Wilson K., Walker J.M. (a cura di)Metodologia biochimicaLe bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizioneAnno/Pagine: 2001 pp. 800 Euro: 99,00

REED Rob , HOLMES David , WEYERS Jonathan , JONES Allan METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARIvolume unico p.344 Euro 37,50

Fabrizio Loreni Tel. 0672594317E-mail loreni@uniroma2.it

Antonella RagniniTel. 0872 570317E-mail antonella.ragnini@uniroma2.it

Descrizione generale esercitazioni di laboratorio

Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae

A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP)

B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western

blot di estratti frazionati

Parte A

1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte)

2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte)Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare)

3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonninaDigestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione

4) Analisi su gel di agarosioReazione con enzima "ligasi"

5) Preparazione piastre di agarTrasformazione batterica

6) Analisi risultati trasformazioneMinipreparazione DNA plasmidico

7) Analisi su gel di agarosio

8) Fasi iniziali di Southern blot

Parte B

9) Trasformazione con plasmidi ricombinanti di cellule di lievitoinoculo per la preparazione di estratti proteici

10) Controllo trasformazione Preparazione degli estratti con glass beads e TCA. Frazionamento degli

estratti

11-12) Bradford analysis e preparazione SDS-PAGE

13-14) Caricamento, corsa e Westernblotting (4h)

15-16) Immunodetection ECL. Discussione generale

•DNA endogeno

•DNA esogeno (transgeni)

•RNA strutturale

•mRNA

Acidi nucleici come materiale di studio

•lisi cellulare

•deproteinizzazione

•precipitazione

Isolamento acidi nucleici

Metodi di lisi cellulare

TecnicaTecnica ApplicazioneApplicazioneMetodi non meccaniciMetodi non meccanici

Shock osmoticoShock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule Tessuti animali molli, alcune cellule vegetalivegetali

Congelamento/scongelamentoCongelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteriTessuti animali molli, alcuni batteri

Enzimi liticiEnzimi litici Cellule animali e vegetaliCellule animali e vegetali

Metodi meccaniciMetodi meccanici

Pestello e mortaioPestello e mortaio Tessuti resistentiTessuti resistenti

Sfere di vetroSfere di vetro Batteri e funghiBatteri e funghi

Omogenizzatore a motoreOmogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animaliTessuti vegetali e animali

Omogenizzatore a manoOmogenizzatore a mano Tessuti molli delicatiTessuti molli delicati

Estrusione solida (Hughes press)Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistenteMateriale vegetale resistente

Estrusione liquida (French press)Estrusione liquida (French press) MicroorganismiMicroorganismi

UltrasonicazioneUltrasonicazione MicroorganismiMicroorganismi

•Deproteinizzazione:agenti enzimaticisolventi organici

•Precipitazione:cationi + etanolo(Na, NH4)isopropanolo

Purificazione acidi nucleici

•Protocollo “artigianale”

•Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

Isolamento DNA plasmidico

Protocollo artigianale

Lisi cellulare con NaOH/SDS

Neutralizzazione con Kacetato(precipitazione di proteine)

Estrazione fenolo/cloroformio

Precipitazione con isopropanolo

Risospensione delle cellule in tampone con RNasi

Risospensione in TE

Isolamento DNA da cellule eucariotiche

Isolamento DNA

Isolamento RNA

Purificazione mRNA

•Spettrofotometro

•Elettroforesi su gel

Analisi acidi nucleici

Spettro di assorbimento del DNA

220 240 260 280 300 320

0.5

1.0

1.5

lunghezza d’onda (nm)

Assorbanza(OD)

1 OD260=50g/ml

OD260/OD280=1,8-2,0

•Clonaggio

•PCR

Amplificazione DNA

Clonaggio

Preparazione dei frammenti di DNA da clonare

Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi)

Introduzione nella cellula ospite

Selezione

Scelta e preparazione del vettore

Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi

Minipreparazione di plasmidi per verifica

Vettori plasmidici

•strategie

•controlli

Reazione di ligasi

Trattamento del vettore con fosfatasi

GCTTAAp

pAATTC G

G AATTC

CTTAApG

GpAATTC

CTTAA G

DNA ligasi

pAATTC G

GCTTAAp

EcoRI

GCTTAA

AATTC G

fosfatasi

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

Clonaggio con doppia digestione

GAATTCCTTAAG

GAATTCCTTAAG

AAGCTTTTCGAA

GCTTAA

AGCTT A

EcoRI

AAGCTT

TTCGAAGAATTC

CTTAAG

DNA ligasi

AATTC G

ATTCGA

EcoRI HindIII

AAGCTTTTCGAA

HindIII

Metodi di trasformazione dei batteri

•Metodo del cloruro di calcio

•Elettroporazione

Strategie di selezione nel clonaggio

Vettori plasmidici

Strategie di selezione nel clonaggio

Vettori di espressione

Vettori di espressione inducibili

Espressione proteine di fusione

PCR (polymerase chain reaction)

PCR

•Scelta dello stampo

•Scelta dei primer

PCR da DNA genomico

PCR da mRNA (RT-PCR)

Uso dei “linkers”

Vettori dA:dT

3’3’5’5’

3’5’3’

5’

PCR da DNA genomico

EcoRIBamHI

BamHI EcoRI