ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture...

ADENOVIRUS1953 identificazione di un virus come causa del processo

degenerativo di colture cellulari derivate da adenoidi umane

1954 dimostrazione di effetto citopatico in colture di tessuto infettate con secrezioni dell’apparato respiratorio

1956 studi epidemiologici confermano l’origine virale dell’agente eziologico delle malattie acute dell’apparato respiratorio.

Virus simili causano congiuntiviti e gastroenteriti infantili

più di 100 membri

ADENOVIRIDAE

Sottogruppi Tropismo cellulare Sierotipi A tratto GI 12, 18, 31 B polmoni, tratto urinario 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50 C alte e basse vie dell’apparato respiratorio 1, 2, 5, 6 D tratto GI, occhi 8,10, 13, 15, 17, 19, 20, 22,30,

32, 33, 36,39, 42,49, 51 E tratto respiratorio 4 F-G tratto GI 40, 41

Adenovirus umani

virus generalmente poco patogeni

infezioni lievi ed autolimitanti

QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.

STRUTTURA DEGLI ADENOVIRUS

Capside (252 capsomeri)

proteina VI ancora l’anello di esoni che circondano ipentoni con il coreproteina VIII ancora gli esoni delle facce al core

proteina IIIA esoni che circondano i pentoniproteina IX esoni delle facce

Core : ds DNA - covalentemente legato alla proteina TP- complessato alla proteina VII

proteina X (proteasi)proteina V core

proteasi

70-100 nm

240 esoni : trimeri di proteina II

12 pentoni : Base (pentameri di proteina III) Fibra (trimeri di proteina IV)

70-90 nm

Il GENOMA degli ADENOVIRUS

sequenza di impacchettamento

(ds DNA: 30-36 Kb)

ITR ITR

regioni di controllo trascrizionalesiti di legame per fattori trascrizionali e proteine enhancer cellulari : NF-I e Oct-I

regione ORI (replicazione del genoma)

SEQUENZE ITR (100bp)

Penetrazione di Adenovirus

• entrata mediata da endocitosi clatrina-dipendente

• Perdita delle fibreLisi della membrana degli endosomi mediato dalla proteina della base dei pentoni

• A livello dei pori nucleari la struttura capsidica subisce un disassemblaggio parziale :

- perdita dei pentoni III e della proteina IIIa

- dissociazione della proteina VIII

- degradazione proteolitica della proteina VI da parte della proteasi presente nel virione (adenina)

- perdita della proteina IX

pH

PENETRAZIONEDEL GENOMA


liberazione del DNA virale complessato alla proteina VII

ESPRESSIONE GENICA degli ADENOVIRUS

E- geni precociL- geni tardivi

geni precocigeni tardivi 50 proteine

I GENI PRECOCI

ITR E1A/B E2A/B ITRE3 E4

GENE E1A

progressione del ciclo cellulare- legame con pRb (Retinoblastoma tumor suppressor protein)

trans-attivatori trascrizionali di geni virali e cellulari

mRNA 13S proteina 289RmRNA 12S proteina 243R

induzione di apoptosi- stabilizzazione di p53

Ruolo di pRb nella regolazione della proliferazione cellulare

E1A

p14

E1A

E1A

GENE E1A

Alterano la progressione del ciclo cellulare:

trans-attivatori trascrizionali

Stimolano la replicazione del DNA virale

Bloccano la risposta ci difesa cellulare:- inibizione di STAT1- inibizione di IKK

mRNA 13S proteina 289RmRNA 12S proteina 243R

Proteine E1B

55 kDa - lega, inibisce e induce la degradazione di

p53

19 kDa - omologo di Bcl2 (inibisce oligomerizzazione di Bax

Stabilizzazione, esporto e traduzione preferenziale dei trascritti virali.

Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite.

CAR

E1A pRB

geni proliferativi

E1B55kd

p53geni pro-apoptotici

IB

NF-B

rispostainnata

E1A

E1B19kd

integrine

MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE

ESPRESSIONE GENICA

ITR E1A/B

L5

E2A/B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VA

E4

E2A - ssDBP)E2B - pTP (80KDa) e DNA polimerasi virale

replicazione del DNAtrascrizione dei geni late in sinergia con fattori trascrizionali

ESPRESSIONE GENICA

ITR E1A/B

L5

E2A/B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VA

E4

proteine che regolano la risposta della cellula ospite all’infezione

ESPRESSIONE GENICA

ITR E1A/B

L5

E2A/B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VA

E4

proteine che regolano la trascrizione del virus e promuovono lo shut-off della sintesi proteica cellulare

Virus-Associated (VA) RNA

VAI

1 o 2 trascritti lunghezza: 200 basicodificati dalla Polimerasi IIIdella cellula ospite VA

- mantenimento della sintesi proteica


- inibizione delle difese anti-virali

inibizione della dimerizzazione di PKR

CICLO DI

REPLICAZIONE

REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori

La sequenza Ori:sequenza ricca di AT per facilitare lo srotolamento del DNA localizzata vicino a regioni di legame di fattori trascrizionali

(aumento dell’efficienza di replicazione)

proteina TP legata al terminale 5’ di ogni filamento

REPLICAZIONE DEL DNA DI ADENOVIRUS la sequenza Ori

- la Polimerasi forma un legame fosfodiesterico tra dCMP e pre-TP

il legame di NF-1 e Oct-1 alla sequenza ausiliaria facilita la formazione del complesso

reclutamento della Polimerasi virale e della proteina pre-TP sulla sequenza core

- il 3’OH di dCMP serve da innesco per la sintesi del DNA complementare

Replicazione del DNAReplicazione del DNA

From Flint et al. Principles of Virology (2000), ASM Press

l’elica di DNA dislocata forma un “panhandle” via gli “inverted terminal repeats”

associazione Pol-pre-TP e ……

sintesi del filamento complementare

I geni intermedi o precoci-ritardati

gene IX = proteina IX stabilizzazione del capside virale

gene IVa2 = proteina IVa2 transattivazione del promotore dei geni L in associazione con L1 52/55 ed E1Aincapsidamento del DNA virale nei capsidi neoformati


esone

trimeri di pIX

ESPRESSIONE DEI GENI TARDIVI

ITR E1A/B

L5

E2A/B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VA

E4

promotore MLPL1 L2 L3 L4 L5

E1AMLTF

IVa52 kd

unico trascritto viene processato per formare circa 18 mRNA con estremità 5’ identiche, divisi nei 5 gruppi L

proteine strutturaliproteine scaffoldproteasi

E4orf6 (34KDa)

E1B

55KDa

accumulo citoplasmatico di mRNA virali

RNAbinding

NES

blocco del trasporto di mRNA cellulari al citoplasma

?

TRADUZIONE PREFERENZIALE DI mRNA L

Per vedere questa immagineoccorre QuickTime™ e un

decompressore GIF.

trasporto facilitato

fattore cellulare

TRADUZIONE PREFERENZIALE

nelle fasi tardive dell’infezione blocco della sintesi proteica della cellula ospite


eIF4F

m7G

Ad virus (shutoff proteins : L ed E proteins)

tutti gli mRNA Late contengono una sequenza di 200 nucleotidi al 5’ (tripartite leader) che permette il ribosome shunting

L1 - polipeptidi 52/55 kDa e IIIaL2 - polipeptide III (base dei pentoni)L3 - polipeptide II (esoni) e proteasiL4 - polipeptide 100 kDaL5- polipeptide IV (fibre)

TRADUZIONE PREFERENZIALE

Assemblaggio di adenovirus

proteine singole (no poliproteina)

ruolo critico della proteina L1(funzione scaffold ?)

citoplasma- formazione dei trimeri di proteina II (esoni). Funzione essenziale della proteina L4.

- formazione dei pentameri di proteina III (pentoni)- formazione dei trimeri diproteina IV (fibre)

formazione di capsidi vuoti

nucleo

disaggregazione del citoscheletro della cellula ospite (L3 proteasi)

E3 - death protein (meccanismo sconosciuto)

RILASCIO DEL VIRUS


Adenovirus terapeutici

TERAPIA GENICA

introduzione del gene esogeno nella cellula “malata”

- correzione del difetto genetico

- trasformazione di pro-drug

- blocco del processo tumorale

espressione della proteina


Il DNA si degrada velocementeSistemi di veicolazione del DNA

Per proteggere il DNA è necessario utilizzare dei sistemi di veicolazione

Meccanismi non viraliliposomipolimeri cationicielettropazionemicro-iniezione

ottima protezione del DNAbuona efficienza e specificitàpossibile rischio di infezione reazioni immunitarie

buona protezione del DNAbassa efficienza, nessuna specificitàassenza di rischio e direazioni immunitarie

Meccanismi virali

infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione

ADENOVIRUS

VETTORI PER TERAPIA GENICA

1) sicurezza2) alta infettività e selettività 3) espressione sostenuta del gene terapeutico

VETTORI ADENOVIRALIinserimento del gene terapeutico mediante ricombinazione omologa

(quantità massima di DNA trasportato :2-3 kb)

ITR E1A/BL5

E2B ITRE3L1 L2 L3 L4

VAE4

genoma virale

genoma virale

ITR E1A/B

transgene vettore navetta

ITRL5

E2B ITRE3L1 L2 L3 L4

VAE4

vettore adenovirale

transgene

ricombinazione

293 cell

La produzione dei vettori adenovirali avviene in cellule della linea cellulare HEK293)

E1A

E1BITR

L5

E2B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VA

E4transgene

nucleo

lisi

VETTORI ADENOVIRALITrials iniziali per il trattamento della fibrosi cistica (CF)

- bassa efficienza di transfezione (le cellule transfettate - distrutte dall’infezione virale)

-bassa efficienza di espressione genica

- potente risposta immunitaria

-un esito mortale

(danno cerebrale dovuto a reazione infiammatoria scatenata dalle elevate quantità di vettore virale

somministrato)

Attualmente non sono utilizzati in trialsdi terapia genica nell’uomo

però………la sperimentazione continua

VETTORI ADENOVIRALI

VETTORI ADENOVIRALI VUOTI o AD ALTA CAPACITA’

genoma virale plasmidico

ITR

transgene vettore navetta

ITR E2A/B ITR

L1 L2 L3 L4

VAE4

transgene

E2A/B ITR

L1 L2 L3 L4

VA

E4

promoter

ricombinazione in cellule 293

promoter

ITR E2B ITRtransgenepromoter

taglio mediato da Cre

loxP

L5

L5

La replicazione dei vettori adenovirali ad alta capacitàavviene in presenza di un costrutto “helper”

ITR E2B ITR transgenepromoter

ITR E2A/B ITR

L1 L2 L3 L4

VA

E4

L5

lisi

cellulare

Vantaggi: infezioni lievisicurezza (assenza di integrazione e/o oncogenicità)infezione di cellule in divisione e restingfacile manipolazione alta capacità (35 kbp)espressione sostenuta del gene terapeutico (circa 80 giorni)

VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’

Limitazioni:contaminazione da helper (in produzioni su larga scala)bassa resascarsa stabilità


TERAPIA GENICA CON VETTORI ADENOVIRALI AD ALTA CAPACITA’

Distrofia muscolare (sindrome di Douchen)

Fibrosi cistica QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)sono necessari per visualizzare quest'immagine.

ADENOVIRUS ONCOLITICI

ADENOVIRUS Onyx - 015 (dl1520)

ITR E1A/B

L5

E2A/B ITRE3

L1 L2 L3 L4

VAE4

genoma Ad

** non esprime E1B 55K

– delezione di 827-bp nel gene E1B

e parte della regione E3 (gp19K)

ADENOVIRUS dl1520

replica solo in cellule difettive per p53p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani

e nel 70% dei tumori della testa e del collo

trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa

tumorale)

ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture...

Documents

Transcript of ADENOVIRUS 1953 identificazione di un virus come causa del processo degenerativo di colture...