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anno 59 - n. 608gennaio 2020

INDUSTRIEALIMENTARI

CON IL PATROCINIO DI

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imballaggio 5

industrie alimentari - lix (2020) - gennaio industrie alimentari - LIX (2020) - gennaio

L. Iacumin1 - A. Colautti1

E. Paglione2 - G. Comi1*

1Dipartimento di Scienze AgroAlimentari,

Ambientali e Animali, Università degli Studi di Udine

Via Sondrio 2/a - 33100 Udine2Metalpack srl

Via del San Michele 34834170 Gorizia (GO)

*email: [email protected]

• PAROLE CHIAVEnanomateriali, nanotecnologie, alimen-ti, settore alimentare

• KEYWORDSnanomaterials, nanotechnology, food, food sector

• RIASSUNTOÈ stata valutata l’attività antimicrobica di carta rivestita di rame (carta ramata) ad uso sacchetti per imballo secondario di alimenti. In particolare è stata valutata la sopravvivenza di microrganismi di origine alimentare intenzionalmente inoculati su carta “ramata” (+Cu) e su carta tradizionale (-Cu) priva di rame. Entrambe le tipologie di carte erano inoculate, conservate a 20±2 °C e analizzate ai tempi 0 e 24 h dall’inoculo. La riduzione della carica microbica inoculata è stata massima (100%) quando l’inoculo era costituito da una sospensione dei microrganismi testati in acqua peptonata. È stato, infatti, dimostrato che la presenza dell’ac-qua della sospensione batterica, favorendo la lisciviazione del rame, incrementava l’effetto dello stesso nei confronti dei microrganismi considerati. Viceversa, quando l’inoculo era eseguito a secco tramite tampone, la riduzione era compresa tra il 60 e il 100%. È stata evidenziata una riduzione, compresa tra il 2 e il 33%, della carica inoculata anche su carta priva di rame. In tutti i casi valutati, la riduzione era strettamente dipendente sia dal microrganismo considerato che dal lotto della carta metallizzata. Considerato l’effetto antimicrobico evidenziato, si suggerisce di confezionare gli alimenti in imballaggi secondari costituiti da carta coattata con rame.

• SUMMARYThe antimicrobial activity of copper-coated paper for use as bags for secondary food packaging was evaluat-ed. In particular, the survival of food-borne microorganisms intentionally inoculated on copper-coated paper (+Cu) and on traditional copper-free paper (-Cu) was evaluated. Both the papers were inoculated, stored at a 20±2°C and analysed at time 0 and 24 h. The reduction of the inoculated microbial load was maximum (100%), when the inoculum consisted of a suspension in peptoned water of the tested microorganisms. It has been demonstrated that the presence of the water of the bacterial suspension favoring the leaching of copper increased its effect against the tested microorganisms. Conversely, when the inoculum was dry the reduction was between 60 and 100%. The reduction observed on copper-free paper was limited and between 2 and 33%. In all the tested cases the reduction was strictly dependent on the microorganism considered and on the lot of copper-coated paper. Given the antimicrobial effect of copper, it is suggested to pack the food in secondary packaging consisting of coated-copper paper.

Attività antimicrobica di carta da confezionamento rivestita con rame nei confronti di microrganismi patogenie alteranti i prodotti alimentari

Antimicrobial activity of copper-coated paper versus intentionally inoculated food microorganisms

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Introduzione Da decenni metalli pesanti

come arsenico, rame, mercurio, ar-gento e zinco vengono usati come antimicrobici in medicina umana e veterinaria (Hobman et Crossman, 2015; Rensing et al., 2018). Il mer-curio e l’argento sono usati come disinfettanti in ambito clinico (Du-ran et al., 2016; Hobman et Cros-sman, 2015). Lo zinco è ricono-sciuto come essenziale per le pian-te verdi e i mammiferi sin dagli anni ‘30 (Nielsen, 2012), e recentemen-te il suo uso è stato approvato per il trattamento e la prevenzione di malattie post-svezzamento in molti paesi europei (Murphy et al., 2017). Allo stesso modo, il rame è usa-to come promotore della crescita e anche per il controllo della diar-rea nel pollame (Hobman et Cros-sman, 2015). I metalli hanno avuto ed ancora hanno un’importanza te-rapeutica significativa. Attualmen-te si studia la possibilità di intrap-polare tali metalli in nanoparticelle ai fini di aumentare il loro uso tera-peutico nella medicina umana (Par-ra et al., 2018; Bilal et al., 2017). Tra i metalli maggiormente utiliz-zati dall’uomo ai fini terapeutici, vi-sta la bassa tossicità, spicca il rame. È un oligoelemento e un micronu-triente essenziale per la quasi to-talità degli organismi viventi. Vie-ne adoperato in piccole quantità come cofattore per alcuni metallo-enzimi ed è richiesto dai batteri per la crescita. Il rame libero, e in parti-colare il suo eccesso, risulta esse-re tossico per tutti i sistemi biolo-gici. Se presente in quantità eleva-te, il rame manifesta una spiccata attività antimicrobica (Argudìdn et al, 2019; Warnes et al., 2012), ecco perché viene utilizzato per decon-taminare superficie in ambito ospe-daliero e nell’industria alimenta-

re. È stato dimostrato, infatti, che il rame risulta essere molto attivo nel controllo di microrganismi patogeni nell’industria alimentare (Noyce et al., 2006). Infatti, nel 2008, la Envi-ronment Protection Agency of the United States (EPA) ha approvato l’uso del rame per decontaminare microrganismi da superfici, ricono-scendogli proprietà antibatteriche. Come recentemente dimostrato, l’attività antibatterica delle leghe di rame è dipendente dallo stret-to contatto tra i batteri e la superfi-cie che rilascia rame ionico. L’effet-to può essere incrementato o ridot-to anche da altri parametri quali: temperatura, umidità, caratteristi-che della lega di rame e la sua ossi-dazione, natura dei batteri e tipolo-gia di contatto tra microrganismi e la superficie (Parra et al., 2018).

Negli ultimi anni, hanno attira-to l’attenzione le nanoparticelle di rame (CuNPs) per le loro potenziali applicazioni. Le nanoparticelle sin-tetizzate sono caratterizzate da co-lore rosso vino, presentano mor-fologia sferica, differenti diametri, un elevato rapporto superficie/vo-lume, dimensioni ridotte e alta di-spersione (Hassanien et al., 2018). Tra le loro proprietà troviamo la conduttività ottica, meccanica, ca-talitica ed elettrica. A queste carat-teristiche viene addizionato anche il basso costo di impiego (Shende et al., 2015).

Il rame acquisisce un ruolo du-plice di essenzialità e tossicità, dun-que i microrganismi devono posse-dere specifici meccanismi per man-tenere il rame intracellulare in un intervallo che non interferisca con la normale attività della cellula. I fabbisogni di rame da parte dei bat-teri sono solitamente soddisfatti con concentrazioni nell’ordine del-le 10-22, mentre a livelli più elevati e nella sua forma ionica libera Cu2+ è tossico per le cellule microbi-

che (Cervantes et al.,1993). Diver-si sono gli effetti del rame sulle cel-lule e diverse sono le teorie lega-te ai meccanismi d’azione della lega sui batteri. La tossicità del rame, in un primo momento, è stata princi-palmente deputata alla produzione di radicali liberi di ossigeno reattivo intracellulare, che causano l’inatti-vazione di componenti cellulari tra cui proteine, lipidi e acidi nuclei-ci (Solioz et al., 2010). Il suo ecces-so provoca, all’interno delle cellu-le microbiche, condizioni di stress, che portano all’alterazione della trascrizione e della traduzione (Tar-rant et al., 2018). Recenti studi han-no stabilito che l’eccesso della pre-senza del rame provoca un cambia-mento del metabolismo del carbo-nio di patogeni quali Staphylococ-cus aureus, attraverso l’induzione di alcune proteine operanti all’interno della glicolisi (Tarrant et al., 2018). È stata poi proposta una teoria se-condo cui gli ioni di rame rilascia-ti dalle superfici inducono modifi-cazioni irreversibili della membra-na e della parete cellulare dei bat-teri, provocando la perdita di po-tenziale della membrana e di ma-teriale citoplasmatico (Grass et al., 2011). Altri meccanismi di tossici-tà sono stati descritti da Hodgkin-son e Petris (2012), tra questi ricor-diamo la rottura della catena poli-peptidica delle proteine e l’instau-rarsi di legami tra rame e aminoaci-di. Inoltre, il rame compete con al-tri metalli per il sito di legame pro-teico e ciò può portare all’esclusio-ne dei cofattori metallici dai loro li-gandi. Akhidime et al., (2019), in uno studio volto a studiare l’azione antimicrobica di ioni metallici, han-no dimostrato che il rame e lo zinco mostravano una maggiore propen-sione a lisciviare dai substrati in cui sono intrappolati rispetto ad altri ioni metallici (argento, titanio, ferro, molibdeno). Il silicio, al contrario,

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aveva scarsa attività antibatterica proprio a causa della sua incapacità di lisciviazione. Grazie all’effetto “li-sciviazione”, il rame ha dimostrato il maggiore potenziale antimicrobico seguito dall’argento, dallo zinco e dal titanio. Gli ioni di rame sono ne-cessari per il corretto funzionamen-to delle attività cellulari dei batte-ri ma, come precedentemente det-to, possono causare effetti tossici se presenti in concentrazioni ele-vate. Per mantenere il metabolismo cellulare operativo a differenti con-centrazioni di rame, i batteri hanno sviluppato specifici sistemi di dife-sa. Nei batteri, uno dei meccanismi di protezione dal rame è rappresen-tato dall’operone ATPasi di tipo P. Questi enzimi costituiscono delle pompe di traslocazione la cui fun-zione è quella di trasportare gli ioni metallici in eccesso o tossici pre-senti sulla membrana citoplasma-tica quando le concentrazioni ri-sultano essere sfavorevoli. Il rame, che viene trasportato dal citopla-sma al periplasma, viene coniugato da proteine disintossicanti (Tambo-si et al., 2018). Vi sono due sistemi deputati all’assorbimento di rame CutA e CutB, mentre i geni CutC e CutD operano nell’efflusso di rame. Le proteine di stoccaggio o carrier intracellulari di rame sono CutE e CutF, responsabili della protezione della cellula dalla tossicità del rame in forma Cu+ e forniscono rame ai siti di sintesi delle proteine rame di-pendenti (Cervantes et al., 1993).

Sono presenti anche le ossida-si multicopper (MCO) che seque-strano ed ossidano il rame da Cu+ a Cu2+ rendendolo meno reattivo (Rademacher et Masepohi, 2012). È stata osservata, inoltre, una cor-relazione tra l’aumento dei livelli di rame e l’aumento della presenza di geni di resistenza al metallo ospi-tati su plasmidi e altri elementi ge-netici mobili. Alcuni geni plasmidi-

ci, infatti, avrebbero la funzione di ostacolare l’assorbimento di alti li-velli di ioni di rame libero. I batte-ri acquisiscono determinanti del-la resistenza al rame attraverso l’e-voluzione e meccanismi di coniu-gazione o trasposizione. Queste proprietà di trasferimento rappre-sentano un modo naturale per in-trodurre nuove capacità genetiche adattive nelle popolazioni batteri-che, che vivono in ambienti conta-minati da metalli pesanti (Das et al., 2016). I geni responsabili della resi-stenza ai metalli sono comuni all’in-terno dei plasmidi dei batteri isola-ti e sono simili a quelli umani. Re-centi dimostrazioni hanno indica-to che la resistenza al rame elevato può essere stata un fattore chiave nell’evoluzione dei patogeni come Staphylococcus aureus (gram posi-tivo). La resistenza si basa, proba-bilmente, sulla detossificazione del rame in eccesso da parte dei pato-geni (Tarrant et al., 2018).

Pertanto lo scopo del lavoro è stato quello di valutare l’effetto del rame coattato su carta da confezio-namento verso microrganismi di in-teresse alimentare. Scopo addizio-nale è stato quello di proporre, in caso di una sua attività antimicrobi-ca, l’eventuale impiego di carta co-attata rame come imballo seconda-rio per prodotti alimentari.

Materiali e metodi

Sono stati utilizzati diversi lot-ti di carte metallizzate e non, uso confezioni alimentari. In particola-re le carte utilizzate erano costitui-te dai seguenti lotti:

Carta metallizzata (+Cu) lotti – 1 -LTF-18-010928; 2 - LTF-18-009227; 3 - LTF-18-000295/1; 4 - LTF-18-010960; 5 - LTF-18-

009215; 6 - LTF-18-009215; 7 - LTF-18-009204.

Carta tradizionale (-Cu) lotti - 8 - LTM-18-006599; 9 - LTM-18-006598; 10 - LTM-18-006597; 11 - LTM-18-006596

Microrganismi utilizzati: I mi-crorganismi di interesse alimenta-re, utilizzati per inoculo superficia-le delle carte, derivavano da Colle-zioni Internazionali (DSMZ) o erano isolati da alimenti e conservati nel-la Collezione del Dipartimento di Scienze Agro-Alimentari, Ambien-tali e Animali dell’Università degli Studi di Udine (Di4a): Asperigillus niger; Bacillus cereus; Bacillus subti-lis; Coliformi - Pantoea (Enterobacter) agglomerans e Citrobacter freundii; Escherichia coli; Kluyveromyces mar-xianus; Lactobacillus casei; Lactoba-cillus rhamnosus; Listeria monocyto-genes; Penicillium nalgiovense; Pseu-domonas fluorescens e Ps. Cepacea; Saccharomyces cerevisiae; Salmo-nella spp. (S. enteritidis e S. typhimu-rium); Salmonella escabana; Shewa-nella putrefaciens; Staphylococcus aureus; Staphylococcus carnosus; Staphylococcus xylosus

ProceduraDa rotoli di carta metallizzata e

non, sono stati ritagliati pezzi circo-lari (diametro 8,5 cm), che sono sta-ti posti in piastre di Petri sterili.

Metodo a: preparazione delle sospensioni e inoculo

Da ogni colonia microbica ve-niva prelevata un’aliquota, che era stemperata in una provetta di 9 mL di acqua peptonata sterile. Dopo omogeneizzazione, la sospensione veniva misurata allo spettrofoto-metro per ottenere un valore di 0,1 a 600 nm (107 UFC/mL), e quindi 0,1 mL di ogni sospensione era de-

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positata sul campione di carta me-tallizzata e non, e spatolata.

Metodo b: preparazione delle colonie “a secco” e inoculo

Ogni ceppo considerato era stri-sciato nei rispettivi terreni di cultu-ra – Plate Count Agar (PCA; Oxoid, Italia) per i batteri (incubati a 30°C per 24 h); deMan Rogosa Sharpe agar (MRS; Oxoid, Italia) per i Lat-tobacilli (incubati a 37°C per 24-48 h); Agar Malto (AM; Oxoid, Ita-lia) per i lieviti e le muffe (incubati a 25°C per 3 -5 giorni). Quindi, trami-te tampone veniva prelevata parte di ogni singola colonia e strisciata (fitta) su ogni carta considerata (di-mensioni area circa 56 cm2).

Analisi per verificare l’eventuale azione antimicrobica

Venivano approntati 3 cam-pioni per ogni microrganismo, per ogni tempo (0-24 h) e per ogni lot-to di carta. I campioni ottenuti con entrambi i metodi erano posti a 20±2°C e analizzati ai tempi: 0 per verificare il livello di inoculo iniziale e 24 h per verificare il livello di at-tività antimicrobica della carta me-tallizzata.

Le carte inoculate erano prele-vate in asettico da ogni piastra, po-ste in sacchetti di stomacher e di-luite con acqua peptonata sterile. Previa diluizione decimale, 0,1 mL di ogni diluizione erano spatolati o pasti nei seguenti terreni di cultu-ra agarizzati: Batteri in Plate Count Agar (Oxoid, Italia) addizionato di 5 g/L di peptone (Oxoid, Italia) in-cubato a 30°C per 48 – 72 ore (ISO 4833), Lattobacilli in MRS Agar (de-Man, Rogosa, Sharpe Agar - Oxoid,

Italia), tecnica doppio strato, incu-bato a 30°C per 48-72 ore; Lieviti e muffe in Agar Malto (Oxoid, Italia) e in Yeast Glucose Chloramphenicol agar (Oxoid, Italia) incubati a 25°C per 3-5 giorni (ISO 7954).

Risultati L’inoculo (metodo a), esegui-

to tramite deposizione di 0.1 mL di ogni sospensione microbica sul-la carta metallizata (+Cu) e sul con-trollo, carta bianca non metallizza-ta (-Cu), ha presentato un compor-tamento nettamente differente. In-fatti ogni microrganismo in sospen-sione era inattivato dalla carta me-tallizzata già dopo poche ore dall’i-noculo. Dopo 24 non si osservava alcun microrganismo sia sporigeno che asporigeno vivo. Tale inattiva-zione era osservabile indipenden-

temente dal momento della dilui-zione, sia subito dopo aver diluito la carta metallizzata che 1 h dopo la diluizione. Quindi la carta me-tallizzata permetteva di abbattere il 100% dei microrganismi inocu-lati. I microrganismi sospesi in ac-qua peptonata e inoculati nella car-ta non metallizzata (-Cu, controllo) invece subivano solo leggere ridu-zioni e sempre inferiori al 5%.

L’inoculo (metodo b), ottenu-to distribuendo tramite tampone a secco i microrganismi considera-ti sia sulla carta metallizzata che su quella non metallizzata, ha subito differenti riduzioni legate al micror-ganismo, alla carta utilizzata (+Cu o -Cu) e al lotto della stessa carta (Tabb. 1-2). Tuttavia anche in que-sto caso si è osservata una consi-derevole riduzione dei microrga-nismi posti a contatto con la car-ta metallizzata (+Cu) e una lieve ri-duzione di quelli inoculati sulla car-

Tabella 1 - Riduzione microbica in carta metallizzata (+Cu) e non (-Cu) dopo 24 h a 20± 2°C.

Specie Riduzione

+Cu -Cu

Aspergillus niger 76% 20%Bacillus cereus 65% 19%Bacillus subtilis 76% 23%Coliformi 91% 6%Escherichia coli 90% 4%Kluyveromyces marxianus 88% 5%Lactobacillus casei 60% 3%Lactobacillus rhamnosus 65% 5%Listeria monocytogenes 100% 26%Penicillium nalgiovense 82% 17%Pseudomonas fluorescens/cepacea 100% 9%Saccharomyces cerevisiae 95% 25%Salmonella enteritidis/typhimurium 100% 15%Salmonella escabana 100% 18%Shewanella putrefaciens 100% 22%Staphylococcus aureus 100% 26%Staphylococcus carnosus 74% 10%Staphylococcus xylosus 95% 22%

Carta +Cu : lotti 1-4 – Carta –Cu lotti 8-9

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ta non metallizzata (controllo, -Cu). Dai dati emerge che la riduzione variava da un minimo del 60% a un massimo del 100%. In particolare i lieviti e le muffe si sono dimostrati maggiormente resistenti rispetto ai batteri. Infatti si osservava una ri-duzione del 100% o comunque ele-vata nei confronti dei microrgani-smi patogeni (Listeria monocytoge-nes, Salmonella spp. e Staphylococ-cus aureus) o strettamente alteran-ti (Shewanella putrefaciens, Pseudo-monas spp.). Buone riduzioni sono osservate anche a livello dei mi-crorganismi sporigeni, quali Bacil-lus cereus e B. subtilis. I coliformi e Escherichia coli subivano riduzioni comprese tra il 90 e il 100%. I bat-teri lattici presentavano una sensi-bile resistenza al rame. Tuttavia tale effetto è di poco interesse in quan-to i batteri lattici non sono patoge-ni e quindi la loro persistenza, sep-pur ridotta del 60%, non crea pro-blemi di alcuna sorta, né nei con-fronti del fruitore della carta né a livello ambientale. Dai dati sem-bra che il lotto della carta influen-zi la riduzione. Tuttavia la differen-za riscontrata tra i lotti può essere ascritta prevalentemente alla ma-nualità dell’operatore e alle condi-zioni dei microrganismi al momento del loro utilizzo. In ogni caso indi-pendentemente dal lotto, le diver-se carte metallizzate utilizzate han-no inattivato i microrganismi messi a contatto. Anche nel caso dell’im-piego di carte non metallizzate si è osservata una leggera riduzione della popolazione microbica ino-culata. In questo caso la causa può essere ascritta anche alla manuali-tà e al recupero delle cellule inocu-late “a secco” da parte dell’operato-re. È accettata una perdita di cellule intenzionalmente inoculate “a sec-co” durante il loro recupero da sub-strati inerti o organici. In alcuni casi tale perdita può essere superiore al

20%. L’inoculo “umido”, in sospen-sione, sulle carte non metallizzate (-Cu) causava una riduzione mas-sima del 5% dei microrganismi ino-culati. Infatti nella parte dell’esperi-mento che implicava l’aggiunta del-le cellule microbiche in sospensio-ne alla carta non metallizzata, si os-servava un completo recupero del-le stesse.

Discussione Il rame è un elemento essenzia-

le per gli esseri viventi, ma può an-che essere utilizzato come antimi-crobico da contatto per igienizza-re superfici in ospedali e industrie alimentari (Grass et al., 2011). Del resto, da centinaia di anni, l’attivi-tà antimicrobica del rame è stata sfruttata in medicina. Recentemen-

Tabella 2 - Riduzione microbica in carta metallizzata (+Cu) e non (-Cu) dopo 24 h a 20±2°C.

Specie Riduzione

+ Cu - Cu

Aspergillus niger 90% 25% Bacillus cereus 92% 27% Bacillus subtilis 100% 45% Coliformi 90% 6% Escherichia coli 100% 31% Kluyveromyces marxianus 88% 5% Lactobacillus casei 75% 1% Lactobacillus rhamnosus 65% 5% Listeria monocytogenes 97% 11% Penicillium nalgiovense 92% 5% Pseudomonas fluorescens/cepacea 100% 15% Saccharomyces cerevisiae 95% 21% Salmonella enteritidis/typhimurium 100% 33% Salmonella escabana 100% 15% Shewanella putrefaciens 100% 7% Staphylococcus aureus 99% 23% Staphylococcus carnosus 100% 26% Staphylococcus xylosus 95% 4%

Carta +Cu : lotti 5,6,7 – Carta –Cu lotti 10,11;

te è stato dimostrato che il rame può essere molto attivo nel con-trollo di patogeni quali Escherichia coli nell’industria alimentare (Noyce et al., 2006).

Infatti, nel 2008, la Environ-ment Protection Agency of the United States (EPA) ha approvato l’uso del rame per decontaminare microrganismi da superfici, ricono-scendogli proprietà antibatteriche. Tale attività dipende dal contatto del rame tra i batteri e le superfici che rilasciano rame in forma ioni-ca. L’effetto killer può ulteriormen-te essere potenziato e influenzato da diversi fattori quali la tempera-tura, l’umidità, la specie batterica, il tipo di contatto fra il microrgani-smo e la superficie e lo stato di os-sidazione del rame (Mathews et al., 2016; Vincent et al., 2016; Blei-chert et al., 2014). L’azione antimi-crobica si esplica attraverso il con-

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tatto degli ioni rame con le mem-brane batteriche; contatto che ge-nera una perdita del potenziale re-dox della membrana stessa e con-seguentemente di materiale cito-plasmatico. Ciò provoca anche la produzione di perossidi che dan-neggiano le strutture cellulari e la degradazione del DNA (Grass et al., 2011; Luo et al., 2017).

Pertanto gli ioni rame rilascia-ti dalle superfici, come in questo caso dalla carta metallizzata, ridu-cono la carica microbica di diversi microrganismi patogeni, come am-piamente dimostrato da altri auto-ri per Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica e Listeria monocytogenes (Wilks et al., 2006; Gyawali et al., 2011; Zhu et al., 2012; Yoon et al., 2007). In tali studi, in verità, non è mai sta-ta valutata l’influenza della matri-ce in cui si trovano gli ioni rame e della presenza di altri micror-ganismi, che interagiscono con i batteri target. Ad esempio non è mai stata valutata l’influenza del rame su Enterobacter cloacae, spe-cie frequentemente isolata da car-ni avicole e tipica di queste carni (Hinton et Ingram, 2000), nono-stante sia stato spesso suggerito l’impiego del rame per decontami-nare ambienti e superfici di inte-resse alimentare e nonostante si ritenga che tale attività possa es-sere ridotta a causa della matrice alimentare, che è organica e non inerte (Parra et al., 2018). Questi autori hanno studiato l’effetto del rame verso due patogeni frequen-temente associati alle carni avico-le, Salmonella Enteritidis and Liste-ria monocytogenes, tenendo pre-sente l’impatto di questa matrice e dei microrganismi competitori, rappresentati da Enterobacter clo-acae, sull’attività antimicrobica del rame. I risultati hanno dimostrato che il rame presente su superfici

inerti o contaminate con materiale organico, riesce a ridurre la popo-lazione microbica presente. Tutta-via è stato confermato che la ma-trice organica può ridurre la sua capacità di inattivare microrgani-smi patogeni e non. In base a que-sti dati, Parra et al., (2018) han-no suggerito il potenziale ruolo del rame nella decontaminazio-ne di microrganismi da superfi-ci inerti o contaminate da compo-sti organici di industrie avicole. Al-tri autori hanno valutato gli effet-ti del rame nei confronti di micror-ganismi di interesse alimentare e in diverse matrici. Akhidime et al., (2019), in un lavoro inteso a valu-tare l’azione antimicrobica di ioni metallici, hanno dimostrato che il rame e lo zinco mostravano una maggiore propensione a lisciviare dai substrati in cui sono intrappo-lati rispetto agli ioni argento, tita-nio, ferro, molibdeno.

Il silicio, ad esempio aveva scar-sa attività proprio a causa della sua incapacità di lisciviazione. Infatti proprio grazie all’effetto liscivian-te, il rame ha dimostrato il maggio-re potenziale antimicrobico segui-to dall’argento e dallo zinco e dal titanio. Ciò dimostra la veridicità dei dati ottenuti con la carta me-tallizzata del test oggetto in questa sperimentazione. L’attività antimi-crobica del rame è stata dimostrata anche da Sengan et al., (2019), at-traverso un preparato a base di na-noparticelle di rame stabili (CuNP). Tali complessi hanno dimostrato la capacità di sradicare i biofilm for-mati da patogeni trasmessi da ac-que contaminate e un’eccellente attività anti-biofilm nei confron-ti di patogeni come Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Sal-monella typhi e Shigella flexneri. Lo studio basato sulla microscopia ot-tica, a fluorescenza e microscopia elettronica a scansione (SEM) ha

rivelato che le CuNPs eliminano il biofilm maturo alla concentrazione minima di eradicazione del biofilm di 12,5 μM. L’attività antimicrobica ottimale dei CuNP è stata osserva-ta alla concentrazione minima ini-bitoria di 25 μM, indicando che i CuNP segnalati mostrano un vero effetto anti-biofilm.

La microscopia a fluorescenza e lo studio SEM hanno dimostra-to che le CuNP uccidono i batteri attraverso il danneggiamento del-la membrana. Conseguentemen-te hanno suggerito l’impiego di CuNP per la pulizia del biofilm for-mato su contenitori di stoccaggio. Recentemente Wang et al., (2019) hanno valutato l’azione antimicro-bica del rame, tenendo presente che la potenziale lisciviazione do-vuta agli agenti impiegati e il bio-accumulo di ioni di rame possono causare gravi contaminazioni am-bientali e problemi irreversibili sul-la salute. Pertanto, hanno speri-mentato l’uso di CuAl2O4, che ol-tre ad essere più stabile e ad ave-re un’azione di lisciviazione mino-re rispetto alle superfici trattate con ioni rame, ha dimostrato un’e-levata attività antibatterica verso Escherichia coli, senza il rischio di contaminare l’ambiente con que-sto metallo.

Precedentemente anche War-nes et al. (2012) hanno analizzato l’effetto antimicrobico di una su-perficie in lega di rame al 99,9% per Salmonella Typhimurium, os-servando una riduzione di 7 log dopo un’esposizione di 5 min. Ri-sultati simili sono stati raggiunti da Espírito Santo et al., (2008). Questi hanno mostrato una riduzione di 9 log di E. coli dopo 1 min di esposi-zione su superfici che erano coat-tate al 99% di rame. In entrambi i casi, la morte dei batteri è savve-nuta in pochi minuti dal contatto. Stessi risultati sono stati ottenuti

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nei confronti di Salmonella e Liste-ria inoculate su superfici che erano coattate all’89% con rame. Al con-trario, L. monocytogenes è soprav-vissuta per più di un’ora su superfi-ci coattate al 90% con rame (Wilks et al., 2006). Tempi di soppraviven-za più lunga oltre 4 h, è stata os-servata in seguito all’esposizione di S. enterica e Campylobacter jeju-ni su fogli di rame.

Negli studi sull’esposizione al rame, uno dei fattori più importan-ti associati al tempo di morte mi-crobico, è il terreno scelto per so-spendere i microrganismi in prova. In generale, i tempi di morte bat-terica più brevi si osservano quan-do i batteri sono sospesi in acqua tamponata priva di materiale nu-tritivo organico (Parra et al., 2018). Al contrario, la presenza di mate-riale organico posticipa di un’ora l’effetto riduttivo del rame. Secon-do Parra et al., (2018) ciò è dovuto alla presenza di sostanze chelan-ti il rame nei terreni sintetici; so-stanze che riducono l’attività anti-microbica delle superfici di rame. Infatti, Parra et al., (2018) avevano osservato tempi di morte batteri-ca più lunghi quando le superfici di rame erano “sporcate” con mate-riale organico e quindi una mino-re riduzione.

Sebbene il motivo per tassi di sopravvivenza più alti in presenza di materia organica non sia chiaro, si ritiene che composti come pro-teine o carboidrati possano chela-re il rame, che pertanto non può danneggiare le membrane e le pa-reti cellulari (Hans et al., 2013; Zhu et al., 2012). Tale ritardo dell’effet-to inattivante del rame non è stato osservato nel nostro esperimento sia quando l’inoculo consisteva in una sospensione batterica in mez-zo liquido contenente materiale organico (peptone), sia quando l’i-noculo era eseguito a secco.

Conclusione In base ai dati della letteratura

sopracitati e ai dati ottenuti in que-sto lavoro è stata dimostrata l’effica-cia della carta coattata con rame per ridurre o eliminare completamente da una superficie la presenza di mi-crorganismi patogeni e non di inte-resse alimentare. In particolare è sta-to dimostrato che la presenza dell’ac-qua nella sospensione batterica ino-culata, favorendo la lisciviazione del rame, ha incrementato l’effetto del-lo stesso nei confronti dei microrga-nismi considerati. Nel caso dell’ino-culo “umido” (sospensione in acqua peptonata) la riduzione è stata del 100% indipendentemente dal lotto della carta metallizzata e dal micror-ganismo saggiato. La riduzione è sta-ta eccellente anche quando l’inoculo era eseguito a secco, tramite tampo-ne. In questo caso, però, l’effetto di-pendeva strettamente dal microrga-nismo e dal lotto di carta metallizzata utilizzata. Pertanto, in base a questi risultati e ai fini di salvaguardarne l’i-gienicità, si suggerisce di conservare prodotti alimentari in un imballo se-condario costituito da carta ricoperta di rame. In particolare considerando che gli acquisti di prodotti preconfe-zionati o confezionati presso i nego-zi e i supermercati possano veicola-re microrganismi anche patogeni de-rivanti da contaminazione ambienta-le e umana, si suggerisce l’impiego di un imballaggio secondario costituito da carta coattata con rame proprio ai fini di eliminare e/o contenere que-sta contaminazione. Si ricordi che i microrganismi contaminanti gli im-ballaggi possono poi diffondersi negli ambienti di casa nostra e nei nostri frigoriferi, che diventando a loro vol-ta “untori”, producono contaminazio-ni crociate. L’impiego di carta coatta-ta rame sembra in grado di limitare o eliminare queste contaminazioni.

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industrie alimentari - LIX (2020) - gennaio

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