Perché fare diagnosi di laboratorio ? formulazione di una diagnosi eziologica non diagnosi di...
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Perché fare diagnosi di laboratorio ?
• formulazione di una diagnosi eziologicanon diagnosi di polmonite ma polmonite da adenovirus…
• adozione di una terapia mirata
• individuazione dei casi sentinella in occasione di epidemie
• scopi epidemiologici
Diagnosi eziologica delle malattie virali (approcci)
dimostrazione nel materiale patologico dell’agente
infettivo o suoi componentiDiagnosi diretta
dimostrazione nell’organismo infettato di unarisposta anticorpale specifica
Diagnosi indiretta
diagnosi indiretta
Dimostrazione che è in atto una risposta immune all’agente infettivo
in genere valutando la dinamica anticorpale mediante reazioni sierologiche presenza IgM indice di infezione recente•rivelabili dopo 7-10 giorni dall’infezione•breve permanenza (2-3 mesi)Presenza solo IgG indice di infezione contratta in passato•rivelabili dopo 2-4 settimane dall’infezione •permangono per anni
Diagnosi indiretta
1. dimostrazione di anticorpi specifici della classe M (IgM) in un singolo campione di siero
2. dimostrazione di sieroconversione (negativo positivo) o di incremento del titolo anticorpale di almeno 4 volte in 2 campioni prelevati
• 1° - in fase acuta della malattia• 2°- in fase convalescente (2-3 settimane più tardi)
Diagnosi indiretta - saggi sierologici
• agglutinazione• precipitazione• fissazione del complemento• neutralizzazione• inibizione dell’emagglutinazione (virus emagglutinanti)
• IF immunofluorescenza• RIA radioimmunoassy• test immunoenzimatici ELISA, immunoblot
Inibizione della emagglutinazione
diluizioni scalari del siero in esame
+
quantità standard di unità
emagglutinanti del virus (incubazione)
+
sospensione di globuli rossititolo degli Ab inibenti
emoagglutinantinazione la più alta diluizione del siero capace di prevenire emoagglutinazione
Immunofluorescenza indiretta
cellule infettate da virus
siero in esame
legame
Anticorpi anti IgG o anti IgM umane-fluoreseceinati
ELISA
Test indiretto per le IgG
Ag virale
siero in esame (oppure diluizioni scalari del siero)
anti IgG umane-Enzima
substrato viraggio colore
immunoblot
Diagnosi indiretta: punti critici
• riattivazione di virus latenti
• pazienti immunodepressi
• difficoltà di disporre di un siero “acuto” o “convalescente”
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Tipo diTipo di metodometodoTipo diTipo di metodometodo
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
definizionedefinizionedefinizionedefinizioneDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponentiDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponenti
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
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Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Tipo diTipo di metodometodoTipo diTipo di metodometodo
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
definizionedefinizionedefinizionedefinizioneDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponentiDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponenti
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
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Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Tipo diTipo di metodometodoTipo diTipo di metodometodo
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
definizionedefinizionedefinizionedefinizioneDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponentiDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponenti
Isolamento in colture cellulari
allestimento delle colture in vitro
inoculazione del campione
incubazione
identificazione e tipizzazione del virus
Identificazione e tipizzazione dei virus
effetto citopatico (CPE)
caratteristiche antigeniche
sequenze genomiche
•degenerazione cellulare•cellule multinucleate o sincizi•formazione di inclusioni
tipo di cellule sensibilitempo di comparsavelocità di progressione dell’infezione
Inclusioni
Localizzazione• nucleo (adenovirus, herpesvirus)
• citoplasma (virus della rabbia, poxvirus)
• entrambi (CMV, paramixovirus)
Tipo• ammassi virioni (papovavirus)
• viroplasma (poxvirus)
• materiale cellulare proteico (adenovirus)
identificazione e tipizzazione dei virus
effetto citopatico (CPE)
caratteristiche antigeniche
sequenze genomiche
reazioni sierologiche
identificazione e tipizzazione dei virus
effetto citopatico (CPE)
caratteristiche antigeniche
sequenze genomiche•ibridazione con sonde molecolari
•reazioni di amplificazione
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
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Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Tipo diTipo di metodometodoTipo diTipo di metodometodo
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
definizionedefinizionedefinizionedefinizioneDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponentiDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponenti
Diagnosi diretta - ricerca degli antigeni
• agglutinazione• precipitazione• fissazione del complemento• neutralizzazione• emagglutinazione (virus emagglutinanti)
• IF immunofluorescenza• RIA radioimmunoassy• test immunoenzimatici: ELISA, immunoblot
Immunofluorescenza diretta
Anticorpi virus specifici -fluoreseceina
materiale patologico
IDENTIFICAZIONE DI ANTIGENE DI CITOMEGALOVIRUS SU LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI DEL LIQUOR MEDIANTE IMMUNOFLUORESCENZA CON ANTICORPO MONOCLONALE ANTI-pp65.
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Ricerca dei virioni al M.E.Ricerca dei virioni al M.E.
Ricerca dell’infettività viraleRicerca dell’infettività virale
Ricerca degli Ag viraliRicerca degli Ag virali
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Tipo diTipo di metodometodoTipo diTipo di metodometodo
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
Diagnostica virologicaDiagnostica virologicametodi direttimetodi diretti
definizionedefinizionedefinizionedefinizioneDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponentiDimostrazione del virus o suoi Dimostrazione del virus o suoi componenticomponenti
Ricerca del genoma virale
Quali virus ?
Ricerca del genoma virale
Quali virus ?
difficilmente o non coltivabili
(HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19, HAV)
a lento sviluppo
(CMV, BKV, JCV)
pericolosi da coltivare
(HIV)
emergenti
(TTV)
difficilmente o non coltivabili
(HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19, HAV)
a lento sviluppo
(CMV, BKV, JCV)
pericolosi da coltivare
(HIV)
emergenti
(TTV)
Ricerca del genoma viraleRicerca del genoma virale
Ibridazione
100 000 - 10 000 genomi
Ibridazione
100 000 - 10 000 genomi
amplificazione ibridazione
10 - 1 genomi
amplificazione ibridazione
10 - 1 genomi
Ibridazione con sonde
Tecniche quantitative
– Per distinguere infezione latente da infezione attiva
– Per il monitoraggio dell’infezione– Per il monitoraggio della terapia– Per valutare il rischio di trasmissione