Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in...
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Wilson K., Walker J.M. (a cura di)Metodologia biochimicaLe bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizioneAnno/Pagine: 2001 pp. 800 Euro: 99,00
REED Rob , HOLMES David , WEYERS Jonathan , JONES Allan METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARIvolume unico p.344 Euro 37,50
Fabrizio Loreni Tel. 0672594317E-mail [email protected]
Antonella RagniniTel. 0872 570317E-mail [email protected]
Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae
A) Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP)
B) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western
blot di estratti frazionati
Parte A
1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte)
2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte)Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare)
3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonninaDigestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione
4) Analisi su gel di agarosioReazione con enzima "ligasi"
5) Preparazione piastre di agarTrasformazione batterica
6) Analisi risultati trasformazioneMinipreparazione DNA plasmidico
7) Analisi su gel di agarosio
8) Fasi iniziali di Southern blot
Parte B
9) Trasformazione con plasmidi ricombinanti di cellule di lievitoinoculo per la preparazione di estratti proteici
10) Controllo trasformazione Preparazione degli estratti con glass beads e TCA. Frazionamento degli
estratti
11-12) Bradford analysis e preparazione SDS-PAGE
13-14) Caricamento, corsa e Westernblotting (4h)
15-16) Immunodetection ECL. Discussione generale
•DNA endogeno
•DNA esogeno (transgeni)
•RNA strutturale
•mRNA
Acidi nucleici come materiale di studio
•lisi cellulare
•deproteinizzazione
•precipitazione
Isolamento acidi nucleici
Metodi di lisi cellulare
TecnicaTecnica ApplicazioneApplicazioneMetodi non meccaniciMetodi non meccanici
Shock osmoticoShock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule Tessuti animali molli, alcune cellule vegetalivegetali
Congelamento/scongelamentoCongelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteriTessuti animali molli, alcuni batteri
Enzimi liticiEnzimi litici Cellule animali e vegetaliCellule animali e vegetali
Metodi meccaniciMetodi meccanici
Pestello e mortaioPestello e mortaio Tessuti resistentiTessuti resistenti
Sfere di vetroSfere di vetro Batteri e funghiBatteri e funghi
Omogenizzatore a motoreOmogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animaliTessuti vegetali e animali
Omogenizzatore a manoOmogenizzatore a mano Tessuti molli delicatiTessuti molli delicati
Estrusione solida (Hughes press)Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistenteMateriale vegetale resistente
Estrusione liquida (French press)Estrusione liquida (French press) MicroorganismiMicroorganismi
UltrasonicazioneUltrasonicazione MicroorganismiMicroorganismi
•Deproteinizzazione:agenti enzimaticisolventi organici
•Precipitazione:cationi + etanolo(Na, NH4)isopropanolo
Purificazione acidi nucleici
•Protocollo “artigianale”
•Colonnine cromatografiche (kit commerciali)
Isolamento DNA plasmidico
Protocollo artigianale
Lisi cellulare con NaOH/SDS
Neutralizzazione con Kacetato(precipitazione di proteine)
Estrazione fenolo/cloroformio
Precipitazione con isopropanolo
Risospensione delle cellule in tampone con RNasi
Risospensione in TE
Isolamento DNA da cellule eucariotiche
Isolamento DNA
Isolamento RNA
Purificazione mRNA
•Spettrofotometro
•Elettroforesi su gel
Analisi acidi nucleici
Spettro di assorbimento del DNA
220 240 260 280 300 320
0.5
1.0
1.5
lunghezza d’onda (nm)
Assorbanza(OD)
1 OD260=50g/ml
OD260/OD280=1,8-2,0
•Clonaggio
•PCR
Amplificazione DNA
Clonaggio
Preparazione dei frammenti di DNA da clonare
Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi)
Introduzione nella cellula ospite
Selezione
Scelta e preparazione del vettore
Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi
Minipreparazione di plasmidi per verifica
Vettori plasmidici
•strategie
•controlli
Reazione di ligasi
Trattamento del vettore con fosfatasi
GCTTAAp
pAATTC G
G AATTC
CTTAApG
GpAATTC
CTTAA G
DNA ligasi
pAATTC G
GCTTAAp
EcoRI
GCTTAA
AATTC G
fosfatasi
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
Clonaggio con doppia digestione
GAATTCCTTAAG
GAATTCCTTAAG
AAGCTTTTCGAA
GCTTAA
AGCTT A
EcoRI
AAGCTT
TTCGAAGAATTC
CTTAAG
DNA ligasi
AATTC G
ATTCGA
EcoRI HindIII
AAGCTTTTCGAA
HindIII
Metodi di trasformazione dei batteri
•Metodo del cloruro di calcio
•Elettroporazione
Strategie di selezione nel clonaggio
Vettori plasmidici
Strategie di selezione nel clonaggio
Vettori di espressione
Vettori di espressione inducibili
Espressione proteine di fusione
PCR (polymerase chain reaction)
PCR
•Scelta dello stampo
•Scelta dei primer
PCR da DNA genomico
PCR da mRNA (RT-PCR)
Uso dei “linkers”
Vettori dA:dT
3’3’5’5’
3’5’3’
5’
PCR da DNA genomico
EcoRIBamHI
BamHI EcoRI