ANALISI MOLECOLARE DEL GENOMAANALISI MOLECOLARE DEL GENOMA

MAPPA GENETICAMAPPA GENETICA:un set ordinato di geni sul cromosoma, la distanza tra i quali è espressa in unità di ricombinazione genetica (centimorgan)

MAPPA FISICAMAPPA FISICA:un set ordinato di frammenti di DNA sul cromosoma, la distanza tra i quali èespressa in unità fisiche (paia di basi).

Come sono disposti i geni nel genoma?Come sono disposti i geni nel genoma?

Costruzione di una mappa geneticaCostruzione di una mappa genetica� analisi delle frequenze di ricombinazione

Le tecniche che utilizziamo per costruire una mappa genetica umana si basano tutte sull’associazione associazione geneticagenetica:mappe genetiche = mappe di associazione

Uso di marcatori molecolari.

Locus genico

marcatore

MARCATORE GENETICOMARCATORE GENETICO

Qualsiasi carattere polimorficopolimorfico mendelianomendeliano (presenti in due forme alleliche) che può essere impiegato per seguire l’ereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero genealogico

NB:

I geni sono marcatori utili ma non sono i marcatori ideali:

- solo una frazione dei geni è presente con due forme alleliche distinguibili in modo semplice (fenotipi)

- i geni sono spaziati da vaste interruzioni

Es. di marcatori molecolari sono RFLPRFLP, STRSTR, VNTRVNTR, SNPSNP

POLIMORFISMOPOLIMORFISMO

I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in

una popolazione con una frequenza maggiore dellfrequenza maggiore dell’’1%.1%. Quando la

frequenza e' inferiore a tale valore arbitrario, si preferisce parlare di

varianti genetiche rare, che in molti loci sono presenti in aggiunta ai

polimorfismi.

Quando l’allele più comune in tutta la popolazione rappresenta:

• meno del 99% � POLIMORFISMO

• più del 99% � MUTAZIONE

� Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione

(RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism)

� Polimorfismi di lunghezza di sequenze semplici

(SSLP, Simple Sequence Length Polymorphism)

� Polimorfismi di singoli nucleotidi

(SNP, Single Nucleotide Polymorphism)

SNPSNPPolimorfismi di singoli nucleotidiPolimorfismi di singoli nucleotidi

• Singole mutazioni puntiformi presenti in gran numero nel genoma. • Solo alcune producono RFLP • Nel genoma umano sono stati identificati oltre 10 milioni di SNP• Ogni SNP ha solo 2 alleli proprio perché originato da mutazione puntiforme

Vantaggi degli SNP come marcatori: sono abbondanti e possono essere individuati con tecniche che non utilizzano elettroforesi

Analisi di singoli SNP mediante ibridazione con Analisi di singoli SNP mediante ibridazione con oligonucleotidioligonucleotidialleleallele--specifici (ASO)specifici (ASO)

Tm = (4 x GC) + (2 x AT)

Ibridazione di un Ibridazione di un oligonucleotideoligonucleotide::

NB: NB: affinchaffinchèè una variazione nella sequenza nucleotidica una variazione nella sequenza nucleotidica

sia considerata uno SNP, deve essere presente in sia considerata uno SNP, deve essere presente in

almeno lalmeno l’’1% della popolazione!1% della popolazione!

SNP: modificazione di siti di restrizione SNP: modificazione di siti di restrizione �������� RFLPRFLP

RFLP: RFLP: Polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizionePolimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione

Sono stati i primi marcatori molecolari ad essere studiati

1) Presenza o assenza di un sito di restrizione in due sequenze 1) Presenza o assenza di un sito di restrizione in due sequenze allelichealleliche

(causata da SNP)(causata da SNP)

- 105 RFLP nel genoma umano

- ovviamente solo 2 alleli per RFLP (c’è o non c’è il sito)

2) Generazione di frammenti di diversa lunghezza (dovuta a prese2) Generazione di frammenti di diversa lunghezza (dovuta a presenza di nza di

sequenze ripetute, inserzioni o sequenze ripetute, inserzioni o delezionidelezioni))

A1A1

A2A2

A2A2

A1A1

Tecniche per identificare RFLP:Tecniche per identificare RFLP:

1) Southern Blotting1) Southern Blotting

2) PCR + 2) PCR + digestionedigestione con con enzimaenzima didi restrizionerestrizione

A2A2

A1A1

sondasonda

1) Southern Blotting1) Southern Blotting

2) PCR2) PCR

A2A2

A1A1

Primer 1Primer 1

Primer 2Primer 2

Primer 1Primer 1

Primer 2Primer 2

Primer 2Primer 2

NB: la posizione di un RFLP sulla mappa genomica è dedotta seguendo l’ereditarietà dei suoi alleli, come per i geni.

A1A1

A2A2

A1A1 A2A2 A1A2A1A1 A2A2 A1A2 A1A2 A1A2 A1A2A1A2 A2A2 A1A2 A1A1A2A2 A1A2 A1A1

A2A2

A1A1

SSLP: SSLP: Polimorfismi di lunghezza di sequenze sempliciPolimorfismi di lunghezza di sequenze semplici

Sequenze ripetute che contengono quantità diverse di unità ripetitive nei differenti alleli e quindi mostrano lunghezze diverse

Possono essere multiallelici (per ogni SSLP più di due varianti alleliche)

Ci sono due tipi di SSLP:-i minimini--satellitisatelliti= ripetizioni a tandem a numero variabile (VNTRVNTR) Le unità ripetitive sono lunghe 15-100 nucleotidi e coprono sequenze di 1-5 kb

-i micromicro--satellitisatelliti= ripetizioni a tandem semplici (STRSTR)Le unità ripetitive sono di di- o tetra-nucleotidi

STR (Short Tandem STR (Short Tandem repeatsrepeats))regioni regioni ipervariabiliipervariabili del DNA costituite da sequenze del DNA costituite da sequenze di 2di 2--6 nucleotidi ripetute in tandem6 nucleotidi ripetute in tandem

Nel genoma umano:Nel genoma umano:128000 STR 128000 STR dinucleotidicidinucleotidici8740 STR 8740 STR trinucleotidicitrinucleotidici23680 STR 23680 STR tetranucleotidicitetranucleotidici4300 STR 4300 STR pentanucleotidicipentanucleotidici230 STR 230 STR esanucleotidiciesanucleotidici

Sequenze relativamente corteSequenze relativamente corte�� rilevabili per PCRrilevabili per PCR

2 varianti alleliche

VNTR (VNTR (VariableVariable NumberNumber Tandem Tandem RepeatsRepeats))

Sequenze anche molto lunghe Sequenze anche molto lunghe �� rilevabili per rilevabili per SouthernSouthern BlotBlot::-- sonde sonde a locus singolo a locus singolo (un solo locus VNTR nel genoma)(un solo locus VNTR nel genoma)-- sonde sonde multilocimultiloci (molte copie di un locus VNTR disperse nel genoma)(molte copie di un locus VNTR disperse nel genoma)

Un taglio nei siti di restrizione fiancheggianti la ripetizione Un taglio nei siti di restrizione fiancheggianti la ripetizione produce produce un unico frammento, di lunghezza specifica per ogni alleleun unico frammento, di lunghezza specifica per ogni allele

Uso di un VNTR come marcatore del DNAUso di un VNTR come marcatore del DNA

“eterozigote” “omozigote”

Southern Blotting

Multi-loci Singolo locus

Da frammenti di restrizione o da amplificato per PCR

ConfrontaConfronta!!

I I polimorfismipolimorfismi sonosono alleliciallelici e e vengonovengono ereditatiereditati in in modomodo mendelianomendeliano

6 alleli (A1�A6) sono presenti in questo albero genealogico, ma ogni individuo può avere un solo tipo di allele (se omozigote) o due (se eterozigote).

RFLP associati a malattie genetiche:

- all’interno del gene � alterazione del sito per DdeI nel gene per

la ββ--globinaglobina (anemia anemia falciformefalciforme)

- in sequenze fiancheggianti � alterazione del sito HpaI nel gene

per la fenilalaninafenilalanina idrossilasiidrossilasi (fenilchetonuriafenilchetonuria)*

- DNA ripetuto (triplette) all’interno del gene (CoreaCorea didi HuntingtonHuntington)

o in sequenze regolative (sindromesindrome delldell’’XX--fragilefragile)

* Il polimorfismo RFLP al 3’ del gene segrega con il gene stesso (tranne nel caso di

ricombinazione o mutazione de novo)

Confronta e Confronta e riflettirifletti……

genegene

genegene

genegene

genegene

A1A1

A2A2

A2A2

A1A1

genegene

genegene

A1A1

A2A2

genegene

genegeneA2A2

A1A1

Es. Anemia falciforme

Es. Corea di Huntigton

Costruzione di una mappa genetica Costruzione di una mappa genetica

utilizzando i marcatori molecolariutilizzando i marcatori molecolari

Uso dei polimorfismi di restrizione (RFLP)Uso dei polimorfismi di restrizione (RFLP)per determinare le associazioniper determinare le associazioni

RFLP A, B, C (RFLP A, B, C (aplotipiaplotipi))

Es. associazione RFLP e Corea di Es. associazione RFLP e Corea di HuntingtonHuntington

Es. Corea di Huntington, autosomica dominante � ipotetici pedigree

RFLP A, B, C (RFLP A, B, C (aplotipiaplotipi))

HH allele mutato dominante

h h allele normale recessivo

(a) Il gene responsabile della malattia e gli alleli RFLP non sono strettamente associati

(b) Il gene responsabile della malattia e gli alleli RFLP sono strettamente associati (il figlio che

eredita l’allele RFLP C, è malato)

DNA tagliato con HindIII, sonda utilizzata specifica per il chr.8 � il gene H mappa sul chr.8

Uso dei polimorfismi del DNA per lUso dei polimorfismi del DNA per l’’analisi genetica:analisi genetica:

�� Posizionamento geniPosizionamento geni--malattiamalattia

�� Test molecolari per mutazioni associate a malattie geneticheTest molecolari per mutazioni associate a malattie genetiche(es. Corea di Huntington e anemia falciforme)

�� Tipizzazione del DNATipizzazione del DNA�������� DNA DNA fingerprintingfingerprinting

Tipizzazione del DNA(DNA fingerprinting)

Tipizzazione del DNATipizzazione del DNA(DNA (DNA fingerprintingfingerprinting))

In passato, i sistemi più utilizzati in ambito forense sono stati:

� i polimorfismi degli antigeni eritrocitari dei sistemi AB0, MN, Rh, Duffy, etc� i polimorfismi degli antigeni leucocitari del sistema HLA� altri

Oggi:

� SNP� STR � VNTR � RFLP� polimorfismi del cromosoma Y � polimorfismi del DNA mitocondriale

STR (STR (microsatellitimicrosatelliti):): analisi di un singolo locusanalisi di un singolo locusE’ stato stimato che l’analisi di 13 loci STR sono sufficienti ad identificare

univocamente una persona su tutta la popolazione mondiale

VNTR (minisatelliti):VNTR (minisatelliti): analisi di un singolo locus o analisi di un singolo locus o multimulti--lociloci

PolimorfismiPolimorfismi sulsul cromosomacromosoma YY � utili per le esclusioni di paternità(trasmissione patrilineare e assenza di ricombinazione) e per distinguere numero di soggetti maschili coinvolti in un crimine

PolimorfismiPolimorfismi del DNA del DNA mitocondrialemitocondriale � utili per individuazione diparentele (trasmissione matrilineare ma alta eterogeneità)

Per attribuzione di Per attribuzione di paternitpaternità…………à…………..

Mediante Mediante SouthernSouthern BlottingBlotting……..

Sonda STR o VNTRSonda STR o VNTRSonda STR o VNTR

Interpretazione di Interpretazione di ““inclusioneinclusione””!!

Per la prova di paternitPer la prova di paternitàà occorre:occorre:

- usare altre sonde polimorfiche (almeno 5 diverse e combinate)

- analizzare la frequenza di quel polimorfismi nello specifico gruppo etnico

M B P1 P2

Un caso di attribuzione di Un caso di attribuzione di paternitpaternitàà

Sonda Sonda multimulti--lociloci

�Se il profilo genetico del figlio e del padre presunto differiscono per due o più caratteristiche genetiche l'l'esclusioneesclusione èè certacerta (0% diprobabilità di essere il padre biologico).

�Nel caso di un’attibuzioneattibuzione di paternità viene effettuata un’analisistatistica dei risultati (percentualepercentuale didi attribuzioneattribuzione tanto più prossimaal 100% quanto maggiore sarà il numero di regioni del DNA analizzate)

NB: L'esame di 1515 regioni STR generalmente consente di raggiungereuna percentuale di attribuzione (probabilitprobabilitàà didi paternitpaternitàà) superioreal 99,99%*99,99%*.. Questo valore probabilistico indica che il padre presunto è praticamente il padre biologico.

*La probabilità finale di paternità non potrà mai raggiungere il valore del 100% matematico, dato che i microsatelliti hanno una frequenza relativamente elevata dimutazioni (in media ogni 1000-10.000 meiosi).

In medicina forense In medicina forense �������� iidentificazione dentificazione del colpevole di un criminedel colpevole di un crimine

Il Il Il Il casocasocasocaso in cui in cui in cui in cui ilililil DNA DNA DNA DNA scagionascagionascagionascagiona un un un un innocenteinnocenteinnocenteinnocenteCharles Chatman - accusato di reatosessuale nel 1981; il test del DNA ha rivelato la sua innocenza dopo 27 anni di carcere.

vittima

campione

1 2 3

sospettiMediante Mediante SouthernSouthern BlottingBlotting……

……ee mediante PCR.mediante PCR.