastretta. L'alta e�cienza di questo processo è quindi data dal fatto che i fotonidi SH sono generati non solo direttamente dal processo SHG ma anche da unprocesso SFG tra le componenti spettrali della FF che sono simmetriche rispettoalla frequenza di phase-matching per la seconda armonica [14, 15].

Si ottiene così un impulso di SH a banda stretta, con durata temporale al pse potenzialmente molto tunabile. Nel nostro caso la lunghezza d'onda del probeRaman è sempre vicina a quella della banda Soret delle emoproteine.Di seguito si riporta una trattazione più dettagliata riguardo la generazione diimpulsi Raman a banda stretta, tunabili nella regione dell'UV-VIS da 330 a 520nm, con larghezza di banda pari circa a 10 cm−1 ed energie che raggiungonoqualche µJ, utilizzati per l'acquisizione di spettri SRS ad alta risoluzione di


emoproteine.La sorgente laser basata su un cristallo Ti:Sa (Coherent Legend) produce im-pulsi centrati a 800 nm, con FWHM pari a 28 nm, durata temporale di 50 fs,energie pari a 3.5 mJ e repetition rate pari a 1 KHz. Nella con�gurazione ba-se il Raman pulse a banda stretta è generato tramite diretta SC degli impulsiuscenti dal cristallo Ti:Sa. Per comprendere la scelta del cristallo usato nellatecnica SC occorre ricordare che in un processo SHG, in presenza di un lar-go GDM tra gli impulsi interagenti, la FWHM dell'impulso SH, ∆νSH , è dataapprossimativamente da

∆νSH =0.886

(GDM)(3.5)

dove GDM=δL. L è la lunghezza del cristallo e δ è il group velocity mismatch(GVM) tra l'impulso alla frequenza fondamentale (FF) pari a 800 nm e l'impulsodi SH. Essa è de�nita come:

GDM =1

vgFF − vgSH(3.6)

Pertanto, per ottenere un impulso SH a banda stretta occorrono cristalli lunghi ealti valori di δ. Inoltre, poiché si desidera generare un impulso SH con energie nelµJ, il cristallo deve essere in grado di accettare impulsi con energie relativamentealte (dell'ordine di varie decine di µJ). I periodically poled crystals, che sono statiusati precedentemente per la tecnica SC [13, 14], subiscono danneggiamentofotorifrattivo nella regione dell'UV-VIS e, a causa del loro spessore limitato,non permettono di maneggiare impulsi molto energetici. Per questo motivosi è scelto di utilizzare un cristallo β-borato di bario (BBO), la cui bassa nonlinearità (≈ 2 pm/V) e il cui basso angolo di walk-o� (≈ 4◦) non sono dannosi peril processo SC grazie alla grande quantità di energia dell'impulso FF disponibile.Nel BBO la GVM tra gli impulsi FF e SHG varia tra 320 fs/mm a 90 fs/mmquando l'impulso FF ha lunghezza d'onda compresa tra i 660 nm e i 1040 nm:ciò implica che la larghezza di banda dell'impulso SH è più piccola di 16 cm−1

nell'intero range spettrale compreso tra 320 e 520 nm, avendo scelto L paria 25 mm. Sperimentalmente, l'impulso a 800 nm uscente dal Ti:Sa è statoraddoppiato in frequenza in un BBO lungo (25 mm). Una serie di spettri SH,ottenuti tiltando il BBO, è riportata in Fig. 3.1: dopo la deconvoluzione delcontributo strumentale, gli impulso SH presentano una larghezza di banda paria ≈ 8.7 cm−1 [16].

Tuttavia, la compressione spettrale dell'impulso FF proveniente dal cristalloTi:Sa garantisce una tunabilità limitata del Raman pulse, tra 385 e 415 nm.Questo range può essere considerabilmente esteso aggiungendo un ampli�catoreottico parametrico (OPA) a doppio stadio [16] o, come nel caso del layout otticoriportato in Fig. 3.10, un TOPAS-C [17]. La possibilità di aumentare il rangedi tunabilità del Raman pulse si traduce nella capacità di variare in un intornopiù ampio la sua lunghezza d'onda negli studi di Raman risonante.Un TOPAS-C, fornito da Light Conversion, è uno stage di conversione che fun-ziona come un OPA a doppio stadio. Un OPA a doppio stadio consiste indue OPA consecutivi: questa con�gurazione presenta diversi vantaggi rispettoa quella relativa a un singolo OPA, poiché permette di compensare il GVM chenasce tra i fasci entranti nel cristallo nei due stage. Inoltre in un OPA a doppiostadio risulta possibile regolare l'intensità di pompa e quindi il guadagno para-


Figura 3.1: spettro SHG (linea nera continua) e spettro FF (linea rossatratteggiata) [16].

metrico in ogni singolo stage [18]. Di seguito si riporta una breve descrizionedel funzionamento di un OPA.

Ampli�catore Ottico Parametrico (OPA)

In regime di accoppiamento non lineare due campi elettrici oscillanti a frequenzaω3 e ω2, sovrapposti spazialmente e temporalmente in un cristallo caratterizzatoda χ(2) non trascurabile, generano un terzo campo a frequenza ω1 secondo treprocessi fondamentali: sum frequency generation (SFG), second harmonic ge-neration (SHG) e di�erence frequency generation (DFG). Nel caso del processoDFG il fotone associato al campo elettromagnetico oscillante alla frequenza piùelevata possiede un'energia h̄ω3 pari alla somma di h̄ω1 e di h̄ω2 ed è quindi pos-sibile, sulla base di una serie di condizioni che devono essere sempre soddisfatte,che questo stesso fotone si suddivida nei due ad energia più bassa. Bisognatenere presente, tuttavia, che, per il caso delle onde piane, tale fenomeno nonsi può veri�care se il fascio a cui è associata la pulsazione ω3 propaga da solo,cioè senza un ulteriore fascio, in quanto la polarizzazione non lineare sarebbede�nita da due porzioni dello stesso fascio ad identica pulsazione e quindi co-stante. Perciò è necessario che ci sia una delle due componenti caratterizzateda fotoni meno energetici per poter ottenere, attraverso la di�erenza, l'altrofascio. Si può esprimere più correttamente il bilancio delle energie come segue:h̄ω3 + h̄ω2 = 2∆h̄ω2 + h̄ω1 in una relazione che è solo formalmente di�erentedall'espressione h̄ω3 − h̄ω2 = h̄ω1. Un'ulteriore possibilità di osservare que-sto e�etto si veri�ca con la generazione di frequenza di�erenza tra componentispettrali diverse di uno stesso impulso. La condizione necessaria perché si possarealizzare tale fenomeno è che l'impulso in ingresso sia a banda estremamentelarga, in modo che le code spettrali possano interagire. Nel caso in cui la ge-nerazione di frequenza di�erenza avvenga tra un primo fascio molto energeticoed un secondo più debole e di pulsazione inferiore, il processo è denominatoampli�cazione ottica parametrica; in questo caso i tre campi possono essere cosìride�niti:

• pompa, il fascio in ingresso a frequenza più elevata, ωP , caratterizzato


Figura 3.2: sequenza di spettri a banda stretta ottenuti tramite SC di un OPAnel visibile [16].

Figura 3.3: bilancio delle energie in un OPA tramite schematizzazione a livellivirtuali.

anche da una maggiore intensità rispetto al secondo fascio in ingresso nelcristallo;

• segnale, il secondo fascio in ingresso nel cristallo, di pulsazione ωS , anchemolto debole;

• idler, il fascio in uscita risultante dalla frequenza di�erenza ωi = ωP −ωS .

Per descrivere questo fenomeno si parla di ampli�cazione in quanto il segnalepuò essere ampli�cato di svariati ordini di grandezza purché si possa disporre diun fascio di pompa su�cientemente intenso; con l'ampli�cazione del segnale siviene a generare anche il terzo fascio, l'idler, la cui intensità ha un andamentoparagonabile a quella del segnale stesso. Per trattare l'ampli�cazione parame-trica si scrive un sistema di equazioni del sistema accoppiate che, considerandoun'approssimazione di onde monocromatiche e una pompa molto intensa, checomporta il fatto di considerarla sostanziamente costante, può essere riformulato


Figura 3.4: ampli�cazione ottica parametrica.

come: ∂AP (z)∂z = 0 → AP (z) = cost.

∂AS(z)∂z = −ikSA∗IAP e−i∆kz

∂AI(z)∂z = −ikIA∗S(z)e−i∆kz

(3.7)

in questo caso il phase mismatch viene de�nito dalla relazione ∆k = kP−kS−kI .ki = χ(2)ωi/2cni, dove ni è l'indice di rifrazione alla frequenza ωi e c è la velocitàdella luce. Indichiamo le condizioni al contorno, che descrivono l'iniezione deicampi di pompa e segnale con il primo molto più intenso del secondo: IS(z =0) = IS0, II(z = 0) = 0 e IP (∀z) = IP . E�ettuando la derivata della primaequazione del sistema e sostituendoci la seconda, si giunge a descrivere l'e�ettodi ampli�cazione sul segnale con l'equazione di�erenziale:

∂2AS∂z2

= −i∆k∂AS∂z

+ Γ2AS Γ2 = kSkIIP (3.8)

La propagazione del campo relativo alla pulsazione ωI è descritta da un'equa-zione del tutto simile dato che, una volta che il fascio di idler viene generato,questo concorre al processo tramite la di�erenza ωP − ωI = ωS aumentando asua volta il numero di fotoni del fascio di segnale e di conseguenza incrementan-do i propri. Quindi, avendo innescato due diversi meccanismi di generazione difrequenza di�erenza ci si aspetta una crescita esponenziale dell'intensità di idlere segnale; questa analisi quantitativa viene confermata dalle soluzioni esatte peri campi in questione:

IS(z) = IS0

{1 +

[Γg sinh(gz)

]2}

II(z) = ωIωSIS0

[Γg sinh(gz)

]2(3.9)

con il fattore g pari a Γ in caso di perfetto phase matching:

g =

√Γ2 − ∆k2

4(3.10)

L'annullamento del ∆k agisce massimizzando g e quindi rendendo molto piùgrande il guadagno di segnale, dato che la funzione sinh(x)/x diverge per xtendente all'in�nito. La crescita esponenziale dei fasci di segnale e di idler al-l'aumentare del percorso nel cristallo risulta quindi confermata dalla soluzione


esatta dell'evoluzione delle intensità: è il termine di seno iperbolico, dipenden-te dal termine g che decresce all'aumentare del phase mismatch, che descrivetale comportamento dei fasci in regime di ampli�cazione parametrica . Do-po aver percorso una distanza L nel cristallo non lineare per ∆k = 0, g = Gnell'approssimazione di grande guadagno ΓL� 1 vale che

IS(L) ≈ 1

4IS0e

2ΓL (3.11)

II(L) ≈ ωI4ωS

IS0e2ΓL (3.12)

Trattandosi di un meccanismo di ampli�cazione è de�nibile un fattore di gua-dagno G(z) come:

G(z) =IS(z)

IS0(3.13)

Nel caso in cui si ottenga l'adattamento della fase e si consideri un grande gua-dagno, Γz � 1, G(z) si può esprimere attraverso la più semplice e signi�cativaespressione:

G(z) = 1 + sinh2(Γz) ' 1

4e2Γz (3.14)

che, non solo evidenzia la dipendenza esponenziale dell'ampli�cazione dal per-corso nel cristallo, ma anche, essendo Γ ∝

√IP , dall'intensità del fascio di

pompa. Dopo una su�ciente propagazione nel cristallo non lineare, le intensitàdei fasci di segnale e di idler raggiungono valori tali da rendere inapplicabile lasempli�cazione di considerare che il fascio di pompa sia soggetto ad un bassosvuotamento nel processo di ampli�cazione; in queste condizioni le intensità ISe II non aumentano più avendo raggiunto la saturazione del guadagno. Spe-rimentalmente, risulta possibile ottenere e�cienze massime di circa il 40% disvuotamento della pompa. Il set-up che implementa l'ampli�cazione parametri-ca è detto Optical Parametric Ampli�er (OPA); la sovrapposizione temporaleviene ottenuta grazie ad una linea di ritardo che permette di uguagliare i cam-mini ottici degli impulsi. I fasci vengono quindi focalizzati in modo tale daottenere densità di potenza su�cientemente elevate da poter innescare l'e�ettonon lineare di generazione di frequenza di�erenza [18]. Tipicamente il fuoco nonè localizzato all'interno del mezzo non lineare, ma abbastanza lontano da nonottenere densità di potenza superiori alla soglia di danneggiamento del cristallostesso.

Filtraggio spettrale

Una limitazione intrinseca della generazione di seconda armonica per compres-sione spettrale è un pro�lo temporale sfavorevole dell'impulso a banda stretta,come illustrato in Fig. 3.5. Il lato destro della �gura mostra le forme speri-mentali dell'impulso a tre diverse lunghezze d'onda (misurate per e�etto Kerr),insieme ad onde sinusoidali che decadono esponenzialmente che rappresentanol'evoluzione dei modi vibrazionali del cicloesano a 802 cm−1 e 1027 cm−1, ca-ratterizzati rispettivamente da dephasing time pari a 2.0 ps e 0.65 ps [19]. Ilcut-o� molto netto del Raman pulse produce oscillazioni in ogni spettro SRS delcicloesano (lato sinistro di Fig. 3.5) a causa della relazione di Fourier tra i domi-ni del tempo e della frequenza. E' stato quindi introdotto un metodo semplice


per migliorare il pro�lo temporale degli impulsi generati da SH-SC che, inoltre,estende il range della tecnica a lunghezze d'onda più alte. Il metodo consiste nel�ltraggio spettrale degli impulsi ottenuti dalla tecnica SH-SC usando un �ltrospettrale double-pass (2f), un singolo reticolo (1800 linee/pollice, 410 blaze) euna slit regolabile nella regione di collimazione del fascio spettralmente disperso[20].I primi due pannelli di Fig. 3.6 mostrano le caratteristiche di un impulso a 520nm spettralmente �ltrato in funzione della larghezza della slit. A questa lun-ghezza d'onda il �ltro spettrale ha un'e�cienza di trasmissione del 50% con laslit completamente aperta e che scende al 15% per un'apertura della slit di 0.15mm. Ridurre la larghezza della slit sopprime le oscillazioni spettrali (spectralwings) come è visibile nel pannello di sinistra, mentre il pro�lo temporale corri-spondente evolve da una forma a "naso", caratteristica del compressore spettralenon �ltrato [14], verso un pro�lo più largo e più simmetrico (pannello centrale).Il pannello di destra in Fig. 3.6 mostra spettri SRS del cicloesano ottenuti conun Raman pulse generata tramite SH-SC e uno Stokes probe ottenuto tramitewhite-light continuum generation (WLC) [16]. Si noti che le oscillazioni spettralidel modo a 802 cm−1 diminuiscono con la larghezza della slit grazie a un miglio-ramento del pro�lo spettrale dell'impulso a banda stretta, mentre la risoluzionespettrale aumenta grazie a una durata temporale aumentata. Inoltre, rimuoverele code dell'impulso nel dominio delle frequenze migliora il segnale Raman nellaregione delle basse frequenze (al di sotto dei 300 cm−1), dove lo scattering Ray-leigh del Raman pulse maschera lo spettro vibrazionale. Una maggiore durata euna maggiore simmetria della forma dell'impulso �ltrato spettralmente tramiteSH-SC non solo migliora la risoluzione spettrale ma, simultaneamente, eliminale oscillazioni spettrali e garantisce un elevato RG per tutte e tre le lunghezzed'onda mostrate in Fig. 3.7.


Figura 3.5: colonna a sinistra: spettro SRS del cicloesano ottenuto usando latecnica SHG-SC per ottenere un Raman pulse a 520 nm, 430 nm e 380 nm(rispettivamente dall'alto verso il basso). Colonna a destra: pro�lo temporaledi ogni Raman pulse (in rosso) sovrapposto con il pro�lo temporale dei modivibrazionali del cicloesano a 802 cm−1 (in verde) e 1027 cm−1 (in blu). Lo zerotemporale è de�nito dall'arrivo dello Stokes probe del femtosecondo (si noti lascala logaritmica) [20].

Figura 3.6: e�etto della variazione della larghezza della slit su un Raman pulsecentrato a 520 nm. (a) Pro�lo spettrale, (b) pro�lo temporale e (c) corrispon-dente spettro SRS del cicloesano per slitta completamente aperta (in rosso),larghezza della slit pari a 0.6 mm (in verde), 0.3 mm (in blu), 0.2 mm (inmagenta) e 0.15 mm (in ciano) [20].


Figura 3.7: lato sinistro: spettro SRS del cicloesano per lunghezze d'onda delRaman pulse pari a 521, 602 e 688 nm (rispettivamente dall'alto in basso).Le barre di scala mostrano le lunghezze d'onda di Stokes probe corrispon-denti. L'energia del Raman pulse è 0.4 µJ . Nel lato destro è riportata unarappresentazione schematica del set-up 2f [20].

3.2.2 Stokes probe

Lo Stokes probe è generato tramite un e�etto di generazione di supercontinuo(WLC) ottenuto focalizzando l'impulso FF in un cristallo za�ro di 2 mm (percoprire un range spettrale di circa 400 nm) o di CaF2 (per un range di lun-ghezza d'onda più basso), posizionato su un traslatore per ridurre gli e�etti didanneggiamento termico del cristallo. Lo za�ro garantisce una elevata stabilitàshot-to-shot ma il suo WLC si estende solo al di sotto dei 450 nm. Il cristallodi CaF2 richiede una traslazione continua che risulta in �uttuazione più ampie,ma il suo WLC si estende al di sotto dei 340 nm e permette di sfruttare latunabilità del Raman pulse a basse frequenze [16]. La generazione del bianco èun processo a soglia, quindi è necessario regolare accuratamente l'energia del-l'impulso incidente e la focalizzazione per mettersi subito sopra la soglia checonsente di ottenere un solo �lamento di luce bianca. Il fascio viene diretto dauno specchio di argento su una lente di BK7 con lunghezza focale di 100 mm,passando attraverso un attenuatore variabile lineare, montato su un traslatore,per la regolazione dell'energia. La lente focalizza il fascio sul cristallo di za�roche è montato su un traslatore per poter variare la sua posizione rispetto alfuoco della lente. All'uscita dal cristallo il fascio di luce bianca viene collimatoda una lente di BK7 con focale 50 mm opportunamente dotata di un traslatore.Lo spettro del bianco presenta, come ovvio, un picco in corrispendenza dellalunghezza d'onda della luce incidente sul cristallo, in questo caso pari a 800 nm[17].


Figura 3.8: schema della generazione WLC [17].

Figura 3.9: (a) lo spettro di supercontinuo generato in un cristallo za�ro pre-senta un ripido decremento dell'intensità al di sotto dei 500 nm; (b) lo spettrodi supercontinuo generato in un cristallo di CaF2 fornisce intensità più alte,specialmente nella regione di lunghezza d'onda inferiore a 450 nm [21].

3.3 Sistema di rivelazione

Dopo l'interazione con il campione lo Stokes probe viene raccolto da un sistemadi rivelazione. La rivelazione del fascio di probe è "shot-to-shot" perché per-mette di ridurre il noise della misura quando combinata con l'uso di un chopper.Inoltre, grazie all'analizzatore multicanale (OMA) avvengono simultaneamentemisure per un range molto ampio di lunghezza d'onda. Pertanto è richiesto undetector molto veloce. Dopo aver interagito con il campione, il probe è foca-lizzato nella slit del monocromatore. Il monocromatore (Acton sp 2500) ha trereticoli con rispettivamente 150, 1200, 2400 righe al mm. Per l'esperimento diSRS si applica perlopiù il secondo reticolo. Il monocromatore disperde il fasciosu una CCD (princeton pixis 400). La CCD ha 1340 pixel orizzontali e 400 pixelverticali. Il numero di pixel orizzontali determina la risoluzione in frequenza del-l'apparato. Una GUI (Graphical User Interface) realizzata ad hoc e un softwaredi acquisizione, basato sulla piattaforma MATLAB, permettono di registrare emanipolare gli spettri di trasmissione dello Stokes probe. Il software è ancheresponsabile della sincronizzazione tra le sorgenti laser (ossia del chopper con iltreno di impulsi del Raman pulse) e l'acquisizione dei dati [22].


Figura 3.10: Rappresentazione schematica del set-up per un esperimento SRS.Il fascio blu rappresenta il Raman pulse, quello arancione lo Stokes probe. En-trambi vengono generati sfruttando e�etti ottici non lineari a partire da unasorgente laser comune centrata a 800 nm, in magenta. Il fascio centrale, inverde, rappresenta un fascio laser aggiuntivo nel caso di esperimenti SRS risoltiin tempo (FSRS), non a�rontati in questo lavoro. (CPA=Chirped Pulse Am-pli�cation; OPA=Optical Parametric Ampli�er; SHG BBO= Second Harmonicgeneration Beta Barium Borate; WLG= White Light Generation; VA=VariableAttenuator) [17].

3.4 Calibrazione

Per ottenere una corretta calibrazione della linea Raman si può procedere in duemodi. Si può ottenere la posizione esatta del probe Raman ma questo approccioè sconveniente perchè occorre muovere il reticolo nel monocromatore e inoltre ilprobe Raman non può entrare nel monocromatore facilmente. Questo secondoproblema può essere risolto raccogliendo il probe Raman dopo un processo didi�usione anche se si osserva una piccola distorsione dello spettro raccolto acausa dell'entrata del modo nel monocromatore. La soluzione alternativa èquella di usare come standard di calibrazione una riga Raman del cicloesano,che ha un'alta sezione d'urto Raman [22].

3.5 Preparazione del campione

La mioglobina usata è mioglobina estratta da cuore di cavallo, fornita da SigmaAldrich. La proteina lio�lizzata è nella forma ferrica poiché l'atomo di Fe delgruppo eme è stabile in stato di ossidazione (III) se esposto all'aria. La soluzionesu cui e�ettuare la misura è stata preparata sciogliendo la proteina lio�lizzatain una soluzione tampone a pH=7, ottenuta sciogliendo in acqua distillata legiuste quantità di NaH2PO4 e Na2HPO4. La soluzione tampone è stata op-portunamente degassata e saturata con un �usso di N2 per evitare la presenzadi O2 il quale tenderebbe a legarsi alla mioglobina, generando la forma mioglo-


bina "oxy" indesiderata. La proteina ferrica è stata trattata con un eccesso diditionito di sodio (Na2S2O4), un agente riducente che garantisce il manteni-mento della proteina nella forma ferrosa "deoxy". Il trattamento con ditionitodi sodio è stato e�ettuato in atmosfera di azoto per evitare la formazione dellegame tra la mioglobina e l'ossigeno atmosferico, che tende a legarsi immedia-tamente al Fe(II). La concentrazione del campione è compresa tra i 100 µM e i200 µM, misurata tramite uno spettrofotometro UV-VIS. Dopo la preparazionedel campione alla concentrazione desiderata, il campione è stato posto in unacella di trasmissione connessa ad un circuito che garantisce un �usso continuodel campione esposto al laser grazie a una pompa peristaltica. E' essenzialeavere un �usso costante per esporre campione fresco a ogni impulso laser, cheha repetition rate di 1 KHz. La cella di trasmissione è stata alloggiata in untraslatore che garantisce un movimento lento e costante della cella, per evitareche i due fasci laser, Raman e Stokes, agiscano sempre nello stesso punto dellacella durante l'acquisizione, evitando così il danneggiamento delle �nestre dellacella stessa.

Capitolo 4

Risultati e discussione

4.1 Evidenze sperimentali

La spettroscopia SRS nella sua implementazione a banda larga (Broadband Sti-mulated Raman Spectroscopy, B-SRS), introdotta nella sezione 2.2, si basa suun processo non lineare che modi�ca i campi Raman e Stokes producendo untrasferimento di fotoni tra di essi, che risulta nella generazione del segnale Ra-man sovrapposto a quello dello Stokes probe. Nel caso dell'SRS il segnale nettosul lato rosso rispetto alla frequenza del Raman pulse è dovuto all'interazio-ne radiazione-materia descritta dal diagramma RRS(Icc), mentre il segnale sullato blu è dovuto a IRS(Ica). D'ora in poi nella discussione ci si riferirà aidue segnali rispettivamente con i termini lato rosso e lato blu; è preferibile usa-re questa terminologia per di�erenziare la nomenclatura dal caso di Ramanspontaneo, in cui i due lati dello spettro sono denominati Stokes e anti-Stokes.Nel caso del Raman spontaneo i processi Stokes e anti-Stokes sono descritti dadiagrammi in cui la prima interazione ha origine, rispettivamente, dal livellovibrazionale fondamentale e dal un livello vibrazionalmente eccitato nello statoelettronico fondamentale. Al contrario, nel caso dell'SRS, i due lati dello spet-tro sono descritti entrambi da diagrammi in cui la prima interazione ha originedal livello vibrazionale fondamentale dello stato elettronico fondamentale. So-no state condotte una serie di misure al �ne di ottenere spettri Raman dellamioglobina "deoxy" al variare della lunghezza d'onda del Raman pulse. In par-ticolare la lunghezza d'onda del campo Raman viene fatta variare in un intorno,compreso tra 428 nm e 487 nm, del massimo della banda Soret dello spettrodi assorbimento della mioglobina. In condizioni di non risonanza il lato rossodello spettro contiene la stessa informazione spettrale ed è analogo allo spettroStokes del Raman spontaneo, ossia consiste in un picco di intensità positiva(Stimulated Raman Gain, SRG). Il lato blu presenta invece dei picchi negativi(Stimulated Raman Loss, SRL) e, a di�erenza del Raman spontaneo, il rapportotra le intensità del lato rosso e del lato blu non contiene alcuna informazioneriguardo la temperatura locale del sistema [20].Come chiarito nella sezione 2.11.1, in condizioni di risonanza la risposta SRSha un comportamento più complesso. Il pro�lo spettrale del lato rosso noncambia signi�cativamente anche se l'intensità aumenta per risonanza con unadipendenza molto simile al pro�lo di eccitazione del Raman spontaneo. Inve-

58

CAPITOLO 4. RISULTATI E DISCUSSIONE 59

ce le forme di riga del lato blu sono completamente diverse: evolvono da gainnegativi in condizioni di perfetta non risonanza a gain positivi in condizioni diperfetta risonanza, passando attraverso pro�li dispersivi in condizioni di riso-nanza intermedie per e�etto della scansione della lunghezza d'onda del Ramanpulse attraverso lo spettro della banda Soret.

In Fig. 4.1 sono riportati gli spettri per un campione di mioglobina "deoxy"eccitato da un Raman pulse la cui lunghezza d'onda varia all'interno della regio-ne spettrale della banda Soret della mioglobina. Mentre il lato rosso presentauna condizione di risonanza con piccole deviazioni rispetto al massimo dellabanda Soret (mostrato nei pannelli laterali in Fig. 4.1), il Raman gain massimonel caso del lato blu dipende in maniera peculiare dallo speci�co modo vibra-zionale e in particolare si manifesta ad energie minori di un quanto vibrazionalerispetto al lato rosso dello spettro. In particolare, maggiore è la frequenza dellivello vibrazionale, minore è l'energia del fotone del Raman pulse necessario araggiungere la condizione di risonanza. Inoltre, la risposta nel lato blu cambiasegno quando è raggiunta la condizione di perfetta risonanza. Infatti, il segnalesul lato blu è negativo in condizioni di perfetta non risonanza e diventa positivoquando la lunghezza d'onda del Raman pulse è in condizioni di perfetta riso-nanza, passando attraverso forme di riga dispersive nei casi intermedi.La dipendenza delle forme di riga dalla lunghezza d'onda del Raman pulse ècaratteristica del singolo modo, come mostrato in Fig. 4.2.Prendendo come esempio il picco Raman ν4 (modo vibrazionale ad energia1355 cm−1), si osserva una forma di riga lorenziana positiva quando la lun-ghezza d'onda del Raman pulse, λR, è pari a 467 nm; aumentando o riducendola lunghezza d'onda del Raman pulse di circa 20 nm rispetto alla condizione diperfetta risonanza a 467 nm, il picco Raman si trasforma in una debole bandanegativa. La forma dispersiva della forma di riga del modo ν4 si manifesta avalori di lunghezza d'onda intermedi e presenta una simmetria dispari: quandoλR viene incrementata, il lobo positivo è a frequenze più alte mentre quandoλR è diminuita si genera un lobo negativo sul lato delle alte frequenze. Un an-damento molto simile si manifesta per il modo ν7: in questo caso la condizionedi perfetta risonanza è raggiunta per λR = 456 nm.

La polarizzazione al terzo ordine indotta nel campione, responsabile dei se-gnali SRG e SRL, può essere valutata tramite un'espansione perturbativa dellamatrice densità in potenza dei campi elettrici, come precedentemente descrit-to nel Capitolo 2. Data la presenza di un Raman pulse a banda stretta e diuno Stokes probe con durata del femtosecondo, si deve tenere conto di tutte lepossibili permutazioni dei campi le quali sono responsabili dei diversi contributialla polarizzazione totale P (3). Tuttavia, come dimostrato nel Capitolo 2, glispettri possono essere riprodotti da due contributi four-wave-mixing dominanti,uno per ogni lato dello spettro: RRS(Icc) per il lato rosso e IRS(Ica) per il latoblu (Fig. 4.1 , pannelli laterali).I diagrammi in Fig. 4.1 descrivono l'evoluzione della matrice densità che descri-ve il materiale durante l'interazione con i campi elettromagnetici. Per quantoriguarda il lato rosso, il Raman pulse interagisce per primo con il mezzo portan-do il bra della matrice densità in uno stato elettronico eccitato; successivamenteuna diseccitazione del bra indotta dallo Stokes probe porta il bra in uno statovibrazionalmente eccitato (n=1) nel ground state elettronico, inducendo unacoerenza vibrazionale che è quindi rivelata tramite una ulteriore interazione con


Figura 4.1: spettro SRS della mioglobina. Pannello centrale: colormap deglispettri B-SRS in cui si evince la dipendenza dalla lunghezza d'onda del Ramanpulse. I segnali sono sempre positivi nel lato rosso dello spettro, mentre nellato blu presentano di�erenti pro�li a seconda della condizione di risonanza. Lefrecce evidenziano le energie caratteristiche dei due modi normali ν7 e ν4 relativeal ground state elettronico. Pannelli laterali: diagrammi FWMEL per i segnaliRRS(Icc) e IRS(Ica) [24].

il Raman pulse sul ket della matrice densità e un free induction decay �nale.Nel lato blu i campi interagiscono solo con il ket della matrice densità. La pri-ma interazione è con lo Stokes probe, che promuove il ket dal ground state allostato elettronico eccitato |b〉; successivamente il Raman pulse induce la coeren-za vibrazionale |c〉〈a|, che può essere rivelata dopo una terza interazione con ilRaman pulse e un free induction decay �nale. Si coglie l'occasione per ribadireche il contributo del lato blu non coinvolge una transizione iniziale che parte daun livello vibrazionale eccitato (come è visibile dal diagramma), pertanto noncorrisponde a un fenomeno anti-Stokes come nel caso del Raman spontaneo. [23]

La Fig. 4.3 mostra una porzione del lato blu dello spettro, dove compaionoi modi ν4 e ν7 della mioglobina per di�erenti valori di lunghezza d'onda delRaman pulse λR. Si riporta di seguito l'analisi per questi due modi che, oltread essere i più biologicamente rilevanti, sono stretching altamente simmetrici(quindi caratterizzati da elevate sezioni d'urto) dell'anello pirrolico dell'eme;tuttavia l'analisi è estendibile a tutti gli altri modi dello spettro SRS. Per com-prendere il particolare comportamento del lato blu dello spettro SRS per quantoriguarda questi due modi, i dati sono stati analizzati valutando nel dominio dellefrequenze la funzione risposta non lineare associata ai due diagrammi in Fig.4.1.

In Fig. 4.2 sono riportate le bande SRS ν7 e ν4 per il lato blu dello spettro infunzione di λR. La funzione che modellizza lo spettro SRS disperso in frequenzaè

I(ω, λR) = A(λR) Im

{P (3)(ω, λR)

E(0)P (ω)

}(4.1)

dove E(0)P è lo Stokes probe in assenza di Raman pulse e A(λR) è un parametro


R

aman

Gai

n

Raman Shift (cm-1)

Figura 4.2: Dipendenza da λR del lato blu dello spettro SRS per i modi Ramanν7 (670 cm−1) e ν4 (1354 cm−1). Le forme di riga sperimentali sono rappre-sentate da punti; le linee continue rappresentano il modello per i pro�li di rigadescritto dall'equazione 4.1. In condizioni di perfetta non risonanza (428 nm e472 nm per il modo ν7 o 487 nm per il modo ν4) il segnale è un debole picconegativo, mentre in condizioni di perfetta risonanza (ossia 456 nm e 467 nmrispettivamente per i modi ν7 e ν4) il segnale diventa positivo e più intenso.La transizione tra loss e gain procede tramite una condizione semirisonante,generando una forma di riga dispersiva [24].

positivo ottimizzabile che tiene conto del Raman Excitation Pro�le.

Le polarizzazioni per ogni lato dello spettro possono essere ottenute diretta-mente dai diagrammi in Fig 4.1, come precedentemente mostrato nel Capitolo2. Scrivendo i campi Raman e Stokes come

ER,S(t) = εR,S(t)e−iωR,St + c.c. (4.2)

si ottiene

P(3)RED(ω, λR) = |µab|2|µbc|2

1

ωbc − ω − iΓbc

∫ +∞

−∞dω1

ε∗(ω1)

ωR + ω1 − ωba − iΓab×

∫ +∞

−∞dω3

εR(ω3)εP (ω − ωP + ω1 − ω3)

ω − ω3 − ωR + ωca + iΓac(4.3)

e per il lato blu,

P(3)BLUE(ω, λR) = |µab|2|µbc|2

1

ω − ωba + 1Γba

∫ +∞

−∞dω1

ε∗(ω1)

ω − ωR − ω1 − ωca + iΓca×


Figura 4.3: dipendenza del lato blu dello spettro SRS dalla lunghezza d'onda delRaman pulse per i modi ν7 (a) e ν4 (b) della mioglobina. Il segnale è negativo incondizioni di non risonanza e diventa positivo quando λR è in perfetta risonanza.(c, d): ricostruzione del segnale ottenuto dall'equazione 4.1 [24].

∫ +∞

−∞dω3

ε∗(ω3)εP (ω + ωP − ω1 + ω3)

ω − ωba + ω3 − ω1 + iΓba)(4.4)

dove µij è il momento di dipolo di transizione tra gli stati i e j , ωij = ωi −ωj è la di�erenza di frequenza tra i livelli i e j e Γij è il rate di dephasingdella coerenza indotta |i〉〈j|. Le lettere a, b e c indicano rispettivamente lostato elettronico fondamentale, uno stato elettronico eccitato e un generico statovibrazionalmente eccitato nello stato elettronico fondamentale.Le ampiezze temporali del Raman pulse e dello Stokes Probe, εR(t) e εS(t),sono modellizzate come pro�li gaussiani:

εR(t) = ε(0)R e− t2

2σ2R → ER(t) = ε

(0)R e− t2

2σ2R eiωRt + c.c. (4.5)

εP (t) = ε(0)P e− (t−tP )2

2σ2P → EP (t) = ε

(0)P e− (t−tP )2

2σ2P eiωP t + c.c. (4.6)

dove tP è il ritardo temporale tra il Raman pulse e lo Stokes probe; εR, ωR e σRsono calibrati usando lo spettro SRS del cicloesano (Capitolo 3, sezione 3.4).Per sempli�care le equazioni (4.2) e (4.3) e interpretare il lato rosso e il lato bludello spettro, si considera il caso sempli�cato in cui il Raman pulse è monocro-matico (εR(t) = 1) e lo Stokes probe istantaneo (εP (t) = δ(t)), già illustratodettagliatamente nel Capitolo 2. Si riportano di seguito le equazioni (2.99) e(2.103) precedentemente calcolate nella sottosezione 2.8.1:

P(3)RRS(Icc)

(ω) =

(1

h̄

)3

|µab|2|µcb|21

(ωbc − ω − iΓbc)(−ωR + ωca + iΓac+ ω)×


1

(ωR − ω̃ba − iΓab)(2.99)

P(3)IRS(Ica)(ω) =

(1

h̄

)3

|µab|2|µcb|21

(ω − ωba + iΓba)2×

1

(ω − ωR − ωca + iΓca)(2.103)

Le equazioni (2.99) e (2.103) permettono di chiarire l'e�etto della condizionedi risonanza sul lato rosso e blu dello spettro SRS. Nel primo caso, la condizionedi risonanza si manifesta per ωR = ωba, in analogia con il Raman spontaneo. Nelsecondo caso, invece, la condizione di risonanza dipende dall'energia del modovibrazionale ωca coinvolto nel processo, poiché ωR = ωba − ωca. L'aumentoo il decremento del numero di fotoni nell'impulso di probe, che corrisponderispettivamente a picchi Raman positivi o negativi, è governato dal segno dellaparte immaginaria della P (3)(ω), come mostrato nell'equazione (4.1). Nel latorosso, il segno della parte immaginaria calcolato attraverso il diagramma sullasinistra della Fig. 4.1, non dipende da λR ed è sempre positivo. Pertanto laforma di riga SRG è un picco positivo per ogni lunghezza d'onda del Ramanpulse.Il caso più interessante è tuttavia rappresentato dal lato blu. Nel caso SRL,infatti, la risonanza elettronica restituisce un segno negativo e positivo dellaparte immaginaria descritta nell'equazione (4.1), rispettivamente in condizionidi non risonanza e di perfetta risonanza.

Questo risultato razionalizza il comportamento del lato blu dello spettro.Come mostrato in Fig. 4.2 gli spettri SRS sono ben riprodotti dal model-lo rappresentato dall'equazione (4.1) per ogni λR, usando ωca = 1354 cm−1

e Γca = 10 cm−1 per il modo ν4 e ωca = 671 cm−1 e Γca = 10.5 cm−1

per il modo ν7. I parametri ωba, Γba e A(λR) sono stati ottimizzati per ot-tenere il best �t dei dati sperimentali, che permettono di valutare il REP(Stimulated Raman Excitation Profile) per il lato blu dello spettro per tutti imodi Raman attivi (Fig. 4.4), come:

REP (λR) =A(λR)

|ωR + ωca − ωba + iΓba|2(4.9)

dove ωba e Γba modellizzano un semplice assorbimento lorenziano ed eventualideviazioni da questo pro�lo sono contenute nel fattore di correzione A(λR).

Inoltre questi risultati permettono di capire perché, sotto condizioni di ri-sonanza, il lato blu dello spettro mostra picchi Raman più intensi, fornendoun miglior rapporto segnale rumore. Nel lato rosso l'intensità massima delRaman gain si ottiene per λR in corrispondenza del massimo di assorbimentoelettronico (banda Soret centrata a 435 nm). Di conseguenza, mentre viaggiaattraverso il campione, il Raman pulse sperimenta un e�etto di attenuazione acausa dell'assorbimento e l'intensità e�ettiva che contribuisce alla generazionedel segnale SRS è di conseguenza ridotta. Al contrario, nel lato blu, la condizio-ne di risonanza si manifesta per frequenze del Raman pulse ridotte rispetto allafrequenza del picco di assorbimento Soret di una quantità ωca. Di conseguenza,maggiore è l'energia del modo vibrazionale, minore è l'attenuazione indotta dal-l'assorbimento del Raman pulse da parte del campione. E' chiaro che maggiore è


l'intensità e�ettiva del Raman pulse, maggiore è l'intensità del segnale SRS. [24]

Resonance A( R) REP

Resonance A( R) REP

430 440 450 460 4700

1

2

3

4

440 450 460 470 480

Inte

nsity

(AU

)

R (nm)

R (nm)

Figura 4.4: Raman Excitation Pro�le per i modi ν7 e ν4. Gli e�etti di risonanzasono considerati in questo modello da due contributi: un e�etto di assorbimentolorenziano (linee nere) e il fattore A(λR) dell'equazione (4.1) (linee ciano). IREP sono ottenuti dal prodotto di questi e�etti e sono rappresentati dalle lineeblu per i modi Raman ν7 e ν4 [24].

In Fig. 4.5 sono riportate le intensità SRS sperimentalmente determinateper diversi modi della mioglobina. Per ogni modo l'intensità è valutata comel'integrale del valore assoluto del segnale SRS: variando λR, si osserva un au-mento generale del pro�lo di risonanza del lato blu rispetto al lato rosso. Inoltre,la dipendenza dalla lunghezza d'onda delle intensità del lato blu dello spettropresenta, come già detto, una condizione di risonanza spostata in termini di λRche dipende peculiarmente dalla frequenza vibrazionale speci�ca ωca. Al con-trario, la condizione di risonanza nel lato rosso è completamente indipendentedal modo Raman della mioglobina. Tuttavia, un'attenta analisi di quest'ultimopro�lo, rivela un piccolo blueshift, in accordo con quanto descritto in letteratura[5].


0.000.060.12

0.0

0.4

0.8

0.00

0.15

0.30

420 430 440 450 460 470 4800.00

0.03

0.06 365 cm-1

670 cm-1

1355 cm-1

1610 cm-1

Inte

nsity

(AU

)

R (nm)

Figura 4.5: dipendenza dello spettro SRS dalla lunghezza d'onda del Ramanpulse per i modi a 365 cm−1(δ(CβCcCd)), 670 cm−1 (ν7), 1354 cm−1 (ν4) e1610 cm−1 (ν10) della mioglobina, valutati come l'integrale del valore assolutodel segnale SRS per ogni modo [24].

4.2 Procedura di interpolazione, sottrazione del-

la linea di base e calibrazione

Per isolare il contributo Raman negli spettri SRS della mioglobina occorre ri-muovere il segnale di fondo. Nel caso della mioglobina l'assorbimento transientedel Raman pulse ed un contributo addizionale non lineare dovuto sia alla mio-globina che al solvente generano una linea di base allargata. Questa può essererimossa aggiungendo un polinomio di basso grado (secondo o terzo) alla proce-dura di �tting presentata precedentemente in Eq. (4.1). In Fig. 4.6 è riportatoil segnale di fondo polinomiale ottenuto nella procedura di �tting nella regionedi alta frequenza intorno al modo ν4. L'area colorata rappresenta i contributiSRS isolati.

Lo spettro SRS del cicloesano è stato acquisito ed usato per la calibrazio-ne del Raman pulse e dei parametri dello Stokes probe che compaiono nelleequazioni (4.5) e (4.6). La frequenza del Raman pulse (ωR) e la sua ampiezza(ε(0)R ) sono state misurate tramite il curve �tting della posizione e dell'intensità

dei modi Raman del cicloesano. La durata temporale del Raman pulse (σR) eil ritardo temporale tP sono ottenuti dalla stessa procedura di interpolazionesul modo più risolto a 800 cm−1 del cicloesano, usando l'equazione (4.3) comemostrato in Fig. 4.7.


Figura 4.6: esempio di rimozione della baseline. Il segnale di fondo polinomialeottenuto nella procedura di �tting per la regione di alta frequenza intorno almodo ν4, dove l'area colorata rappresenta i segnali SRS isolati.

Figura 4.7: calibrazione con cicloesano. Lo spettro del cicloesano è stato inter-polato per calibrare la durata del Raman pulse (σR) e il suo ritardo temporalerispetto allo Stokes probe (tP ). Nella �gura sono riportati questi parametri in-sieme ad altri risultati del �t, come la posizione del picco ωca e la sua larghezzadi banda γca = Γca per lo speci�co modo del cicloesano a 800 cm−1. Le piccoleoscillazioni negative laterali indicano che lo Stokes probe precede temporalmen-te il Raman pulse, assicurando la migliore condizione di misura in termini dirisoluzione spettrale e RG [19].

4.3 Conclusioni

In questo lavoro sono stati riportati gli spettri SRS della mioglobina "deoxy"con lo scopo di esplorare gli e�etti della risonanza elettronica al variare dellalunghezza d'onda del Raman pulse in un intorno del massimo della banda So-ret di assorbimento. La tecnica SRS permette di ottenere spettri vibrazionaliad alta risoluzione nella regione compresa tra 200 cm−1 e 2000 cm−1, liberidal background dovuto alla �uorescenza. Per il lato rosso dello spettro è sta-ta veri�cata una sostanziale equivalenza tra il segnale SRS e il segnale Stokesdel Raman spontaneo. [4] Nel lato blu dello spettro sono state invece osserva-te forme di riga negative e dispersive rispettivamente in condizioni di perfetta


non risonanza e in condizioni di semirisonanza. I picchi Raman del lato bludello spettro diventano positivi solo nella condizione di perfetta risonanza, chedipende strettamente dalla frequenza caratteristica del modo. Una trattazionequantistica del campione ha permesso, ricorrendo al formalismo della matricedensità, di identi�care e valutare i contributi della polarizzazione al terzo ordi-ne responsabili del segnale SRS, riproducendo i dati sperimentali. L'approccioproposto, applicato in questa tesi per interpretare lo spettro della mioglobina, èda inquadrare in un contesto più ampio e costituisce una procedura generale perestrarre i pro�li di eccitazione (Raman Excitation Profiles) a partire da formedi riga spettrali complesse.La capacità di ampli�care selettivamente l'intensità dei picchi Raman, insiemealla sua selettività strutturale, rende l'SRS una tecnica estremamente adatta perlo studio degli e�etti di risonanza Franck-Condon e per l'estrazione di informa-zioni quantitative sulle ampiezze di vibrazione e sugli accoppiamenti vibronici.Inoltre, poiché la cross section del lato blu dello spettro SRS aumenta note-volmente in condizioni di risonanza, questo lato dello spettro può rivelarsi unmigliore candidato per l'acquisizione del segnale Raman.Si anticipa che lo studio delle forme di riga dello spettro SRS e soprattutto ilcambiamento da esse subito per e�etto della risonanza potrà rivelarsi in futu-ro molto importante negli esperimenti di dinamica ultraveloce. Aggiungendoall'esperimento un ulteriore fascio laser di pompa e usando l'SRS come pro-be si può e�ettuare uno studio risolto in tempo sulle scale del femtosecondo(Femtosecond Stimulated Raman Spectroscopy), in cui è fondamentale saper di-stinguere le variazioni delle forme di riga causate dall'evoluzione dinamica delsistema da quelle semplicemente indotte in condizioni statiche ma risonanti.

Appendice A

Electronic Resonances in

Broadband Stimulated

Raman

Spectroscopy

Nelle pagine seguenti si riporta la pubblicazione che è stata �nalizzata a questolavoro di tesi.

68

1Scientific RepoRts | 6:18445 | DOI: 10.1038/srep18445

www.nature.com/scientificreports

Electronic resonances in broadband stimulated Raman spectroscopyG. Batignani1,2, E. Pontecorvo1, G. Giovannetti1, C. Ferrante1, G. Fumero1 & T. Scopigno1,3

Spontaneous Raman spectroscopy is a formidable tool to probe molecular vibrations. Under electronic resonance conditions, the cross section can be selectively enhanced enabling structural sensitivity to specific chromophores and reaction centers. The addition of an ultrashort, broadband femtosecond pulse to the excitation field allows for coherent stimulation of diverse molecular vibrations. Within such a scheme, vibrational spectra are engraved onto a highly directional field, and can be heterodyne detected overwhelming fluorescence and other incoherent signals. At variance with spontaneous resonance Raman, however, interpreting the spectral information is not straightforward, due to the manifold of field interactions concurring to the third order nonlinear response. Taking as an example vibrational spectra of heme proteins excited in the Soret band, we introduce a general approach to extract the stimulated Raman excitation profiles from complex spectral lineshapes. Specifically, by a quantum treatment of the matter through density matrix description of the third order nonlinear polarization, we identify the contributions which generate the Raman bands, by taking into account for the cross section of each process.

Spontaneous Raman (SR) spectroscopy is a powerful technique which has been widely exploited to investigate complex molecular and solid state systems. Its inherent sensitivity to the vibrational properties, allows to extract structural and dynamical information, despite a relatively weak cross section. An enhancement of the Raman signal, essential for studies at low concentrations or in low cross section compounds, is achieved by Resonance Raman Spectroscopy (RRS), in which the Raman excitation wavelength is tuned to match the energy of an elec-tronic transition of the system1,2. By varying the resonance condition, RRS enables to selectively isolate the con-tributions from different chromophores, providing detailed information with structural resolution. Even under resonance conditions, however, the SR cross section is several orders of magnitude smaller than the fluorescence emission, which can easily overwhelm Raman signals. Furthermore, SR is an incoherent process and the generated radiation is spread over a 4π steradian solid angle. One of the most critical limitations of SR arises when it is used as a probe technique for time resolved studies of ultrafast structural dynamics. In this case, the temporal and energy resolution is fundamentally constrained by the Fourier transform limit, i.e. by the time-bandwidth product of the light pulse, which dictates ∆ ∆ −⩾E t 15 cm ps1 3–5 thus preventing the access to sub-picosecond dynamics with adequate spectral resolution.

Recently, the development of novel nonlinear vibrational spectroscopies has allowed to mitigate such limitations. In particular, broadband Stimulated Raman Spectroscopy (SRS) provides high intensity, fluorescence background free coherent signal. In SRS the sample is interrogated by a pair of overlapped narrowband picosecond Raman Pulse (RP) and broadband femtosecond Probe Pulse (PP). Vibrational spectra are generated on top of the highly directional PP, hence the incoherent fluorescence background is efficiently suppressed. Adding an ultrashort photo-excitation pulse, which triggers a photochemical process, turns SRS into Femtosecond Stimulated Raman spectroscopy (FSRS)6–15, the ideal tool to study structural changes in ultrafast photophysical and photochemical processes, providing both femtosecond time resolution and high spectral resolution16,17. The Raman bands in SRS spectra are induced by the third order Raman susceptibility and arise as a modification of the PP spectral profile. Therefore, it is convenient to define the stimulated Raman gain as: ∝

ω

ω

( )

( )

( )

ISRG PEP

318,19, where EP(ω) is the spectral

envelope of the PP, P(3) (ω) is the third order polarization induced in the sample and ( )I z indicates the imaginary part of z. As in Spontaneous Raman, the SRS features arise both to the red and to the blue side of the Raman pulse. While the red component of the SRS spectrum is always a positive signal and corresponds to a Stokes process in

1Universitá di Roma “La Sapienza”, Dipartimento di Fisica, Roma, I-00185, Italy. 2Universitá degli Studi dell’Aquila, Dipartimento di Scienze Fisiche e Chimiche, L’Aquila, I-67100, Italy. 3Istituto Italiano di Tecnologia, Center for Life Nano Science @Sapienza, Roma, I-00161, Italy. Correspondence and requests for materials should be addressed to T.S. (email: [email protected])

received: 30 July 2015

Accepted: 12 October 2015

Published: 05 January 2016

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Spontaneous Raman, the blue component has no spontaneous (Antistokes) counterpart20 and shows a rich line-shape dependence on the resonance condition induced by the RP wavelength. This latter peculiar behavior has only recently been addressed in a few works21–24 and an overall experimental and theoretical analysis has not yet been proposed, clarifying the exact mechanism which rules the link between vibrational lineshapes and resonance condition, as well as the enhancement of the cross section in the blue side respect to the red side.

In this paper, taking advantage of a simple diagrammatic approach to calculate the third order nonlinear polar-ization induced in the system, we identify the physical processes ruling the red and blue signals of SRS spectra. Hence, the behavior of broadband SRS spectra and their dependence on resonance conditions are fully understood and a general way to extrapolate the Raman Excitation profile for the blue side of the spectrum is proposed. Our approach is experimentally validated by reproducing resonance effects on a paradigmatic heme protein, namely ferrous Myoglobin (Mb), probed by SRS across the Soret absorption band.

Result and DiscussionBroadband Stimulated Raman spectroscopy exploits the macroscopic nonlinear third order polarization (P(3)) induced in a Raman-active medium by the spatial and temporal overlap of a narrowband RP and femtosecond PP pulses, to obtain high quality Raman spectra. The nonlinear process perturbs the Raman and Probe fields and produces a transfer of photons between them, which results in the generation of Raman signals on top of the PP. In off resonance condition the red side of the Stimulated Raman spectrum (relative to the RP) is analogous to a SR Stokes spectrum, i.e. it consists of positive peaks (gains). The blue side shows negative peaks (losses) and, at variance with SR, their intensity relative to the red side does not retain any information on temperature, as recently pointed out in ref. 20. Under resonance condition, the SRS response features a more complex behavior. The spec-tral profile of the red side Raman bands does not significantly change, albeit the intensity undergoes a resonance enhancement with a wavelength dependence very similar to SR excitation profile. Remarkably, the lineshapes of the blue side bands are totally different, evolving from positive gains to negative losses through dispersive profiles, upon scanning the RP wavelength across the resonance profile.

In Fig. 1 we report SRS spectra for a deoxy Myoglobin sample excited by a RP tuned in the Soret absorption region. The spectra are obtained using a 600 nJ Raman pulse and 50 nJ Probe pulse, both vertically polarised. A description of the experimental setup and data reduction is provided in Methods section, and further detailed in25,26 and27, respectively.

While the red side exhibits a resonance condition with small deviations from the maximum of the Soret band absorption (shown in the side panels of Fig. 1 colormaps)28, the maximum Raman gain of the blue side depends on the specific vibrational mode in a much peculiar way and peaks about one vibrational quantum higher in energy than the red side Raman spectrum. In particular, the higher is the frequency of the vibrational level, the lower is the energy of the Raman pulse photon needed to match the resonance. Furthermore, the SRS blue side response changes sign as the full resonant condition is achieved. Indeed, the signal is negative in off-resonant conditions and becomes positive when the Raman pulse is tuned into full resonant conditions, passing through dispersive features. Remarkably, the dependence of the lineshape on the RP wavelength is mode specific as elucidated in Fig. 1. Taking as an example the v4 Raman band (energy mode ≈ 1355 cm−1), a positive Lorentzian lineshape is observed upon tuning the RP at 465 nm; the transition to a weak negative band occurs by red-shifting or blue-shifting the RP of ≈ 20 nm relative to the full resonance condition at 465 nm. The v4 dispersive lineshape arising at RP intermediate

Figure 1. Stimulated Raman spectra of Myoglobin, Central panels: Colormaps of broadband Stimulated Raman spectra, showing the dependence on the Raman pulse wavelength. Signals are always positive in the red side of the spectrum, while in the blue side they show different profiles depending on the resonance condition. Arrows highlights the energies of two prominent vibrational modes (v7 and v4), relative to the ground state. Side panels: four-wave mixing energy level diagrams determining Broadband SRS contributes to red (left) and blue (right) sides of the v7 spectrum.



wavelengths is characterized by an odd-symmetry: while red-shifting the RP the positive lobe is at higher frequency, a blue-shift of the RP generates a negative lobe at higher frequency. A similar trend occurs for the v7 mode, taking into account a wavelength shift due to the mechanism elucidated in Fig. 1.

The third order polarization induced in the sample, responsible for the SRG signal, can be evaluated by a per-turbative expansion of the density matrix in powers of the electric fields29–31; due to the presence a narrowband Raman pulse and a femtosecond Probe pulse one needs to account for several possible field permutations, gener-ating different contributions to the total P(3). However, we found that our spectra can be reproduced by a single dominant four-wave mixing contribution for each side of the spectrum, as elucidated by the diagrams in Fig. 1. These diagrams depict the evolution of the density matrix describing the material during the interaction with the electromagnetic fields. On the red side, RP interacts with the medium and promotes first the bra side of the density matrix to the electronic excited state; then a downward interaction with the PP leads the bra in a vibrationally excited (n = 1) electronic ground state, inducing a vibrational coherence, which is then detected through a further interaction with the RP on the ket side of the density matrix and a final free induction decay. Here the convention to calculate only diagrams with the last interaction on the ket side of the density matrix is exploited to halve the computational effort; the remaining diagrams with the last interaction with the bra represent in time domain the complex conjugate of terms in Fig. 1. In the dominant blue side diagram (Fig. 1), the fields only interact with the ket side of the density matrix: the first interaction is with the PP, which promotes the ground state a ket to the electronic excited state b . Then the RP induces the vibrational coherence c a , which can be probed after a third interaction with RP and a final free induction decay. As clarified by the diagram, the blue side contribution does not involve a transition starting from a vibrational excited level, therefore the process does not correspond to an Antistokes transition as in Spontaneous Raman spectroscopy20.

Figure 2a,b show a magnification of the blue side SRS spectrum around the v7 and the v4 modes of Myoglobin for different Raman pulse wavelengths λR. Our analysis is reported for these two Myoglobin modes, since they are the most prominent and biochemically relevant (two highly symmetric stretching of the heme ring), but naturally extends to the entire SRS spectrum.

To understand the peculiar behavior of the blue side SRS spectra corresponding to those two modes, we modeled the data by evaluating in the frequency domain the nonlinear response function associated with the two diagrams in Fig. 1.

In Fig. 2c,d we report the calculated v7 and v4 SRS bands for the blue side spectra, as a function of the RP wave-length λR. The model function for the frequency (ω) dispersed SRS spectrum is

ω λ λω λω

( , ) = ( ) ⋅

( , )

( )

( )

( )

II AP

E 1R R

R

P

3

0

Figure 2. Wavelength dependence of the SRS blue spectra. Experimental broadband SRS data of the blue side broadband Stimulated Raman spectra for the v7 (a) and v4 (b) vibrational modes of Mb. The signal is negative in off-resonant conditions, turns positive by tuning the Raman pulse in full resonant condition, going through dispersive features in between. (c,d): signal reconstruction obtained from Eq. 1.



where ω( )EP0 indicates the PP in absence of RP and A(λR) is a positive adjustable parameter which accounts for

the effect of the Raman Excitation Profile. The polarizations P(3) (ω, λR) for each side of the spectrum are directly obtained from the diagrams in Fig. 1. Writing the Probe and the Raman pulses as ( ) = ( ) + . .ω

/ /− /E t t e c cP R P R

i tP R , we get

∫

∫

ω λ µ µω ω γ

ωω

ω ω ω γ

ωω ω ω ω ωω ω ω ω γ

( , ) =− −

( )+ − −

×( ) ( − + − )− − + + ( )

( )

−∞

∞

−∞

∞

⁎P

id

i

di

1

2

RED R ab bcbc bc

R

R ba ab

R P P

R ca ac

3 2 21

1

1

33 1 3

3

for the red side, and

∫

∫

ω λ µ µω ω γ

ωω

ω ω ω ω γ

ωω ω ω ω ωω ω ω ω γ

( , ) =− +

( )− − − +

×( ) ( + − + )− + − + ( )

( )

−∞

∞

−∞

∞

⁎

⁎

Pi

di

di

1

3

BLUE R ab bcba ba

R

R ca ca

R P P

ba ba

3 2 21

1

1

33 1 3

3 1

for the blue side. In Eqs. 2 and 3, μij is the dipole transition moment between the i and j states, ωij = ωi − ωj is the frequency difference between levels i and j, and γij is the vibrational dephasing rate of the i j induced coherence. Labels a, b and c indicate respectively the ground state, the excited electronic state and a generic vibrational excited state (on the electronic ground state). A derivation of Eqs. 2 and 3 is reported in section “Third order nonlinear polarization” of Supplementary Information. The Raman pulse ( )tR and the Raman probe ( )tP temporal enve-lopes are modeled as Gaussian profiles:

( ) = → ( ) = ( )σ σ ω− /( ) − /( )t e E t e e 4aR Rt

R Rt i t0 2 0 2R R R

2 2 2 2

( ) = → ( ) = ( )σ σ ω−( − ) /( ) −( − ) /( )t e E t e e 4bP Pt t

P Pt t i t0 2 0 2P R P P P

2 2 2 2

where tP is the time delay between the Raman pulse and the Raman probe. R0 , ωR and σR appearing in Eqs. 4a and

4b are calibrated using Cyclohexane SRS spectra and a detailed explanation is provided in Supplementary and in Fig. S2. Thanks to this procedure, only the parameters A(λR), ωba,γba, μba, μbc, ωca and γca of the Myoglobin are extrapolated by a global fit through Eqs. 1, 2 and 3.

To simplify the evaluation of Eqs. 2 and 3 and readily interpret the lineshapes of blue and red sides of the spectrum, we consider the simplified case of a monochromatic RP and a continuum (temporal delta function) PP, reducing Eqs. 2 and 3 to

ω λµ µ

ω ω γ ω ω γ ω ω ω γ( , ) =

( − − )( − − )( − + + ) ( )( )P

i i i 5RED Rab bc

bc bc R ba ab R ca ac

32 2

and

ω λµ µ

ω ω γ ω ω ω γ( , ) =

( − + ) ( − − + ) ( )( )P

i i 6BLUE Rab bc

ba ba R ca ca

32 2

2

A careful inspection of Eqs. 5 and 6 allows clarifying the effect of the resonance condition on the red and the blue sides. In the former case, the resonance condition arises for ωR = ωba, in analogy with SR. In the latter case, the res-onance condition depends on the energy of the vibrational mode ωca involved in the process, being ωR = ωba − ωca.

The increase or decrease of photon number in the probe pulse, corresponding to positive or negative Raman bands, is ruled by the sign of the imaginary part of the P(3) (ω), as shown by Eq. 1. In the red side, the imaginary part’s sign calculated through the diagram on the left of Fig. 1 does not depend on λR, and it is always positive. Hence the SRG lineshape is a peak for any Raman Pump wavelength. The most interesting case is represented by the blue side: in Eq. 6, as deepened in Supplementary Information, the electronic resonance gives a positive and a negative sign in full off-resonant and full resonant conditions, respectively. This result rationalizes the behavior of the blue side of the spectrum. As it is shown in Fig. 3 the SRS spectra are well reproduced by the model (Eq. 1) for all the Raman pulse wavelengths λR, using ωca = 1354 cm−1 and γca = 10 cm−1 for the v4 and ωca = 671 cm−1 and γca = 10.5 cm−1 for the v7 Raman mode. The parameters ωba, γba and A(λR) have been adjusted to best fit the experimental data, which enables the possibility to evaluate the blue side Stimulated Raman Excitation Profile (see Fig. 4) for all the Raman active modes, as:

λλ

ω ω ω γ( ) =

( )

+ − + ( )REP

Ai 7R

R

R ca ba ba2

ωba and γba model a simple Lorentzian absorption (see Eqs. 5 and 6), and possible deviations from this profile are accounted for by the real positive correction factor A(λR).

Moreover our results allow to understand why, under resonance condition, the blue side of the spectrum shows more intense Raman bands, providing better signal to noise ratio. In the red side, the highest Raman gain intensity



is achieved for a RP tuned to the maximum of the electronic absorption. Consequently, while traveling through the sample, RP experiences the maximum depletion due to absorption, and the effective intensity contributing to SRS generation is consequently reduced. Critically, in the blue side, the resonance condition is shifted out of the electronic absorption peak by an amount ωca. As a consequence, the larger is the energy of the vibrational mode the less is the absorption-induced depletion of the RP intensity in the sample. A higher effective intensity of the RP, contributing to P(3) processes, naturally generates more intense SRS signals. The scenario depicted above, is well illustrated in Fig. 5, which reports the experimentally determined SRS band intensities for vibrational modes of different frequency. For each mode the intensity is evaluated as the integral of the absolute value of SRS signal: by tuning the RP, we clearly observe an overall increase of the blue side resonance profile relative to the red side. Furthermore, the wavelength dependence of the blue side spectral intensities displays the already mentioned shift of the resonance condition with the RP wavelength, dependent on the specific vibrational frequency, to be

Figure 3. Wavelength dependence of the SRS blue side, Data and Model: Measured SRS lineshapes in the blue side of the Mb v7 (670 cm−1) and v4 (1355 cm−1) Raman modes, represented with dots. In full off-resonance condition (428 and 472 nm for the v7 mode and 438 or 487 nm for the v4) the signal is a weak loss, while in full resonance condition (i.e. 456 and 467 nm for v7 and v4 respectively) the signal turns into a much more intense gain. The transition between gain and loss proceeds through a “semi-resonant” condition, resulting in dispersive lineshapes. The straight lines represent the model profile obtained by Eq. 1.

Figure 4. Raman Excitation Profiles for v7 and v4 Raman modes. The resonance effects are taken into account in our model by two contributions: a Lorentzian absorption effect (black lines) and the A(λR) coefficient -see Eq. 1- (cyan lines). The resulting REPs are then obtained by the product of these effects and is represented by the blue lines for the v7 and v4 Raman modes.



contrasted with a substantial mode independent profile of the red side. A careful inspection of this latter profile, however, reveals an opposite small blueshift. The origin of this behavior is likely to be analogous of the REP which has been analytically evaluated and discussed in ref. 32.

ConclusionsWe reported broadband SRS spectra of Myoglobin, exploring the resonance enhancement across the Soret absorp-tion band. The SRS technique allows obtaining highly resolved vibrational spectra from 200 to 2000 cm−1, free from fluorescence background in both the red and the blue side of the spectrum. For the red side, a substantial equivalence between SRS and Spontaneous Raman Stokes side has been verified. In the blue side, dispersive and negative lineshapes have been observed. Positive peaks only arise when the resonance is exactly matched, and this condition critically depends on the frequency of the observed molecular vibration. Importantly, the application of SRS as a probe for femtosecond time-resolved studies (FSRS) requires a judicious account of such complex line-shapes, since further dispersive behaviour can originate in that case from the dynamics of the system. A quantum treatment of the sample through a density matrix formalism allows to identify the contributions of the third order P(3) polarization which generate Stimulated Raman bands, reproducing the experimental data.

The proposed approach has been applied to interpret the Myoglobin SRS spectra as an example, but has to be seen as a general procedure to extract Stimulated Raman Excitation Profiles from complex spectral lineshapes. The possibility to selectively enhance different Raman bands, combined with both vibrational and electronic sensitivity, identifies SRS as a formidable tool to investigate Frank-Condon effects and to extract quantitative informations about vibrational mode displacement and vibronic coupling.

The larger cross section under resonance conditions suggests that the blue side Stimulated Raman spectra may be a better candidate to exploit Raman signal, provided that the Raman wavelength lineshape dependence of the spectra is taken into account.

MethodsSample Preparation. Horse heart Myoglobine was purchased from Sigma Aldrich. The commercial protein is in the Fe(III) oxidation state (generally called “ferric form”) which is the form stable in contact with air. The freeze-dried protein was dissolved in pH 7.4 buffer and the obtained solution was purified into a biochemical basket centrifuge.

The final 300 μM Myoglobine solution was prepared anaerobically in a transmission cell under a pure nitrogen atmosphere to prevent the binding between the heme and the atmospheric oxygen, using previously degassed 100 mM pH 7.4 phosfate buffer. A sodium dithionite solution is added to reduce the heme group to the Fe(II) oxidation state (“ferrous form”).

The sample is allowed to flow anaerobically through the transmission cell during the experiment due to a peristaltic pump, so as to guarantee fresh sample at every laser shot (1 KHz). All Raman measurements were performed at room temperaure.

Experimental setup. A Ti:sapphire laser generates 3.6 mJ, 35 fs pulses at 800 nm and 1 kHz repetition rate. The Raman pulses are synthesized from a two-stage OPA that produces tunable IR-visible pulses, followed by a spectral compression stage based on frequency doubling in a 25 mm Beta Barium Borate (BBO) crystal33. Vertically polarized

Figure 5. Wavelength intensity SRS spectra dependence: Comparison of spectral intensities in the red side (red lines) and in the blue side (blue lines), for 4 different Raman modes at 365, 670, 1355 and 1610 cm−1, evaluated as the integral of the absolute value of the SRS signal of each mode.



pulses with 10 cm−1 bandwidths and 600 nJ intensities are obtained. The femtosecond probe is a vertically polarized white-light continuum (WLC) generated by focusing the laser fundamental into a Sapphire crystal. The Raman fea-tures arise on top of the transmitted WLC, which is frequency dispersed by a spectrometer onto a CCD device. A synchronized chopper blocks alternating RP pulses in order to obtain the Raman gain using successive probe pulses. Indicating the PP spectrum with and without the presence of the RP as EP and ( )EP

0 , the Raman Gain is obtained as

( )

E

E

P

P

2

0 2.

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Author ContributionsT.S., G.B. and E.P. conceived the study. The experiments were performed by E.P., assisted by G.G., G.B. and C.F. G.B., C.F. and G.F. performed the data analysis and developed the model. T.S. directed the research, and wrote the manuscript with G.B. All authors discussed the results and implications, and commented on the manuscript.

Additional InformationSupplementary information accompanies this paper at http://www.nature.com/srep



Competing financial interests: The authors declare no competing financial interests.How to cite this article: Batignani, G. et al. Electronic resonances in broadband stimulated Raman spectroscopy. Sci. Rep. 6, 18445; doi: 10.1038/srep18445 (2016).

This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License. The images or other third party material in this article are included in the article’s Creative Commons license,

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