3Replicazione e Mantenimento del Genioma
Il Gene - ediz.comp.
Biologia Molecolare
Modulo B – Cap. 6, (7), (8) 8.3Replic. semiconservativa
Repliconi proc. ed euc.
Sintesi semidiscontinua del DNA
L’apparato di replicazione
Trasposoni proc. e euc.
Retrotrasposoni e retrovirus
Cap. 1 1.8 1.10
Cap. 15 15.1 15.6
Cap. 16 16.1 16.7
Cap. 17 17.1 17.2
Cap. 18 tutto
Cap. 21 21.1 21.5 21.10 21.11
Cap. 22 22.1 22.5 22.7 22.12
Cap. 29 29.9
La sintesi di DNA da parte delle DNA polimerasi necessita di:
- DNA da replicare
- precursori nucleotidi trifosfati (NTP) :
Il DNA è sintetizzato sempre in direzione 5’ 3’
mai in direzione opposta
3’
5’
3’
3’5’
5’
5’
3’
PHO
POH
P P POH
3'5'
5'
PHO
POH
3'5'
5'3' + PP
Il DNA è sintetizzato sempre in direzione 5’ 3’
mai in direzione opposta
Le DNA polimerasi non sanno iniziare la sintesi di DNA su DNA a doppio o a singolo filamento
Da qui il problema della replicazione delle estremità 5’
ma sanno allungare una estremita 3’ di un complesso stampo/innesco
Come viene innescata la sintesi?
In alcuni casi viene tagliato uno dei due filamenti del DNA per fornire una estremità 3’-OH alla DNA polimerasi
Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante
5'3'
Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante
Replicazione di DNA circolari: il circolo rotante
Replicazione del DNA del fago ΦX174 mediante il meccanismo del circolo rotante
Trasferimento del cromosoma di E.coli durante la coniugazione
Durante la coniugazione, il fattore F o il cromosoma in cui esso è integrato, si replica mediante il meccanismo del “circolo rotante”. L’estremità 5’ conduce il singolo filamento dal donatore al ricevente.
Trasferimento del cromosoma di E. coli durante la coniugazione
Come viene innescata la sintesi?
In alcuni rari casi (Adenovirus) il 3’-OH di innesco è fornito da una proteina che si lega al DNA
Come viene innescata la sintesi?
In alcuni rari casi (Adenovirus) il 3’-OH di innesco è fornito da una proteina che si lega al DNA
Come viene innescata la sintesi?
Nella maggiorparte dei casi l’innesco è costituito da piccoli tratti di RNA, chiamati inneschi (primer)
RNA primer DNA
Replicazione di DNA circolari: l’ ansa D (nella replicazione del DNA mitocondriale)
Replicazione di DNA e ciclo cellularein E.coli
Relazione tra replicazionee ciclo cellularenei batteri
Poiché un ciclo replicativo può essere iniziato anche quando il ciclo precedente non è ancora terminato, un batterio può duplicarsi ogni 20 min anche se la replicazione dell’intero cromosoma richiede 40 min.
L’apparato enzimatico per la replicazione del DNA
Arthur Kornberg 1918 - 2007
La sintesi di DNA da parte delle DNA polimerasi necessita di un complesso innesco/stampo
5'5'3'
P
HO
P
OH
P P P
OH
3'
5'
5'
P
HO
P
OH
3'
5'
5'
3' + PP
L’attivita’ delle DNA polimerasi
Le tre DNA Polimerasi di E.coli
STRUTTURA
ATTIVITA ENZIM.
allungam. 5’ 3’ esonucl. 3’ 5’ esonucl. 5’ 3’
RUOLO
DNA pol I
monomero100 kD
sisisi
riparazione ecompletamento
frammentii
DNA pol II
monomero120 kD
sisino
riparazione
DNA pol III
eteremulitimero(10 subunità)
900 kD
sisino
replicazione
La “correzione di bozze”
HOP
POH
PPP
HOP
POH
?!
HOP
P
PPP
OH *
HOP
P
PPP
OH
HOP
POH
HOP
POH
PPP
La “correzione di bozze”
Le DNA polimerasi hanno una struttura comune
Le DNA polimerasi hanno una struttura comune
La struttura della DNA polimerasi del fago T
Eventi che si susseguono alla forca di replicazione
Ambedue i filamenti parentali servono da stampoma uno dei due si trova in direzione opposta a quella della sintesi
L’esperimento originale (1969) di Reiji Okazaki
FONDOCIMA
5’’10’’
20’’
L’esperimento originale (1969) di Reiji Okazaki
Direzione della replicazione
DNApolimerasi
Frammento di Okazaki
DNA replicato DNA non replicato
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Filamento stampo parentale
Filamento stampo parentale
Filamento continuo (nuova sintesi)
Filamento ritardato (nuova sintesi)5’
I due filamenti si replicano in maniera diversa,in modo che la sintesi avvenga sempre in direzione 5’ 3’
La DNA-ligasi
L’attivita’ della DNA ligasi
5'5'3'
5'3'
3'
5' 3'5' 3'
5'3'
5' 3'5' 3'
P P POH
3'5'
5' OH
P3'
A
3'5'
5'3'
POH
A
+
+ P P +
G A G T T C A G C AC T C A A G T C G T
G A G T T C A G C AC T C A A G T C G T
La sintesi dei frammenti di Okazaki risolve il problema della direzione 5’ 3’ ...
... ma resta il problema che le DNA polimerasi non sanno iniziare la sintesi ma solo allungare un innesco
Questo viene risolto con la sintesi di brevi tratti di RNA (primer) da parte della primasi che sa iniziare la sintesi
Direzione della replicazione
DNApolimerasi
Frammento di Okazaki
5’
3’
5’
3’
5’
3’
Filamento stampo parentale
Filamento stampo parentale
Filamento continuo (nuova sintesi)
Filamento ritardato (nuova sintesi)’
inneschi (o primer) di RNA
Frammento di Okazaki
Innesco
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’ 5’
PrimasiDNA pol III
DNA pol I
Ligasi
La sintesi del filamento ritardato richiede diverse attività enzimatiche
Pol III PrimasiPol ILigasi
Pol III
La sintesi del filamento ritardato richiede diverse attività enzimatiche
Le tre DNA Polimerasi di E.coli
STRUTTURA
ATTIVITA ENZIM.
allungam. 5’ 3’ esonucl. 3’ 5’ esonucl. 5’ 3’
RUOLO
DNA pol I
monomero100 kD
sisisi
riparazione ecompletamento
frammentii
DNA pol II
monomero120 kD
sisino
riparazione
DNA pol III
eteremulitimero(10 subunità)
900 kD
sisino
replicazione
3’5’
3’5’
Origine della replicazione
3’5’
3’5’
3’
3’5’
3’5’
Replicazione bidirezionale
Direzione della replicazioneDirezione della replicazione
Replicazione continua della “leading strand”
Replicazione discontinua della “lagging strand” con
i frammenti di Okazaki
3’5’
5’
3’5’
5’
3’
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