3Replicazione e Mantenimento del Genioma

Il Gene - ediz.comp.

Biologia Molecolare

Modulo B – Cap. 6, (7), (8) 8.3Replic. semiconservativa

Repliconi proc. ed euc.

Sintesi semidiscontinua del DNA

L’apparato di replicazione

Trasposoni proc. e euc.

Retrotrasposoni e retrovirus

Cap. 1 1.8 1.10

Cap. 15 15.1 15.6

Cap. 16 16.1 16.7

Cap. 17 17.1 17.2

Cap. 18 tutto

Cap. 21 21.1 21.5 21.10 21.11

Cap. 22 22.1 22.5 22.7 22.12

Cap. 29 29.9

La sintesi di DNA da parte delle DNA polimerasi necessita di:

- DNA da replicare

- precursori nucleotidi trifosfati (NTP) :

Il DNA è sintetizzato sempre in direzione 5’ 3’

mai in direzione opposta

3’

5’

3’

3’5’

5’

5’

3’

PHO

POH

P P POH

3'5'

5'

PHO

POH

3'5'

5'3' + PP

Il DNA è sintetizzato sempre in direzione 5’ 3’

mai in direzione opposta

Le DNA polimerasi non sanno iniziare la sintesi di DNA su DNA a doppio o a singolo filamento

Da qui il problema della replicazione delle estremità 5’

ma sanno allungare una estremita 3’ di un complesso stampo/innesco

Come viene innescata la sintesi?

In alcuni casi viene tagliato uno dei due filamenti del DNA per fornire una estremità 3’-OH alla DNA polimerasi

Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante

5'3'

Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante

Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante

Replicazione del DNA del fago ΦX174 mediante il meccanismo del circolo rotante

Trasferimento del cromosoma di E.coli durante la coniugazione

Durante la coniugazione, il fattore F o il cromosoma in cui esso è integrato, si replica mediante il meccanismo del “circolo rotante”. L’estremità 5’ conduce il singolo filamento dal donatore al ricevente.

Trasferimento del cromosoma di E. coli durante la coniugazione

Come viene innescata la sintesi?

In alcuni rari casi (Adenovirus) il 3’-OH di innesco è fornito da una proteina che si lega al DNA

Come viene innescata la sintesi?

In alcuni rari casi (Adenovirus) il 3’-OH di innesco è fornito da una proteina che si lega al DNA

Come viene innescata la sintesi?

Nella maggiorparte dei casi l’innesco è costituito da piccoli tratti di RNA, chiamati inneschi (primer)

RNA primer DNA

Replicazione di DNA circolari: l’ ansa D (nella replicazione del DNA mitocondriale)

Replicazione di DNA e ciclo cellularein E.coli

Relazione tra replicazionee ciclo cellularenei batteri

Poiché un ciclo replicativo può essere iniziato anche quando il ciclo precedente non è ancora terminato, un batterio può duplicarsi ogni 20 min anche se la replicazione dell’intero cromosoma richiede 40 min.

L’apparato enzimatico per la replicazione del DNA

Arthur Kornberg 1918 - 2007

La sintesi di DNA da parte delle DNA polimerasi necessita di un complesso innesco/stampo

5'5'3'

P

HO

P

OH

P P P

OH

3'

5'

5'

P

HO

P

OH

3'

5'

5'

3' + PP

L’attivita’ delle DNA polimerasi

Le tre DNA Polimerasi di E.coli

STRUTTURA

ATTIVITA ENZIM.

allungam. 5’ 3’ esonucl. 3’ 5’ esonucl. 5’ 3’

RUOLO

DNA pol I

monomero100 kD

sisisi

riparazione ecompletamento

frammentii

DNA pol II

monomero120 kD

sisino

riparazione

DNA pol III

eteremulitimero(10 subunità)

900 kD

sisino

replicazione

La “correzione di bozze”

HOP

POH

PPP

HOP

POH

?!

HOP

P

PPP

OH *

HOP

P

PPP

OH

HOP

POH

HOP

POH

PPP

La “correzione di bozze”

Le DNA polimerasi hanno una struttura comune

Le DNA polimerasi hanno una struttura comune

La struttura della DNA polimerasi del fago T

Eventi che si susseguono alla forca di replicazione

Ambedue i filamenti parentali servono da stampoma uno dei due si trova in direzione opposta a quella della sintesi

L’esperimento originale (1969) di Reiji Okazaki

FONDOCIMA

5’’10’’

20’’

L’esperimento originale (1969) di Reiji Okazaki

Direzione della replicazione

DNApolimerasi

Frammento di Okazaki

DNA replicato DNA non replicato

5’

3’

5’

3’

5’

3’

Filamento stampo parentale

Filamento stampo parentale

Filamento continuo (nuova sintesi)

Filamento ritardato (nuova sintesi)5’

I due filamenti si replicano in maniera diversa,in modo che la sintesi avvenga sempre in direzione 5’ 3’

La DNA-ligasi

L’attivita’ della DNA ligasi

5'5'3'

5'3'

3'

5' 3'5' 3'

5'3'

5' 3'5' 3'

P P POH

3'5'

5' OH

P3'

A

3'5'

5'3'

POH

A

+

+ P P +

G A G T T C A G C AC T C A A G T C G T

G A G T T C A G C AC T C A A G T C G T

La sintesi dei frammenti di Okazaki risolve il problema della direzione 5’ 3’ ...

... ma resta il problema che le DNA polimerasi non sanno iniziare la sintesi ma solo allungare un innesco

Questo viene risolto con la sintesi di brevi tratti di RNA (primer) da parte della primasi che sa iniziare la sintesi

Direzione della replicazione

DNApolimerasi

Frammento di Okazaki

5’

3’

5’

3’

5’

3’

Filamento stampo parentale

Filamento stampo parentale

Filamento continuo (nuova sintesi)

Filamento ritardato (nuova sintesi)’

inneschi (o primer) di RNA

Frammento di Okazaki

Innesco

5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’ 5’

PrimasiDNA pol III

DNA pol I

Ligasi

La sintesi del filamento ritardato richiede diverse attività enzimatiche

Pol III PrimasiPol ILigasi

Pol III

La sintesi del filamento ritardato richiede diverse attività enzimatiche

Le tre DNA Polimerasi di E.coli

STRUTTURA

ATTIVITA ENZIM.

allungam. 5’ 3’ esonucl. 3’ 5’ esonucl. 5’ 3’

RUOLO

DNA pol I

monomero100 kD

sisisi

riparazione ecompletamento

frammentii

DNA pol II

monomero120 kD

sisino

riparazione

DNA pol III

eteremulitimero(10 subunità)

900 kD

sisino

replicazione

3’5’

3’5’

Origine della replicazione

3’5’

3’5’

3’

3’5’

3’5’

Replicazione bidirezionale

Direzione della replicazioneDirezione della replicazione

Replicazione continua della “leading strand”

Replicazione discontinua della “lagging strand” con

i frammenti di Okazaki

3’5’

5’

3’5’

5’

3’