Assorbimento transiente in mioglobina...

Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali

Corso di Laurea in Fisica

Assorbimento transiente in

mioglobina fotolizzata

Relatore:

Dott. Tullio Scopigno

Dissertazione di Laurea Triennale di:

Fabrizio Pittorino

Anno Accademico 2010-2011

Indice

1 Introduzione 2

1.1 Lo schema pump e probe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 La teoria dell'assorbimento transiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Generalità sulla mioglobina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2 Foto�sica della mioglobina 8

2.1 L'ipotesi parallela . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2 L'ipotesi sequenziale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3 Apparato sperimentale 12

3.1 Schema e caratteristiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

3.2 Preparazione del campione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.3 Metodologia raccolta dati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4 Analisi dati 16

4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.2 Un possibile modello per l'ipotesi sequenziale . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti . . . . . . . . . . . . 21

4.3.1 La proteina non legata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

4.3.2 La proteina legata con il monossido di carbonio (CO) . . . . . . . . . 26

4.4 Analisi globale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.4.1 Singular Value Decomposition (SVD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.4.2 Global �t . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

4.5 Cooling vibrazionale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

4.5.1 Spostamento dei picchi dello spettro di assorbimento transiente della

proteina non legata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38


proteina legata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5 Conclusione 40

1 INTRODUZIONE

1 Introduzione

1.1 Lo schema pump e probe

Sviluppare tecniche in grado di indagare la materia su scale temporali estremamente brevi

è stato uno degli obbiettivi della spettroscopia ottica negli ultimi anni. Lo sviluppo di laser

che emettono impulsi al femtosecondo ha reso possibile studiare processi chimici e biologici

che avvengono su scale temporali inferiori al picosecondo. Per indagare questi fenomeni

ultraveloci si utilizza la tecnica di misura pump-probe. In questa tecnica, un impulso corto

(un valore tipico è ∼ 50fs) nel visibile, la cui funzione è la fotodissociazione o una qualche

trasformazione del campione, è combinato con un secondo impulso che - in linea di principio -

non perturba il sistema ed è utile allo studio delle proprietà di interesse, come l'assorbimento

visibile o infrarosso, in funzione del ritardo temporale - regolabile - tra i due impulsi. Si

ottengono così informazioni sul processo innescato dal pump con una risoluzione temporale

limitata principalmente dalla durata degli impulsi (rimane la di�coltà tecnica di generare

impulsi laser ultrabrevi nel MIR e nel FIR).

Gli esperimenti di pump and probe permettono di ottenere informazioni sulla dinamica di

rilassamento degli stati eccitati e sulle proprietà di assorbimento degli stessi. E' di particolare

interesse, in un campo di studi interdisciplinare che unisce �sica, chimica e biologia, lo studio

delle modi�cazioni di strutture molecolari durante reazioni (ultra)veloci. Le informazioni si

possono inferire attraverso queste tecniche di spettroscopia ottica in cui l'assorbimento gioca

un ruolo importante data la sensibilità ai cambiamenti strutturali. Tecniche più avanzate,

che permettono di indagare scale temporali ancora più brevi, fanno uso della spettroscopia

Raman e non verranno trattate in questa dissertazione.

1.2 La teoria dell'assorbimento transiente

L'esperimento è realizzato focalizzando un fascio di pump e un fascio di probe sul campione,

misurando l'intensità del segnale di probe in presenza del pump (Ip(τ)) e in sua assenza

(Ip(−∞)), in funzione del ritardo temporale tra questi ultimi.

∆Ip(τ) =IP (τ)− IP (−∞)

Ip(−∞)

Per descrivere le osservabili �siche misurate sperimentalmente consideriamo un esempio

semplice:

Consideriamo un sistema descritto da un sistema a due livelli: stato fondamentale (g) e

stato eccitato (e). Lo stato eccitato può essere un qualunque livello elettronico, vibrazionale

o vibronico del sistema [1].

Si utilizzano, per il momento, pump e probe monocromatici di stessa frequenza.

In assenza del pump tutte le molecole si trovano nello stato fondamentale g, e vale:

dIp(−∞)

dz= −Nσeg(ωp)Ip(−∞)

2

1.2 La teoria dell'assorbimento transiente 1 INTRODUZIONE

da cui

Ip(−∞) = I0pexp(−Nσeg(ωp)d)

Dove N è il numero di molecole per unità di volume, d è il cammino ottico dell'impulso

di probe nel campione e σeg(ωp) è il coe�ciente di assorbimento per la transizione g → e,

che dipende dalla frequenza del probe ωp.

Quando si applica il pump, si genera un popolazione non nulla nello stato eccitato e

l'intensità del probe dipenderà da quante molecole sono rimaste nello stato fondamentale

e sono quindi ancora in grado di assorbire, e da quelle che assorbono nello stato eccitato.

L'intensità del probe sarà maggiore, in questo caso particolare, rispetto a quella che si ha

in assenza del pump. All'aumentare del ritardo τ il numero di molecole che si trovano nello

stato eccitato diminuisce - decadono verso lo stato fondamentale - e di conseguenza varierà

anche l'intensità del probe.

dIp(τ)

dz= −ng(τ)σeg(ωp)Ip(−∞) = [−N + ne(τ)]σeg(ωp)Ip(−∞)

N = ng(τ) + ne(τ)

Ip(τ) = I0pexp(−Nσeg(ωp)d+ ne(τ)σeg(ωp)d)

Sostituendo le espressioni ottenute per Ip(τ) e Ip(−∞) in ∆Ip(τ) :

∆Ip(τ) =Ip(τ)− Ip(−∞)

Ip(−∞)= exp(ne(τ)σeg(ωp)d)− 1

Se abbiamo ∆Ip(τ)� 1, espandendo in serie di Taylor al primo ordine:

∆Ip(τ) ≈ ne(τ)σeg(ωp)d

Dunque dallo spettro di assorbimento transiente possiamo studiare la dinamica di rilas-

samento della popolazione generata dal pump nello stato eccitato e.

Per descrivere l'evoluzione temporale si utilizza spesso un modello fenomenologico che

assegna ad ogni stato eccitato un tempo di vita medio cui contribuiscono tutti i processi,

radiativi e non, attraverso cui può avvenire la diseccitazione da tale stato verso lo stato

fondamentale.

Nel caso del sistema a due livelli, le molecole che si trovano nello stato eccitato e possono

decadere solo verso lo stato g. Se attribuiamo a tale stato un tempo di vita medio τe allora

l'evoluzione della popolazione nello stato e viene descritta dalla seguente reazione cinetica:

dne(t)

dt= +

σeg(ωL)IL(t)

~ωL(N − ne(t))−

σeg(ωL)IL(t)

~ωLne(t)−

ne(t)

τe

Dove i termini a secondo membro descrivono rispettivamente l'assorbimento, l'emissione

stimolata e l'emissione spontanea.

3

1.2 La teoria dell'assorbimento transiente 1 INTRODUZIONE

Se la popolazione generata nello stato eccitato è piccola rispetto a quella totale (in

accordo con l'approssimazione precedentemente fatta) allora:

dne(t)

dt≈ +

σeg(ωL)IL(t)

~ωLN − ne(t)

τe

Risolvendo l'equazione di�erenziale si ha:

ne(t) =

ˆ t

−∞dt′exp[

t− t′

τe]Nσeg(ωL)IL(t

′)

~ωL

Se la durata dell'impulso è breve rispetto al tempo di vita τe, si può descrivere l'impulso

come una delta di Dirac

IL(t′) = FLδ(t0) FL =

ˆ ∞−∞

I(t)dt

ne(t− t0) = θ(t− t0)exp[− t− t0τe

]Nσeg(ωL)FL

~ωL

E poiché t − t0 = τ e ne(0) =Nσeg(ωL)FL

~ωL , la popolazione generata dal pump nello

stato e al tempo τ è:

ne(τ) = ne(0)exp[− ττe

]

La popolazione presenta un decadimento esponenziale nel tempo, la cui costante di deca-

dimento è il tempo di vita τe. Quest'ultimo può essere visualizzato misurando la variazione

d'intensità del probe in presenza e assenza del pump.

∆Ip(τ) = (ne(0)σeg(ωp)d)exp[− ττe

]

Solitamente si usa la di�erenza di assorbanza, de�nita come il logaritmo dell'intensità.

Ricordando l'ipotesi fatta, ∆Ip � 1, segue ∆Ip(τ) = IP (τ)−IP (−∞)Ip(−∞) = IP (τ)

Ip(−∞) − 1.

Da questo

IP (τ)

Ip(−∞)= ∆Ip(τ) + 1 = (ne(0)σeg(ωp)d)exp[− τ

τe] + 1

e dunque

∆A = ln(IP (τ)

Ip(−∞)) = ln((ne(0)σeg(ωp)d)exp[− τ

τe] + 1) ≈ (ne(0)σeg(ωp)d)exp[− τ

τe]

al primo ordine nello sviluppo di Taylor.

Variando ωp è possibile sondare l'e�etto del cambio di popolazione (cioè la cinetica) sia

nello stato fondamentale sia nello stato eccitato.

Quando si misura ∆A(τ, ωp) si ottiene una matrice di dati che può essere visualizzata in

funzione delle due variabili tempo e lunghezza d'onda, come mostrato nelle �gure 1.1 e 1.2.

4

1.3 Generalità sulla mioglobina 1 INTRODUZIONE

Figura 1.1: ∆A in funzione della frequenza ωp per un determinato tempo τ : Spettro diassorbimento transiente

Figura 1.2: ∆A in funzione del tempo τ per determinati valori di frequenza ωp : Curve didecadimento o crescita

Fino ad ora il sistema è stato descritto con un semplice schema di due livelli. In genere,

nei sistemi molecolari, il numero di livelli da considerare per descrivere il rilassamento della

popolazione inizialmente creata dal pump è superiore a due.

L'evoluzione temporale viene descritta in questo caso non da una singola equazione dif-

ferenziale cinetica, ma da una serie di queste, che descrivono l'evoluzione temporale di tutte

le popolazioni che si formano nei livelli elettronici presenti nel sistema a seguito dell'ecci-

tazione iniziale. Se la serie di equazioni di�erenziali è abbastanza semplice si può risolvere

analiticamente, altrimenti bisogna ricorrere alla simulazione numerica.

1.3 Generalità sulla mioglobina

La mioglobina è una proteina globulare appartenente al gruppo delle emoproteine (pro-

teine contenti l'eme) la cui funzione è quella di legare reversibilmente l'ossigeno [2]. La sua

funzione �siologica è quella di trasportatore intracellulare di ossigeno nelle �brocellule mu-

scolari. La sua struttura è simile a quella dell'emoglobina ma ha un'a�nità per l'ossigeno

sei volte superiore. La mioglobina è costituita da una singola catena polipeptidica avvolta

su sé stessa, da ciò deriva il fatto che è capace di legare una sola molecola di ossigeno per

volta. La singola catena peptidica della mioglobina contiene l'eme. L'eme è un complesso

chimico composto da un atomo di ferro coordinato con i 4 atomi di azoto di una por�rina (da

5


πoρφ,υρα, porpora). L'eme conferisce la colorazione rossa ai muscoli in quanto la di�erenza

di energia tra due orbitali molecolari è nel range del visibile, tra 500 e 600 nanometri, e

la radiazione attorno a 690 nm, cioè nel rosso, non viene assorbita. Il Fe può formare due

legami, uno su ciascuna delle due facce del piano dell'eme e che formano il V e VI sito di

coordinazione. Nella mioglobina il V sito di coordinazione è occupato da un'istidina (un

amminoacido). Il VI sito di coordinazione può essere occupato da un ligando esterno, in

particolare l'ossigeno molecolare O2, il monossido di carbonio CO o il monossido di azo-

to NO. Nella deossimioglobina (mioglobina deoxy), il sesto sito di coordinazione è vuoto e

perciò è disponibile per il legame con l'ossigeno.

La �gura (1.3) mostra la struttura generale dell'eme. L'eccitazione ottica dell'eme 6-

coordinato porta, come vedremo in dettaglio, a popolazioni di stati eccitati di vita intrin-

secamente corta. Questi hanno carattere anti-legante e possono portare alla dissociazione

del legame Fe-ligando in qualche decina di femtosecondi. La dissociazione porta l'eme ad

assumere una struttura �a cupola� in 1ps [3].

Figura 1.3: Struttura generale dell'eme (A) e del legame del Fe con i ligandi (la quintaposizione è occupata dall'istidina) (B). A destra, rappresentazione 3d dell'eme (in rosso)legato con CO (in verde) e istidina (in blu) all'interno della matrice dell'emoproteina.

Figura 1.4: Rappresentazione dell'eme non legato (a sinistra) e legato con il CO (a destra).Si noti la diversa posizione rispetto al piano delle eme dell'atomo di ferro (in giallo). Nellaproteina non legata, infatti, l'atomo di ferro, a causa del legame con l'istidina, si trovaleggermente sotto il piano dell'eme (conformazione �domed�, a cupola), mentre nella proteinalegata, il legame con il monossido di carbonio (CO) compensa questo e�etto.

6


I processi funzionali in molte emoproteine coinvolgono il legame con i ligandi e il rilascio

o lo scambio di ligandi interni o esterni. La dissociazione �siologica del legame Fe-ligando

avviene tramite attivazione termica; la propagazione di cambiamenti funzionali può avvenire

in competizione con la riformazione del legame dell'eme con il ligando. La probabilità di

questo evento dipende dal ligando e in particolare è determinata dalla struttura e dalla

dinamica della proteina.

La rottura termica dei legami eme-ligando, o l'arrivo di ligandi esterni nella matrice

della proteina, non possono essere sincronizzati sulla scala temporale del sub-picosecondo.

I metodi sperimentali si basano sul fatto che il legame Fe-ligando può essere dissociato,

con alto rendimento, usando fotoni in risonanza con le transizioni elettroniche dell'eme. La

fotodissociazione non è un evento �siologico, ma può essere usato per riprodurre la disso-

ciazione termica funzionale e la dissociazione dei ligandi che non sono �siologici (è il caso

del CO nella mioglobina), le dinamiche dei quali sono usate per studiare il comportamento

dell'eme. Si usano dunque tecniche di assorbimento pump-probe, in cui un impulso corto

(tipicamente ∼50 fs) nel visibile provoca la fotodissociazione, ed è combinato con un secon-

do impulso elettromagnetico che serve a studiare proprietà quali l'assorbimento, visibile o

infrarosso [3]. A questo scopo generalmente si fotolizza la proteina in corrispondenza delle

bande di assorbimento elettronico nella regione tra i 500 nm e i 600 nm, dette bande Q,

e si studiano i modi vibrazionali associati alla banda di assorbimento Soret, il cui picco si

trova tipicamente nel range 350=450 nm. Questi modi danno informazioni sullo stato di

coordinazione del ferro e sui legami dei ligandi [4].

Figura 1.5: Spettri di assorbimento per le forme legata (MbCO) e non legata (deoxy) dellamioglobina

Studieremo le dinamiche dell'eme, del ligando e della proteina, così come la loro intera-

zione, sulla scala temporale del femtosecondo e del picosecondo. Questa scala temporale è

rilevante per i cambiamenti strutturali che avvengono nella stretta vicinanza dell'eme. Pro-

blemi ancora aperti alla ricerca scienti�ca sono il �doming� dell'eme, cioè i meccanismi di

formazione della struttura �a cupola� dell'eme in seguito alla fotodissociazione, e le cause e

le dinamiche dei cambiamenti strutturali indotti dalla diversa coordinazione dell'eme con i

ligandi.

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2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA

2 Foto�sica della mioglobina

2.1 L'ipotesi parallela

Una possibile ipotesi sulla cinetica della mioglobina in seguito alla fotodissociazione è stata

data da J.L. Martin e si basa su spettri di assorbimento transiente dell'emoglobina e della

mioglobina non legate e legate con CO, O2 o NO, studiati al �ne di dare una descrizione

della foto�sica delle emoproteine che comprenda la loro fotodissociazione, l'origine e il destino

degli stati transienti a vita breve osservati, e l'apparizione delle emoproteine non legate nello

stato fondamentale [5].

L'interpretazione che segue ai dati sperimentali è l'apparizione simultanea, conseguente

alla fotodissociazione del ligando, che ha luogo in meno di 50 fs (risoluzione temporale

dell'apparato sperimentale usato), di due specie distinte. Queste due specie sono assegnate

a stati eccitati dell'eme non legato, chiamati Hb∗I e Hb∗II . (I risultati presentati sono relativi

all'emoglobina, ma sono qualitativamente applicabili alle emoproteine con la stessa struttura

dell'eme, come appunto la mioglobina).

Hb∗I decade in 300 fs allo stato fondamentale non legato. La popolazione diHb∗II varia

con il ligando, ed è più signi�cativa quando il ligando è O2 o NO piuttosto che quando è CO.

Si suggerisce anche che la fotodissociazione sia totale, a prescindere dalla natura del ligando.

La bassa resa fotodissociativa per quel che riguarda i complessi eme-NO ed eme-O2, come

si misura sulla scala del millisecondo, è dunque in questo attribuibile a una veloce (2.5 ps)

ricombinazione di O2 o NO con Hb∗II .

La dinamica di assorbimento del Soret dell'emoproteina legata può essere descritto da

un processo di rilassamento con una costante di tempo di 2.5-3.2 ps e da un processo più

lungo, attribuito alla ricombinazione geminata, che va da 10 ps approssimativamente nei

componenti eme-NO �no ad arrivare alla scala dei nanosecondi nei composti eme-CO. In

questo processo di rilassamento è visibile anche una componente a 300 fs, attribuibile all'ap-

parizione di un'altra specie che è creata dopo la fotodissociazione del ligando e che ha un

assorbimento non trascurabile nella regione della banda di Soret della specie legata: l'eme

non legato nello stato fondamentale.

La componente a 2.5-3.2 ps è comune a tutti i composti, legati e non legati. Il suo peso

relativo, tuttavia, è sensibile al ligando. In particolare, questa componente comprende il

65-75% del decadimento del transiente nei composti con O2 e NO. Nei composti eme-CO

questa componente è inibita: il suo peso è stimato minore con un rapporto di 15 rispetto alla

componente veloce.

L'assorbimento a ∼ 480 nm appare istantaneamente ed è ben descritto da un decadi-

mento a singolo esponenziale caratterizzato da una costante di tempo di 300 fs. E' questa

specie che assorbe a 480 nm che è attribuita al precursore dello stato fondamentale della

specie non legata (Hb∗I). Analogamente, l'assorbimento a 460 nm appare istantaneamente,

ma il suo decadimento è dominato da un processo caratterizzato da una costante di tempo

di 2.5 ps. Questa specie è attribuibile a Hb∗II .

La presenza dei decadimenti di assorbimento a 300 fs e 2.5-3.2 ps in tutti gli eme-composti

investigati, inclusi i composti non legati, è essenziale per l'identi�cazione di questi processi

come stati eccitati dell'eme non legato.

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2.1 L'ipotesi parallela 2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA

Riassumendo, l'apparizione istantanea di specie che hanno il massimo dell'assorbimento

alla stessa lunghezza d'onda sia nelle proteine legate sia in quelle non legate suggerisce che

queste due specie siano stati eccitati dell'eme non legato. Poiché la specie corrispondente

all'emoproteina non legata appare con una costante di tempo di 300 fs, Hb∗I , che decade

con la stessa costante di tempo, è considerato il precursore della specie non legata, mentre

il fatto che l'assorbimento della banda di Soret non legata comprenda una componente a

2.5-3.2 ps è interpretabile con il fatto che Hb∗II sia uno stato eccitato la cui formazione è

competitiva con la fotodissociazione del ligando come misurato sulla scala del microsecondo.

E' suggerito che la resa fotodissociativa sia 1 in tutti gli eme-composti e che Hb∗II abbia

una reattività nei confronti del ligando maggiore di quella di Hb∗I . Poiché nei composti

eme-CO la popolazione di Hb∗II è piccola, si osserva un'alta resa fotodissociativa su scale di

tempo maggiori di 10ps dopo la fotodissociazione del ligando. Inversamente, nei composti

eme-NO ed eme-O2, in cui la popolazione di Hb∗II è maggiore, la resa fotodissociativa è

considerevolmente più bassa. Un fattore addizionale che contribuisce al valore estremamente

basso del fattore di fotodissociazione nei composti eme-NO è la fase rapida (∼ 10 ps) della

ricombinazione geminata.

Non c'è ancora accordo nella comunità scienti�ca, un possibile schema proposto [5], che

può riassumere la foto-cinetica tra i vari stati descritta in precedenza, è mostrato in �gura

(4.2).

Figura 2.1: Spettri di assorbimento generalizzato delle emoproteine e dei loro fotoprodotti.

Le relazioni tra le specie sono illustrate in �gura (2.1) e descritte in più dettaglio nel testo.

X denota il ligando che può essere O2, CO e NO. Le specie corrispondenti a stati eccitati della

proteina non legata, Hb∗I e Hb∗II , sono formate in meno di 50 fs dalla fotodissociazione di

HbX, ma la quantità diHb∗I eHb∗II dipende da X. τI è la costante di tempo per la formazione

della specie deoxy da Hb∗I . τII è la costante di tempo per il decadimento di Hb∗II allo stato

fondamentale. τG è la costante di tempo della ricombinazione geminata e dipende sia dal

ligando sia dall'emoproteina. Il diagramma è applicato al caso speci�co dell'emoglobina,

ma è applicabile in generale alla dinamica delle emoproteine come modello. Ovviamente la

forma e la posizione degli spettri sono invece applicabili esclusivamente all'emoglobina.

9

2.2 L'ipotesi sequenziale 2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA

2.2 L'ipotesi sequenziale

Studi successivi [6, 7] della foto�sica dell'eme delle emoproteine, basati sempre su spettri

di assorbimento transiente, forniscono una nuova interpretazione. L'ipotesi è un percorso

di rilassamento comune a entrambe le forme di Hb∗ (che qui rappresenta l'eme fotolizza-

to), legata e non legata, in cui lo stato eccitato 1Q (cioè lo stato eccitato dell'eme legato

immediatamente precedente alla fotolisi) decade sequenzialmente nello stato fondamentale:1Q → Hb∗I → Hb∗II → Hb. L'osservazione delle cinetiche conferma i tempi caratteristici

della vita di questi stati come <50fs, ∼ 300fs, ∼ 3ps per 1Q, Hb∗I , e Hb∗II rispettiva-

mente. Questo indica che la formazione di Hb∗II non è istantanea. In questo modello, la

componente a ∼ 3−4ps sarebbe dovuta all'eme eccitato che può anche essere caldo. Un altro

decadimento sequenziale che spiega i dati sperimentali è 1Q → Hb∗I → Hb, dove Hb è lo

stato fondamentale vibrazionalmente caldo. In questo caso il ritorno allo stato fondamentale

dell'eme avviene con una costante di tempo di 300fs, dovuta al decadimento del Hb∗I .

Lo spettro di assorbimento transiente di Hb∗I appare sulla stessa scala di tempo della

fotolisi per HbCO e per HbNO, e l'intensità e la frequenza di Hb∗I nella deoxy è la stessa

di quella osservata nei composti HbCO e HbNO fotolizzati. Anche se con una di�erenza

in intensità, le somiglianze nell'assorbimento transiente della specie Hb∗II in HbCO e in Hb

indicano che il decadimento foto�sico segue in entrambi i casi lo stesso percorso, e che le

specie elettroniche eccitate Hb∗I e Hb∗II sono le stesse nel caso della proteina legata e non

legata.

L'ipotesi precedente per la quantità di Hb∗II seguente alla fotolisi era legata all'osser-

vazione di di�erenti rendimenti nella fotodissociazione del ligando. Questa ipotesi era ba-

sata su di una connessione empirica tra l'intensità nell'assorbimento della specie transiente

Hb∗II e l'intensità della fase rapida della cinetica di ricombinazione del ligando. Tuttavia lo

stretching-mode del legame Fe-CO non riprende sulla scala di tempo dei ∼ 3ps, evidenziando

che su questa scala il CO non si ricombina [6]. Le di�erenze nella ricombinazione del ligando

per ligandi diversi sono dunque da attribuire ad altre cause.

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2.2 L'ipotesi sequenziale 2 FOTOFISICA DELLA MIOGLOBINA

Figura 2.2: Schema cinetico della foto�sica dell'eme. La fotoeccitazione allo stato 1Q èindicata con la linea serpeggiante. La fotolisi avviene sulla scala di tempo del rapido deca-dimento dello stato 1Q allo stato Hb∗I . Il decadimento da Hb∗I allo stato fondamentale puòavvenire direttamente (linea tratteggiata) o passando per lo stato Hb∗II (linea continua).k10, k12, k20 sono le frequenze relative alle transizioni rappresentate schematicamente in�gura.

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3 APPARATO SPERIMENTALE

3 Apparato sperimentale

3.1 Schema e caratteristiche

In questo paragrafo descriveremo l'apparato utilizzato per e�ettuare le misure di assor-

bimento transiente ultraveloce.

Figura 3.1: Set-up dell'esperimento di assorbimento transiente

La sorgente utilizzata è un sistema laser costituito da un oscillatore a titanio za�ro

(Ti:Sa) e un ampli�catore rigenerativo che emette impulsi di lunghezza d'onda di ∼ 800nm

di larghezza di banda di ∼ 30nm e rate di ripetizione di 1KHz.

L'OPA (Optical Parametric Ampli�er) permette la generazione di lunghezze d'onda al

di fuori della banda del laser tramite processi non lineari in cristalli, accompagnandolo con

un impulso di più bassa frequenza i cui fotoni sono in parte convertiti in fotoni (a più bassa

energia) del segnale. Tramite l'OPA si genera la pompa attinica a ∼547nm, utile alla fotolisi.

Il fascio in uscita dal laser viene diviso in due fasci al �ne di creare il fascio di pump e

il fascio di probe. Il fascio a 800 nm viene focalizzato su una �nestra di CaF 2, in costante

movimento per non permettere al fascio di incidere sempre sulla stessa porzione di cristallo,

cosa che lo daneggerebbe. Questo ovviamente richiede, per una misura soddisfacente, una

buona omogeneità del cristallo. Attraverso processi di dispersione non lineare si ottiene una

luce con impulsi di durata ∼ 40fs e frequenza in una �nestra di 400-700 nm.

L'intensità del probe viene misurata in funzione del ritardo temporale tra questo e il pump

imposto dalla Delay Line (DL). Per quel che riguarda quest'ultima, 30µm di separazione

spaziale tra i due impulsi equivalgono ad un ritardo temporale di 100 fs.

La risoluzione temporale è data dall'autocorrelazionedegli impulsi di pump e probe ed è

quindi dell'ordine di ∼ 40fs.

12

3.2 Preparazione del campione 3 APPARATO SPERIMENTALE

La pompa attinica ha frequenza tale da stimolare il processo fotochimico d'interesse.

Generando λpump = 547nm, si è in risonanza con la Q-band il che permette percentuali di

fotolisi del ∼ 10% utilizzando energia di pump Epump = 1µJ . L'impulso ultrabreve di luce

bianca e la pompa attinica vengono sovrapposti spazialmente sul campione.

Per risolvere le frequenze dello spettro di assorbimento transiente si fa uso di un mo-

nocromatore. Nello strumento la luce policromatica entra da una fenditura e tramite un

sistema ottico viene inviata su un reticolo di di�razione che disperde il fascio scomponen-

dolo nelle sue componenti spettrali. Il rivelatore è costituito da una camera CCD (Charged

Coupled Device) che permette di misurare tutto lo spettro visibile. La CCD consiste in un

circuito integrato formato da una griglia di elementi semiconduttori in grado di accumulare

una carica elettrica proporzionale all'intensità della radiazione elettromagnetica che li colpi-

sce. Questi elementi sono accoppiati in modo che ognuno di essi, sollecitato da un impulso

elettrico, possa trasferire la propria carica ad un altro elemento adiacente. Inviando al di-

spositivo una sequenza temporizzata d'impulsi, si ottiene in uscita un segnale elettrico grazie

al quale è possibile ricostruire la matrice dei pixel che compongono l'immagine proiettata

sulla super�cie della CCD stessa.

Il chopper, la cui frequenza di rotazione è stimata attorno ai 500Hz, assicura l'arrivo a

intermittenza del fascio di pump sul campione, permettendo la collezione di impulsi di probe

temporalmente adiacenti in presenza e in assenza di fotolisi.

3.2 Preparazione del campione

Il campione a nostra disposizione è una soluzione acquosa di mioglobina equina in forma

ferrica, previamente centrifugata. La mioglobina ferrica viene �ussata con azoto allo stato

gassoso per eliminare ogni traccia di ossigeno presente nel campione. La mioglobina è

conservata nello stato ferrico, in cui l'atomo di ferro è nel suo stato di ossidazione più

alto, Fe3+. In questo stato, la mioglobina è legata con una molecola di H2O presente in

soluzione. A�nché il ligando possa legarsi (reversibilmente) alla mioglobina, è necessario che

il Fe del gruppo eme si trovi nello stato di ossidazione +2, detto stato ferroso. Si aggiunge

quindi in soluzione un agente riducente, il ditionito di sodio (un sale), che serve a passare

dalla mioglobina nello stato ferrico alla mioglobina allo stato deoxy, cioè non legata e pronta

al legame con il ligando, con numero di ossidazione +2, secondo la reazione di riduzione:

Mb− (Fe3+ −H2O)Na2S204−→ Mb− Fe2+

Ecco spiegata la funzione del �usso di azoto: la mioglobina deoxy è fortemente reattiva

nei confronti dell'ossigeno, ma non si lega con l'azoto. Grazie al �usso di azoto siamo quindi

in grado di ottenere una soluzione di mioglobina non legata tramite la riduzione con il

ditionito di sodio.

In�ne, la mioglobina CO è preparata a partire dalla deoxy, ponendo in una soluzione di

quest'ultima un �usso di CO allo stato gassoso, secondo la reazione

Mb− Fe2+ + CO −→Mb− (Fe2+ − CO)

13

3.3 Metodologia raccolta dati 3 APPARATO SPERIMENTALE

Una pompa meccanica muove il campione all'interno della cella alla velocità di ∼ 10cm/s

per assicurare che la fotolisi realizzata dal pump sia e�ettuata su di un campione fresco (cioè

non fotolizzato) ad ogni presa dati. La pompa a nostra disposizione è una pompa peristaltica,

tale che non ci sia interazione diretta tra la pompa e il campione: un disco con delle palette

metalliche comprime il tubo nel quale è contenuto il campione, per pomparlo verso la cella

su cui incidono i fasci.

L'esperimento è condotto a temperatura ambiente.

3.3 Metodologia raccolta dati

Il fascio di pump passa attraverso un chopper tarato a frequenza di 500Hz, che fa passare

il fascio di pump alternato rispetto al probe, per misurare ION , relativo all'intensità del probe

in presenza di pompa attinica, e IOFF , intensità del probe in assesenza di pompa attinica.

A ogni pasaggio del fascio di pump attraverso il chopper viene calcolato il rapporto IONIOFF

su

due valori temporalmente adiacenti. E' questo infatti il risultato �nale delle nostre misure,

dato che vogliamo misurare la di�erenza di assorbanza del probe in assenza e in presenza

del pump. La quantità di interesse è la di�erenza tra le assorbanze in presenza e in assenza

di pump:

∆A = AON −AOFF = ln(IONI0

)− ln(IOFFI0

) = ln(IONI0· I0IOFF

) = ln(IONIOFF

)

E' bene notare che non è necessario misurare I0, valore dell'intensità del probe in assenza

della cella.

Ad ogni passo (regolabile) della Delay Line - che corrisponde ad un certo ritardo τ tra

fascio di pump e fascio di probe - si acquisisce dunque un numero N - tipicamente dell'ordine

di 500 - di valori di ION , IOFF e del loro rapporto ad ogni lunghezza d'onda su un range

che va da ∼ 300nm a ∼ 700nm. I valori di IONIOFF

riportato nei dati sono, ad ogni lunghezza

d'onda e ad ogni tempo, la media dei rapporti IONIOFF

sulle 5000 acquisizioni, piuttosto che il

rapporto delle medie di ION e IOFF eseguite. Nel secondo caso, un valore di ION o IOFF

che si discosti dalla media pesa meno nel valore �nale di IONIOFF

.

Infatti, assumendo che l'errore di misura sia lo stesso per tutte le acquisizioni:

σ(1

N

∑ IONIOFF

) =1

N

√√√√ N∑i=1

[1

I2OFFiσ2IONi

+ (IONiI2OFFi

)2σ2IOFFi

]

σ(

∑ION/N∑IOFF /N

) =

√√√√ N∑j=1

[1

(∑Ni=1 IOFFi)

2σ2IONj

+ (

N∑i=1

IONi)2

1

(∑Ni=1 IOFFi)

4σ2IOFFj

]

Come si può vedere, nella propagazione degli errori nel secondo caso i pesi corrispondono

alle medie dei valori su tutti le acquisizioni, mentre nel primo caso sono i valori stessi. Un

singolo valore che si discosti dalla media peserà dunque in maniera più incisiva nel primo

14

3.3 Metodologia raccolta dati 3 APPARATO SPERIMENTALE

metodo di calcolo della di�erenza delle assorbanze. Si è scelto quest'ultimo per il seguente

motivo: assumendo che le misure non si discostino molto dalla media, è più sensibile a

problemi di trigger, cioè alla capacità sperimentale di distinguere tra le misure in presenza

del fascio di pump e quelle in sua assenza, in quanto è più sensibile a cambiamenti repentini,

che verrebbero o�uscati nell'altro modo. Un errore sistematico nelle misure risulta in questo

modo più evidente e si può tentare di risolverlo prima di procedere ad altre misure.

I dati per un generico ritardo temporale τ nel caso della mioglobina legata con il monos-

sido di carbonio sono mostrati in �gura 3.2.

300 350 400 450 500 550 600 650 7000

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5x 10

4

Lunghezza d’onda (nm)

Inte

nsità

(nJ

)

400 420 440 460 480 500 520 540 560−1

−0.8

−0.6

−0.4

−0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8


DA

Figura 3.2: A destra in blu ION e in rosso IOFF ; a sinistra ln( IOFFION). Si nota la pompa

attinica a 547nm. La cinetica invece si svolge tra i ∼ 400nm e i ∼ 500nm, in corrispondenzadei picchi di Soret delle specie elettroniche coinvolte.

In conclusione, possiamo notare che poiché l'apparato è ottimizzato per la spettroscopia

Raman, non si può misurare I0, relativo all'intensità del probe in assenza della cella, che

servirebbe da riferimento. Si possono solo misurare i valori dell'intensità in presenza della

cella. La possibilità di misurare I0 può essere un possibile miglioramento dell'apparato

sperimentale per e�ettuare misure di assorbimento transiente.

15

4 ANALISI DATI

4 Analisi dati

4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente

In questa sezione ci occuperemo di illustrare i dati della foto-cinetica della mioglobina presi

in assorbimento transiente. Questi ultimi possono essere arrangiati in una matrice che abbia

come indice di riga la lunghezza d'onda, come indice di colonna i tempi, e come elementi i

valori della di�erenza delle assorbanze ∆A. Se ne può fare un gra�co tridimensionale in cui

questa di�erenza è funzione del tempo e della lunghezza d'onda.

Figura 4.1: Assorbimento transiente nel caso della mioglobina deoxy. La scala di colori èrelativa a ∆A.

Data l'eccellente qualità della presa dati, si possono inferire informazioni qualitative sulla

dinamica studiando visivamente i gra�ci, in cui la scala di colori è indice del valore della

di�erenza delle assorbanze ∆A (con e senza pump) in ogni punto del piano tempo-lunghezze

d'onda (la scala di colore è indicata in �gura).

A causa del passaggio - prima di arrivare al campione - della radiazione in mezzi con indice

di rifrazione dipendente dalla lunghezza d'onda, siamo in grado di vedere, data l'elevata

risoluzione temporale con cui lavoriamo, il fenomeno noto come chirp temporale: il tempo di

arrivo della radiazione sul campione dipende dalla lunghezze d'onda con una forma funzionale

incognita ma a prima vista regolare, che è stata considerata in certi casi parabolica [6].

Si nota la comparsa - istantanea, considerando il chirp - di un picco attorno a 462 nm

(comparsa Mb∗I) e in corrispondenza di questo un'altrettanto istantanea decrescita su 435

nm (scomparsa mioglobina deoxy). Il picco a 462 nm si estingue con un tempo rapido, e

dopo di questo si crea un picco intorno a 448 nm (comparsaMb∗II), che decade con un tempo

più lungo. In corrispondenza di questi tempi di rilassamento si vede crescere l'assorbimento

a 435 nm �no a ritornare attorno allo zero in un tempo di qualche picosecondo. Questa

analisi gra�ca è interessante in quanto fornisce intuitivamente informazioni sui dati: un

picco può essere interpretato come una specie che �nasce�, un avvallamento come una specie

che �muore� in seguito alla fotolisi.

16

4.1 Presentazione dei dati di assorbimento transiente 4 ANALISI DATI

Tramite una routine scritta in Matlab abbiamo potuto eliminare il chirp: dopo un'accu-

rata selezione di alcuni punti corrispondenti all'inizio della cinetica a varie lunghezze d'onda,

la routine esegue un �t polinomiale (indicato in blu in �gura (4.2)) che riproduce l'andamen-

to del chirp in funzione della lunghezza d'onda. Ad ognuna di queste viene dunque associato

un ritardo di arrivo che viene sottratto alla relativa scala di tempo, de�nendone così una dif-

ferente ad ogni volta. La routine interpola per ogni lunghezza d'onda i valori della di�erenza

di assorbanza su una scala di tempo prede�nita, al �ne di ride�nirla in maniera univoca.

Figura 4.2: Ingrandimento sull'inizio della fotocinetica e sul chirp della deoxy. La scala dicolori è relativa a ∆A.

In �gura 4.3 riportiamo i risultati ottenuti tramite eliminazione del chirp sulla matrice

di dati della mioglobina deoxy.

Figura 4.3: Assorbimento transiente della mioglobina deoxy decirpato, �no a 15 ps. La scaladi colori è relativa a ∆A.

17


Un analogo procedimento ci porta al risultato per l'MbCO mostrato in �gura (4.4). Si

può notare come in questo caso si presenti istantaneamente un solo picco dal tempo di vita

breve a 462 nm, corrispondente a Mb∗I , mentre il fatto che non si noti un picco pronunciato

sui 448 nm indica che il canale di Mb∗II è inibito, in accordo con le precedenti osservazioni

sperimentali [5]. La traccia rossa a 435 nm corrisponde alla comparsa della miglobina deoxy

mentre quella blu a 419 nm alla scomparsa della MbCO, infatti è a queste lunghezze d'onda

che c'è il massimo dell'assorbimento del picco Soret delle due specie, rispettivamente non

legata e legata. Si nota inoltre che questi andamenti non ritornano allo zero ma a una

baseline costante dovuta al fatto che la ricombinazione geminata - de�nita nella sezione 4.3

- tra ligando ed eme, susseguente alla fotodissociazione, per il ligando CO si svolge sulla

scala di tempo del nanosecondo e può essere considerata �congelata� nel nostro studio sulla

scala del sub-picosecondo [5].

Figura 4.4: Assorbimento transiente della MbCO decirpato, �no a 10 ps. La scala di coloriè relativa a ∆A.

Nelle �gure 4.5 e 4.6 possiamo illustrare meglio la dinamica visualizzando gli spettri di

assorbimento transiente a vari tempi caratteristici.

18


410 420 430 440 450 460 470 480 490−0.14

−0.12

−0.1

−0.08

−0.06

−0.04

−0.02

0

0.02

0.04

0.06


∆Α

t=0.07ps

t=0.6ps

t=0.33ps

t=1.14ps

t=2.5ps

t=8.0ps

Figura 4.5: Spettri di assorbimento transiente della mioglobina deoxy a tempi selezionati

Possiamo notare l'immediata comparsa di un picco attorno a 460 nm - attribuibile al-

l'apparizione istantanea di Mb∗I - e la sua rapida sparizione, cui segue la comparsa di un

picco a 450 nm, attribuibile a Mb∗II . Contemporaneamente un avvallamento attorno a 430

nm indica la scomparsa della proteina non legata nello stato fondamentale. In seguito il

transiente ritorna verso lo zero, e in questo rilassamento è visibile una distorsione dei picchi

di assorbimento, dovuta, come vedremo, all'e�etto di cooling vibrazionale, che de�niremo

nella sezione 4.5 e che porta a una distorsione dei picchi di assorbimento nel tempo.

410 420 430 440 450 460 470 480 490−1.2

−1

−0.8

−0.6

−0.4

−0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8


∆Α

t=7ps

t=1.3ps

t=0.13ps

t=0.067ps

Figura 4.6: Spettri di assorbimento transiente della mioglobina legata con il CO a tempiselezionati

Per la mioglobina legata con il CO (�gura 4.6) osserviamo una dinamica simile, ma senza

19

4.2 Un possibile modello per l'ipotesi sequenziale 4 ANALISI DATI

comparsa di un picco a 448 nm (il canale diMb∗II è inibito), e con la stabilizzazione dei picchi

relativi alla scomparsa della proteina legata (avvallamento) e alla comparsa della proteina

non legata (picco) attorno a un valore costante, che indica la lenta fase della ricombinazione

geminata. Possiamo notare la presenza di una distorsione del picco, dovuta al cooling

vibrazionale anche in questo caso.

4.2 Un possibile modello per l'ipotesi sequenziale

Ricordando lo schema della foto�sica relativo al decadimento sequenziale ipotizzato in

�gura 2.2, possiamo costruire un possibile modello che ci permetta di interpretare i dati

sperimentali.

Assumiamo f0, f1 e f2 i livelli di popolazione e k10, k12, k20 le frequenze di transi-

zione. f0, f1 e f2 rappresentano Mb (stato fondamentale), Mb∗I e Mb∗II (stati eccitati)

rispettivamente.

Il sistema di equazioni di�erenziali a cui il sistema risponde, in corrispondenza con lo

schema atteso è:

Ad ogni tempo,

f0 + f1 + f2 = 1 edf0dt

+df1dt

+df2dt

= 0

Condizioni iniziali:

f0(0) = f2(0) = 0 ; f1(0) = 1

Questo set di equazioni di�erenziali è risolvibile analiticamente:

Autovalori:

(0,−(k10 + k12),−k20)

20

4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti 4 ANALISI DATI

Autovettori: 1

0

0

k10−k20k12

k20−k12−k10k12

1

−1

0

1

In�ne, la soluzione generale è:

f0(t) = 1 + f1(0)k12

k20 − k12 − k10[e−k20t +

k10 − k20k12

e−(k10+k12)t]

f1(t) = f1(0)e−(k10+k12)t

f2(t) = f1(0)k12

k20 − k12 − k10[−e−k20t +

k10 − k20k12

e−(k10+k12)t]

E' utile osservare che, nonostante la presenza di tre frequenze di decadimento, la ci-

netica del sistema di tre livelli è descritta da soli due tempi caratteristici: τlento = 1k20

e

τveloce = 1k10+k12

. Questo è consistente con le nostre osservazioni sperimentali in assor-

bimento transiente, che presentiamo nella sezione 4.3: la Deoxy (435 nm) è popolata con

entrambi i tempi. La Mb∗I si spopola solo con τveloce, mentre la Mb∗II è popolata con τveloce

e si scarica con τlento.

4.3 Cinetica sui picchi di assorbimento delle specie transienti

In questa sezione studieremo il problema della cinetica della mioglobina in seguito alla

fotodissociazione eseguendo �t a singola lunghezza d'onda sui picchi di assorbimento delle

specie transienti.

Per studiare la dinamica di rilassamento degli stati eccitati, conviene eseguire il �t delle

dinamiche sui picchi di assorbimento di ciascuna specie elettronica coinvolta. Sono infatti

presenti nello spettro di assorbimento transiente tutti gli spettri delle specie elettroniche

in gioco, e questo pone problemi di interpretabilità dei dati a lunghezze d'onda lontano

dai picchi. Infatti su queste lunghezze d'onda è presente una sovrapposizione delle code

dei vari spettri di assorbimento. In corrispondenza del picco di assorbimento di ciascuna

specie, invece, nonostante il contributo delle code dei picchi corrispondenti alle altre specie

elettroniche sia presente, in particolar modo se i picchi sono vicini in lunghezza d'onda, si

assume che il contributo dominante all'assorbimento sia quello della specie in questione.

Poichè ci si aspettano due soli tempi caratteristici del sistema, come mostrato nella

sezione 4.2, i �t sui picchi di assorbimento delle specie elettroniche sono e�ettuati come

somma di due esponenziali, inserendo una baseline per la mioglobina legata con il CO per

rappresentare la lenta ricombinazione del CO con la mioglobina - sulla scala del nanosecondo

- secondo la formula f(t) = e−tτ1 + e−

tτ2 + c.

La ricombinazione geminata è dovuta al fatto che la fotodissociazione avviene in soluzio-

ne acquosa: la mioglobina e il monossido di carbonio collidono con le molecole del solvente -

21


che limita l'allontanamento dei due fotoframmenti a pochi Angstrom - per poi collidere tra

loro e ricombinarsi. In questo caso bisogna quindi introdurre un termine costante nel �t (una

baseline), il cui valore rappresenta la presenza in soluzione della proteina non legata che si

ricombina col CO sulla scala del nanosecondo e la cui popolazione può essere quindi conside-

rata costante nel tempo dopo la cinetica ultraveloce degli stati Hb∗I e Hb∗II . Ovviamente il

�t va e�ettuato escludendo la fotolisi, che avviene secondo in tempi <50 fs [5], per studiare

l'e�ettiva dinamica di rilassamento dei due stati eccitati verso lo stato fondamentale.

Di particolare interesse è la dinamica di assorbimento transiente a λprobe = 435nm,

in corrispondenza del picco di Soret della proteina non legata, riportato integralmente in

esempio in �gura (4.7). Abbiamo utilizzato come variabile la di�erenza delle assorbanze

∆A (il logaritmo dei rapporti delle intensità). A t > 0 (a causa del chirp) una rapida

discesa (∼ 50fs) indica la fotolisi, cioè il decadimento dello stato 1Q, conseguente alla

fotoeccitazione, negli stati eccitati dell'eme non legato, con conseguente scomparsa dello

stato fondamentale. Gli stati eccitati decadono integralmente su quest'ultimo in una decina

di picosecondi, come si può capire dal fatto che, in questo lasso di tempo, la di�erenza delle

assorbanze in presenza e in assenza del pump torna a zero, indicando la ricomparsa dello

stato fondamentale.

0 5 10 15 20 25−0.14

−0.12

−0.1

−0.08

−0.06

−0.04

−0.02

0

0.02

Tempo (ps)

DA

Figura 4.7: Assorbimento in funzione della lunghezza d'onda a λ = 435 nm

22


4.3.1 La proteina non legata

Riportiamo i risultati dei �t bi-esponenziali a singola lunghezza d'onda sui picchi delle specie

transienti nel caso della mioglobina non legata.

0 5 10 15 20 25

−0.14

−0.12

−0.1

−0.08

−0.06

−0.04

−0.02

0

0.02

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.8: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 435 nm, in corrispondenza delpicco di Soret della mioglobina non legata

I risultati del �t con λprobe = 435nm, in �gura (4.8), sono in perfetto accordo con i

risultati sperimentali già ottenuti [5, 6], fatta eccezione del tempo lungo:

∆A = ln(Ion(t)

Ioff) = 0.69 · e−t/0.33ps + 0.31 · e−t/2.4ps

Il tempo di decadimento di Mb∗II è da noi stimato sensibilmente più basso di quello

trovato precedentemente.

23


0 5 10 15 20 25 30−0.01

−0.005

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.9: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 448 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento di Mb∗II

Lo spettro di assorbimento transiente a λprobe = 448 nm, in �gura (4.9), presenta una

peculiarità evidente: la creazione della specie che assorbe a questa lunghezza d'onda non è

istantanea ma si estende su una scala temporale maggiore della scala di fotolisi, di 50 fs, e

ha una dinamica evidente. Abbiamo così e�ettuato il �t bi-esponenziale su tutto lo spettro

a λprobe = 450 nm, in modo da descrivere la nascita e il successivo decadimento della specie.

Il risultato si accorda con i dati sperimentali, ed è:

∆A = 5.9 · e−t/0.45ps − 4.9 · e−t/4.4ps

in cui il tempo corto approssima bene l'andamento crescente nel tempo e il tempo lungo

quello decrescente. Una possibile interpretazione è quella di trovarsi di fronte a una specie,

Mb∗II , che non viene creata istantaneamente, ma si popola con un tempo corto, paragonabile

al tempo di decadimento diMb∗I , e si spopola con un tempo lungo. Questo avvalora l'ipotesi

sequenziale, schematicamente riportata in �gura (2.2).

24


0 5 10 15 20 25

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.10: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 462 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento di Mb∗I

I risultati del �t con λprobe = 462nm, in �gura (4.10), in corrispondenza del picco di

Mb∗I , sono:

∆A = 0.49 · e−t/0.11ps + 0.51 · e−t/2.6ps

Si nota qui un evidente disaccordo con il modello: in corrispondenza del picco di Mb∗I si do-

vrebbe osservare un andamento esponenziale con un tempo dominante di ∼ 300fs. Troviamo

invece un tempo lungo e uno corto, con pesi di ugual valore, senza dunque una predominanza

di un tempo sull'altro. Imputiamo questo risultato ai problemi precedentemente descritti

dell'assorbimento transiente sullo studio della singola lunghezza d'onda. Infatti la specie

transiente Mb∗I ha vita particolarmente breve e picco vicino in lunghezza d'onda a quello

delle altre specie transienti. Le code dello spettro di assorbimento transiente di queste ultime

in�uenzano in maniera non trascurabile la traccia a 462nm, corrispondente a Mb∗I .

Poiché la specie Mb∗I ha un tempo di vita molto breve, decidiamo di e�ettuare un �t a

singolo esponenziale �no a t = 2 ps - in �gura (4.11) - in un tentativo di evitare l'in�uenza

della coda del picco più vicino, in particolare quello della Mb∗II che, come è evidente dalla

traccia a 448nm, inizia il decadimento sullo stato fondamentale proprio attorno a questo

tempo. Il risultato, in �gura (4.11) è ∆A = e−t/0.24ps, in buon accordo con quanto atteso.

25


0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

0.05

0.055

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.11: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 462 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento di Mb∗I , �no a 2ps

4.3.2 La proteina legata con il monossido di carbonio (CO)

Presentiamo in questa sezione i corrispondenti risultati nel caso della proteina legata, MbCO.

0 5 10 15 20 25 30−0.95

−0.9

−0.85

−0.8

−0.75

−0.7

−0.65

−0.6

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.12: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 435 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento della proteina non legata

Il risultato del �t con λprobe = 435 nm, in �gura (4.12), in corrispondenza del picco di

Soret della mioglobina deoxy, è: ∆A = ln( Ion(t)Ioff) = 0.86 · e−t/0.21ps + 0.14 · e−t/3.0ps + 0.56.

26


Questo risultato è in ottimo accordo con gli studi precedenti: si osservano un tempo lungo

e uno breve, ma questa volta pesati in maniera di�erente, a confermare che il canale della

Mb∗II è inibito nella MbCO. Il rapporto tra i coe�cienti dei due esponenziali è stato stimato

come inferiore a 15 [5]. Il nostro risultato è in buon accordo con questa stima: 0.14

0.86 '16 .

0 5 10 15 20 25 30 350

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.13: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 448 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento di Mb∗II .

I risultati del �t con λprobe = 448 nm, in �gura (4.13), in corrispondenza del picco di

Mb∗II , sono:

∆A = 1.87 · e−t/0.24ps − 0.87 · e−t/6.4ps + 0.25

.

Anche in questo caso, analogamente a quanto osservato nella proteina non legata, si nota

che la specie che assorbe a 448 nm viene creata con un tempo che non si può considerare

istantaneo. Questo testimonia di una presenza non nulla della specie transiente Mb∗II .

27


0 5 10 15 20 25 300

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.14: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 462 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento di Mb∗I .

I risultati del �t con λprobe = 462 nm, in �gura (4.14), in corrispondenza del picco di

Mb∗I , sono:

∆A = 0.57 · e−t/0.10ps + 0.42 · e−t/3.1ps + 0.01

E' evidente che questo risultato è in�ciato dalla presenza delle code degli spettri di

assorbimento delle altre specie, in quanto ci si aspetta che il decadimento di Mb∗I sia ben

rappresentato da un singolo decadimento esponenziale con tempo caratteristico di ∼ 300 fs.

Analogamente al caso della proteina non legata, e�ettuiamo un �t �no a t = 2 ps,

riportato in �gura (4.15). Anche in questo caso i risultati del �t rappresentano meglio il

risultato atteso: ∆A = e−t/0.20ps.

0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 20.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.15: Assorbimento in funzione del tempo per λ = 460 nm, in corrispondenza delpicco di assorbimento di Mb∗I , �no a 2ps

28


Come si evince dai �t unidimensionali �n qui presentati, i tempi di decadimento carat-

teristici non sono gli stessi a tutte le lunghezze d'onda, come ci aspetteremmo dal modello

presentato nella sezione 4.2. Riteniamo che questo sia dovuto alla sovrapposizione delle code

degli spettri e alla stretta vicinanza dei picchi delle specie elettroniche in gioco, il che rende

di�coltoso estrarre l'informazione sulle cinetiche. Un risultato particolarmente importante

è l'informazione data dalla traccia a 448 nm, in corrispondenza del picco diMb∗II : è evidente

che questa specie viene creata con un tempo maggiore dei ∼ 50fs corrispondenti alla fotolisi.

Questo ci permette di escludere l'ipotesi parallela per la foto-cinetica della mioglobina.

Una possibile soluzione al problema della sovrapposizione degli spettri di assorbimento

è e�ettuare un global �t, cioè un �t simultaneo su tutte le lunghezze d'onda, che ha come

unici parametri i tempi caratteristici del sistema. Il modello per l'ipotesi sequenziale che

abbiamo sviluppato in precedenza può essere utile per interpretare e confrontare con esso i

risultati dell'analisi globale. Questo modello prevede due soli tempi caratteristici del sistema,

che riproducono bene gli andamenti sperimentali sui picchi di assorbimento delle specie

elettroniche coinvolte nella fotocinetica.

Possiamo inoltre notare che le ampiezze relative dei due decadimenti osservati sperimen-

talmente (Aveloce0 e Alento0 , relative ai due tempi osservati τveloce e τlento) sono completamente

determinate dalle tre frequenze di transizione (k10, k12 e k20) de�nite nell'ambito del mo-

dello presentato nella sezione 4.2. Grazie a questo si possono determinare le tre frequenze

dai dati sperimentali.

In generale troviamo:

Aveloce0

Alento0

=k10 − k20k12

e ricordando che

τlento =1

k20e τveloce =

1

k10 + k12

otteniamo i seguenti valori per i tempi di transizione:

τ20 = τlento

τ10 =1 + Aveloce0 /Alento0

1τlento

+Aveloce0 /Alento0

τveloce

τ12 =τveloceτ10τ10 − τveloce

� Per quel che riguarda la Deoxy, abbiamo, a 435 nm:

Aveloce0

Alento0

=0.69

0.31τveloce = 0.33ps τlento = 2.4ps

e di conseguenza:

τ20 = 2.4ps τ10 = 0.45ps τ12 = 1.2ps

29

4.4 Analisi globale 4 ANALISI DATI

� Per quel che riguarda la MbCO, abbiamo, a 435 nm:

Aveloce0

Alento0

=0.86

0.14τveloce = 0.21ps τlento = 3.0ps

e di conseguenza:

τ20 = 3.0ps τ10 = 0.28ps τ12 = 0.84ps

Una semplice simulazione ci permette di ottenere, a partire dalle equazioni di�erenziali

del modello e da questi valori ricavati sperimentalmente, i pro�li di concentrazione aspettati

per le tre specie, in �gura (4.16) nel caso della mioglobina deoxy:

Figura 4.16: Pro�li di concentrazione delle tre specie in funzione del tempo. Laconcentrazione è normalizzata a 1.

4.4 Analisi globale

L'analisi globale prende in considerazione tutto lo spettro di assorbimento transiente della

mioglobina, dunque viene eseguita simultaneamente su tutte le lunghezze d'onda, ed è utile

per estrarre la fotocinetica dai dati stessi. Per e�ettuare l'analisi globale abbiamo usato il

pacchetto Matlab Ultrafast Toolbox [8]. Abbiamo e�ettuato due tipi di analisi su tutto lo

spettro di assorbimento transiente della proteina non legata: la Singular Value Decomposi-

tion (SVD) e il global �t. La prima tecnica è essenzialmente una procedura matematica che

ha come obiettivo la stima del numero di processi attivi presenti nel sistema; la seconda è

un �t simultaneo su tutto lo spettro che ha come unici parametri i tempi caratteristici del

sistema, e a ognuno di essi associa uno spettro funzione della lunghezza d'onda. Tramite

questi spettri e i tempi caratteristici a loro associati si può ricostruire il segnale a tutte le

lunghezza d'onda. Confronteremo poi i risultati del global �t con gli andamenti predetti dal

modello.

4.4.1 Singular Value Decomposition (SVD)

La Singular Value Decomposition è una procedura che decompone i dati (nel nostro caso,

di assorbimento transiente) X(λ, t) = X(1, ...,m, 1..., n) contenenti m righe (corrispondenti

ai tempi) ed n colonne (corrispondenti agli spettri) nel seguente modo:

30


X = U · S · V′

Dove S è una matrice diagonale di dimensione m× n che contiene le singular values (in

ordine decrescente all'aumentare del numero di riga), U(1, ...,m, k) (�left singular vectors�,

LSV) contiene le tracce nel dominio del tempo e V (1, ...,m, k) (�right singular vectors�, RSV)

in quello spettrale, corrispondenti alla singular value S(k, k).

LA SVD può essere pensata come la decomposizione di una matrice in una somma

pesata ordinata di matrici di base. Matrici che risultano inoltre separabili nel senso che

possono essere scritte come prodotto esterno di due vettori, cioè A = u⊗ v, o in coordinate

A(i,j)=u(i)v(j). Si ottiene così X =∑i σiUi ⊗ V

′

i , dove le σi sono le singular values.

In generale, le singular value più alte contengono il segnale rilevante, mentre le più basse

rappresentano il rumore. La SVD è generalmente usata per stimare il numero di componenti

presenti nei dati, di cui determina una base di componenti ortogonali che può riprodurre gli

stessi tramite combinazione lineare, e che non hanno un necessario signi�cato �sico.

Si può comunque eseguire un �t su una selezione delle tracce temporali determinate

dall'SVD (quelle che hanno singular values dominanti). Questo �t può essere usato per

ricavare una prima stima, almeno in ordine di grandezza, dei tempi caratteristici del sistema

[8].

Riportiamo nella �gura (4.17) i risultati della Singular Value Decomposition applicata

ai dati di assorbimento transiente della mioglobina deoxy.

2 4 6 8 10

−0.3

−0.25

−0.2

−0.15

−0.1

−0.05

Tempo (ps)

LSV

SV = 1

fitLSV

350 400 450 500 550 600

−0.05

0

0.05

0.1SV = 1

RS

V


2 4 6 8 10

−0.3

−0.2

−0.1

0

SV = 2

Tempo (ps)

350 400 450 500 550 600

0

0.05

0.1

SV = 2


20 40 60 80 100 120

0.5

1

1.5

2

2.5

3Singular values (SV)

SV number

SV

SVD analysis of selected number of components

Figura 4.17: Risultati dell'analisi tramite SVD. Si noti (nel gra�co in alto a destra) comele prime due componenti siano preponderanti rispetto alle altre, cioè come abbiano singularvalue dominante. Queste due componenti sono dunque presentate, nelle altre quattro �gure,sia nel dominio del tempo (LSV) sia in lunghezza d'onda (RSV).

L'SVD conferma la presenza di due processi dominanti sugli altri, in accordo con le

nostre aspettative (ci aspettiamo infatti due spettri di base, cioè due soli tempi caratteristici

31


del sistema, come mostrato nel modello sequenziale). Una prima stima di questi tempi è

τ1 = 0.53 ps e τ2 = 6.1 ps, sovrastimati rispetto a quelli ricavati dai �t sulla singola

lunghezza d'onda. Si può notare la presenza di un terzo processo non del tutto trascurabile,

che intepreteremo nel seguito in termini di un processo di distorsione dei picchi, il cooling

vibrazionale. Abbiamo deciso di trattare in questa sezione solo i due processi dominanti, il

terzo sarà trattato nelle sezioni 4.4.2 e 4.5.

4.4.2 Global �t

Un global �t è un potente strumento che permette l'estrazione delle informazioni in-

dipendenti dal tempo (come la forma degli spettri che rappresentano una transizione in

un esperimento di spettroscopia) presenti nei dati. Questo approccio sempli�ca di molto

l'interpretazione delle dinamiche osservate riducendo la dimensionalità del problema, cioè

descrivendo i dati tramite spettri indipendenti dal tempo.

La procedura di �t del pacchetto Ultrafast Toolbox usa due metodi di�erenti, la ricerca

basata sul gradiente e quella diretta, per analizzare i dati (dipendenti dal tempo) X(t) [8].

Queste procedure di �t sono basate sul calcolo e la minimizzazione della somma dei residui:

min∑

(X(t)−X(t))2 (4.1)

dove X(t) è la matrice di dati aspettata. Un metodo ampiamente impiegato per minimizzare

una funzione di questo tipo è l'analisi dei minimi quadrati non lineare. A questo scopo si

usa un metodo basato sul gradiente dove la di�erenziabilità della funzione è essenziale dal

momento che la derivata prima della funzione di errore (4.1) dev'essere calcolata (iterativa-

mente). Se il problema è multidimensionale (come nel nostro caso, il problema si pone su

varie lunghezze d'onda), bisogna cercare il minimo assoluto su di una super�cie. Il problema

dei metodi basati sul gradiente è che un gradiente alto in un punto può portare a minimiz-

zare la funzione su di un minimo locale. Una possibile soluzione è usare di�erenti valori di

partenza (random), anche se in teoria se ne dovrebbero usare un numero in�nito.

Un metodo di ricerca diretto può essere più potente nella de�nizione di un minimo

assoluto, poiché ha una tendenza più bassa a restare in un minimo locale. In questo caso si

costruisce una griglia attorno ad un punto di partenza sulla super�cie in questione (su cui

non c'è richiesta di di�erenziabilità né di continuità) e conseguentemente tutte le direzioni

sono iterativamente scansionate. Se l'algoritmo incontra un valore più basso (ricordiamo

che stiamo parlando della somma dei residui de�nita nell'equazione precedente), il nuovo

valore diventa il nuovo punto di partenza, e l'algoritmo riparte, ma con una griglia più

grande. La dimensione della griglia diminuisce se tutti i punti scansionati hanno un valore

più alto di quello del punto di partenza. Questo tipo di algoritmo è detto patternsearch ed

è particolarmente e�ciente nell'ottimizzazione di problemi ad alta dimensionalità.

Nella spettroscopia ultraveloce, come mostrato nel paragrafo 1.2, si usano andamenti

esponenziali per descrivere processi come i segnali di assorbimento transiente:

X(t) = y0 +

n∑i=1

Aiexp−t/τi (4.2)

32


Dove y0 rappresenta la baseline (che può essere dovuta, per esempio, a una ricombina-

zione geminata), Ai le ampiezze - indipendenti dal tempo - e τ i le costanti di tempo per

ognuno degli n esponenziali che determinano la concentrazione o la popolazione degli stati.

In un esperimento di assorbimento transiente gli Ai rappresentano gli spettri corrispondenti

ai processi che avvengono nella matrice dei dati (sono dunque una funzione di λ) e i τi i loro

rispettivi tempi caratteristici.

Nel caso di decadimenti multi-esponenziali, bisogna fornire al programma un modello di

connessione tra gli stati su cui eseguire il global �t dei dati, che può essere creato tramite

un'interfaccia gra�ca intuitiva sul pacchetto Matlab SimBiology ed esportato in formato

xml utilizzabile da Ultrafast Toolbox. In questo modo possiamo inserire il modello che

abbiamo proposto nella sezione 4.2. L'approccio usato da SimBiology è quello di risolvere il

problema numericamente, cioè di risolvere il sistema di equazioni di�erenziali ordinarie per

le concentrazioni dipendenti dal tempo di ogni componente. La somma delle concentrazioni

di tutte le componenti allo stesso istante di tempo è normalizzata a 1.

L'obbiettivo dell'analisi globale è quello di estrarre dai dati gli spettri indipendenti dal

tempo Ai(λ) e le costanti di tempo τi, de�nite dal modello. Le costanti di tempo sono comuni

indipendentemente a tutte le lunghe d'onda misurate, mentre le ampiezze a loro associate

possono variare su ogni lunghezza d'onda. Il metodo di lavoro di Ultrafast Toolbox è quello

di generare prima i pro�li di concentrazione (dipendenti dal modello, nel nostro caso quello

dell'ipotesi sequenziale descritta nella sezione 4.2) ed e�ettuando un �t di questi ultimi sui

dati, estrarre gli spettri e le costanti di tempo [8].

Riportiamo nelle �gure (4.19) e (4.20) i risultati del global �t e�ettuato sull'intero spettro

di assorbimento transiente della mioglobina non legata.

33


Figura 4.18: Figura in alto: Dati caricati dello spettro di assorbimento della mioglobinadeoxy (griglia nera) e global �t sui dati (a colori). In basso: pro�li di concentrazione infunzione del tempo per le tre specie elettroniche, risultato del �t sui dati. In verde f0,corrispondente alla proteina non legata, in rosso f2, corrispondente a Mb∗II , e in blu f1,corrispondente a Mb∗I . Gli andamenti sono in accordo con quelli ipotizzati nel modellosequenziale.

420 430 440 450 460 470 480 490

−0.15

−0.1

−0.05

0

0.05


∆Α

Figura 4.19: Spettri indipendenti dal tempo per le tre specie elettroniche.

I risultati estratti dal global �t per i tempi caratteristici sono

τ1 = 0.58 ps, τ2 = 1.5 ps e τ3 = 4.6 ps

34


rispettivamente associati agli spettri in blu, rosso e verde. Le tre linee orizzontali stanno

a indicare la posizione dei picchi di assorbimento delle tre specie coinvolte nella reazione,

nell'ordine la proteina non legata (435 nm), Mb∗I (448 nm) e Mb∗II (462 nm).

Possiamo interpretare come un processo di scomparsa della mioglobina deoxy e compar-

sa dello stato eccitato Mb∗I lo spettro associato al tempo corto (in blu) e come scomparsa

della mioglobina deoxy e comparsa dello stato eccitato Mb∗II lo spettro associato al tempo

lungo (in rosso). Ci aspettiamo, come mostrato precedentemente, la presenza di soli due

tempi caratteristici del sistema, anche se il modello necessita di tre frequenze di transizione.

Lo spettro in verde dovrebbe dunque apparire piatto per rispettare il nostro modello. La

distorsione di questo spettro rispetto al valore nullo costante può essere interpretato tramite

la presenza del fenomeno di cooling vibrazionale, un fenomeno di spostamento dei picchi

di assorbimento nel tempo che discuteremo nella sezione 4.5. L'intepretazione di uno degli

spettri caratteristici risultanti dal global �t in termini di un processo di rilassamento vibra-

zionale è stata data anche in altri studi [9]. Abbiamo così spiegato la presenza del terzo

processo non trascurabile che appariva nell'SVD.

Possiamo in seguito eseguire un confronto tra gli andamenti attesi - calcolati in base al

modello presentato nella sezione 4.2, inserendovi le frequenze di transizione stimate nella

sezione 4.3 - e gli andamenti predetti da quest'ultimo sulle tre lunghezze d'onda corrispon-

denti ai picchi di assorbimento degli stati elettronici coinvolti, calcolati secondo la formula

(4.1). Riportiamo in blu gli andamenti ottenuti dal modello e in azzurro quelli ricavati dal

global �t.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.20: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global �tin funzione del tempo a λ = 435 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento dellaproteina non legata

35


0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10−0.4

−0.3

−0.2

−0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.21: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global �tin funzione del tempo a λ = 448 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗II

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

Tempo (ps)

∆Α

Figura 4.22: Confronto tra gli andamenti risultanti dal modello sequenziale e dal global �tin funzione del tempo a λ = 460 nm, in corrispondenza del picco di assorbimento di Mb∗I

Come si può vedere, i tempi sono sovrastimati, ma gli andamenti sono rispettati. Inter-

pretiamo questa sovrastima in termini della presenza del cooling vibrazionale.

36

4.5 Cooling vibrazionale 4 ANALISI DATI

4.5 Cooling vibrazionale

Il cooling vibrazionale è il fenomeno per cui il picco di assorbimento di una certa specie elet-

tronica si sposta in lunghezza d'onda durante la misura, a causa di e�etti di ra�reddamento

del campione nel tempo. Infatti, la fotoeccitazione all'origine delle transizioni elettroniche ri-

sulta in specie eccitate con energia vibrazionale in eccesso localizzata in una o più vibrazioni

attive di Franck-Condon [10].

Un prerequisito all'uso del global �t è che i dati consistano in una combinazione lineare di

componenti indipendenti dal tempo. Questo non è vero se il cooling vibrazionale porta a un

cambiamento nel tempo della frequenza vibrazionale [8]. Questo fenomeno ha un'importanza

non trascurabile nelle cinetiche da noi presentate.

Possiamo monitorare lo spostamento dei picchi dello spettro totale di assorbimento tran-

siente in funzione del tempo, al �ne di studiare il processo di cooling vibrazionale. Ri-

cordiamo che questi picchi non rappresentano quelli di una data specie elettronica, ma

dell'assorbimento transiente globale.

Per studiare la posizione dei picchi in funzione del tempo una possibilità è eseguire un

�t sui dati con una combinazione lineare di due gaussiane, con una funzione del tipo

f(t) = a1 · e−(x−b1)c1

2

+ a2 · e−(x−b2)c2

2

dove b1 e b2 sono in buon accordo con la posizione reale dei picchi dello spettro di as-

sorbimento transiente. Questo è uno strumento per studiarne la posizione in funzione del

tempo e per riprodurne la forma funzionale, anche se a priori quest'ultima non è gaussiana.

Tuttavia l'andamento - sia nella proteina legata sia in quella non legata - è riprodotto in

ottima approssimazione da questa forma funzionale, come mostrato in �gura (4.24), nella

quale riportiamo un esempio per quel che riguarda lo spettro di assorbimento transiente

della proteina legata a t = 1.63 ps.

400 410 420 430 440 450 460 470−1

−0.8

−0.6

−0.4

−0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8


∆Α

Figura 4.23: Spettro di assorbimento transiente in funzione della lunghezza d'onda a t =

1.63 ps. Il �t è riportato in �gura: ∆A = −1.1 · e−(x−423nm)

2,9nm2

2

+ 0.63 · e−(x−438)

3.9nm2

2

37



proteina non legata

In questa sezione presentiamo i dati relativi alla dinamica di cooling vibrazionale - nel caso

della proteina non legata - in corrispondenza sia della scomparsa della specie non legata sia

della comparsa dello stato elettronico eccitato Mb∗II .

Il minimo dell'assorbimento transiente, in prossimità dunque della mioglobina non legataè ben rappresentato, �no a∼ 7 ps, da un singolo esponenziale, come mostrato in �gura (4.25).

0 1 2 3 4 5 6 7420

422

424

426

428

430

432

434

436

Tempo (ps)

Lung

hezz

a d’

onda

(nm

)

Figura 4.24: Posizione del picco dell'assorbimento transiente in prossimità della scomparsadella mioglobina deoxy in funzione del tempo. f(t) = (15 · e−x/2.2ps + 421) nm

Il risultato per il tempo caratteristico è τD = 2.2 ps.

Il cooling corrisponde a ∼ 14 nm, ed è dunque importante, e non trascurabile nei nostri

dati in quanto il suo tempo caratteristico è confrontabile con quelli delle specie elettroniche

in gioco.

Inoltre, anche il massimo dell'assorbimento transiente, in prossimità della specie elet-

tronica Mb∗II , è soggetto ad un andamento dello stesso tipo, il che conferma che Mb∗IIcorrisponde ad uno stato eccitato vibrazionalmente caldo. In �gura (4.26) riportiamo il

�t a singolo esponenziale e�ettuato sulla posizione di questo picco, che presenta un tempo

caratteristico τDII = 1.8 ps.

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5446

446.5

447

447.5

448

448.5

449

Tempo (ps)

Lung

hezz

a d’

onda

(nm

)

Figura 4.25: Posizione del picco dell'assorbimento transiente attorno a 450 nm (in prossimitàdella comparsa della specie Mb∗II) in funzione del tempo. f(t) = (5.1 · e−x/1.8ps + 446) nm

38



proteina legata

In questa sezione presentiamo e discutiamo gli analoghi risulati per lo spettro di assorbimento

della proteina legata, in prossimità del picco della specie non legata che viene formata, in

termini di una presenza non nulla della specie elettronica eccitata Mb∗II .

Il massimo dello spettro di assorbimento transiente presenta un andamento crescente e

decrescente in funzione del tempo e abbiamo così eseguito il �t come somma di due espo-

nenziali, mostrando il risultato in �gura (4.27). Questo andamento può essere spiegato con

una prima rapida fase di riscaldamento della mioglobina deoxy, seguito da un più lento coo-

ling. La salita iniziale, con tempo caratteristico di 1.8 ps, può essere interpretata inoltre, in

virtù di questa sua durata nel tempo, come una distorsione del transiente dovuta alla specie

Mb∗II che assorbe attorno a 462 nm, a testimoniare della non completa assenza di questo

processo. Nonostante ciò, la cinetica di questa specie - prodotta in quantità trascurabile

nella mioglobina legata con il CO - è totalmente nascosta dallo spettro transiente totale in

corrispondenza del suo picco di assorbimento.

0 5 10 15 20 25 30437.2

437.4

437.6

437.8

438

438.2

438.4

438.6

Tempo (ps)

Lung

hezz

a d’

onda

(nm

)

Figura 4.26: Posizione del picco dell'assorbimento transiente attorno a 435 nm (in prossimitàdella comparsa della mioglobina deoxy) in funzione del tempo. f(t) = (−12 · e−x/2.2ps + 11 ·e−x/2.6ps + 438) nm

Il risultato per i tempi caratteristici è τCO1 = 2.2 ps e τCO2 = 2.6 ps.

Il cooling corrisponde a ∼ 0.4 nm. Come si nota il picco si stabilizza attorno a una

frequenza di ∼ 438 nm.

39

5 CONCLUSIONE

5 Conclusione

In questa dissertazione ci siamo occupati di indagare nel dettaglio la cinetica ultraveloce

della mioglobina in seguito alla fotolisi realizzata tramite la pompa attinica a 547 nm, in

corrispondenza delle bande Q. Questa cinetica è ultraveloce e fondamentale per comprendere

la dinamica dell'eme dell'emoproteina negli istanti immediatamente successivi alla fotolisi.

La tecnica che ci ha permesso di trarre informazioni è la spettroscopia pump and probe,

in particolare l'assorbimento transiente. Lo studio della cinetica e la stima del numero di

specie coinvolte nella reazione è di notevole di�coltà, in quanto i picchi di assorbimento

delle specie elettroniche sono vicini in lunghezza d'onda, e la sovrapposizione delle rispettive

code tende a mascherare le cinetiche. Si può dunque ricorrere a tecniche di �t avanzate che

prendono in considerazione l'intero spettro di assorbimento.

L'analisi da noi condotta conferma le ipotesi fatte in letteratura, in particolare quella

di un decadimento sequenziale degli stati eccitati verso lo stato fondamentale. Tramite un

modello per la cinetica dei tre stati rappresentanti la proteina non legata e le due specie

eccitate Mb∗I e Mb∗II , abbiamo potuto guidare e interpretare l'analisi su tutte le lunghez-

ze d'onda dello spettro di assorbimento transiente. Nonostante questo, l'e�etto di cooling

vibrazionale è un'ulteriore complicazione all'interpretazione dei dati, e non è stato preso in

considerazione nell'analisi globale. I risultati sono comunque positivi in quanto conferma-

no la predominanza di due processi, da noi interpretati come apparizione delle due specie

elettroniche eccitate delle eme non legato, Mb∗I e Mb∗II .

Abbiamo studiato inoltre la dinamica del cooling vibrazionale, confermando l'ipotesi di

lavorare con stati vibrazionali dell'eme caldi, sia per quel che riguarda lo stato fondamentale

sia per gli stati eccitati.

40

RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

Riferimenti bibliogra�ci

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41

Assorbimento transiente in mioglobina...

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