Spettroscopia di fluorescenzacon luce polarizzata

RichiamiLuce polarizzata linearmente (o piana):il vettore campo elettrico è orientato lungo una direzione fissa, ortogonale alla direzione di propagazione. Il suo modulo oscilla sinusoidalmente.

E(z,t)i E0 cos 2 t z

z

x

y

RichiamiDipolo di transizione:

Per analogia classica si può definire come lo “spostamento” di carica causato dalla transizione elettronica.

Si dimostra che, in prima approssimazione, la probabilità per unità di tempo di una transizione elettronica è proporzionale a

nel caso di eccitazione con luce non polarizzata, ed a

per luce polarizzata linearmente (=direzione della polarizzazione della luce).

01 1 er 0

01

2

ˆ 01 2

FotoselezioneEccitando un campione con luce polarizzata linearmente si portano nello stato eccitato prevalentemente le molecole con il dipolo di transizione (per l’assorbimento) orientato parallelamente alla direzione di polarizzazione.

0

0.5

1

-90 0 90

cos2( )

DiffusioneI movimenti diffusivi rendono casuali le orientazioni delle molecole eccitate.

Anisotropia dell’emissioneMisurando la polarizzazione della luce emessa si determina la rapidità dei movimenti diffusivi (rispetto al tempo di vita di fluorescenza).

r(t)I||(t) I(t)I||(t) 2I(t)

I||(t) I(t)ITot .(t)

Eccitazione

I||

I Emissione

Campioni rigidi (anisotropia limite)

Se A è parallelo a E :

Altrimenti:

rr0 25

rr0 25

3 ˆ A (0)ˆ E (0) 2 12

0.43cos2 1

2

0.2r0 0.4

L’anistropia limite è una proprietà del fluoroforo (e dipende dalla lunghezza d’onda di eccitazione).

Diffusione e decadimento dell’anisotropia

r(t)25

3 ˆ A (0)ˆ E (t) 2 1

2r0

3 ˆ E (0)ˆ E (t) 2 1

2

Diffusione libera ed isotropa (sfera rigida):

r(t)r0et

VkT

Diffusione limitata all’interno di un cono:

r(t)r0 (1 f) e t f

f 12

cos 1 cos

2

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0 1 2 3 4 5

Ani

sotr

opy

Time [ns]

Overall tumbling

Local motions

Overall + local motions

Anisotropia statica

Time

Un’eccitazione continua può essere pensata come sovrapposizione di tanti impulsi di luce uno dopo l’altro.

rr(t)I(t)dt

0

I(t)dt0

I(t)I0et

Nel caso più semplice:

r(t)I0et

rr0

1

Applicazioni

•Dinamica di macromolecole•Transizioni conformazionali•Processi di associazione

•Misure di microviscosità.

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

10 -7 10 -6 10 -5

WTMutant

r

[XL-SOD] (M)

Distorsioni strumentali: il parametro G

• Il fluorimetro (in particolare i monocromatori) sono diversamente sensibili alle due polarizzazioni.

• Per correggere questo effetto si effettuano misure anche con il polarizzatore di eccitazione disposto orizzontalmente.

• In assenza di effetti strumentali Iov ed Ioo dovrebbero essere uguali (entrambi sono I)

Eccitazione

Iov

Ioo Emissione

GIovIoo

r Ivv IvoGIvv 2IvoG

2a esperienza:transizioni di fase in doppi strati lipidici

1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-FosfocolinaO

Pallmitoil Oleoil fosfatidilcolina (POPC)

OP

O

O-

OCH2

C HO

CH2OC

C

CH2 CH2 N+

CH3

CH3

CH3

O

O

(CH2)7

(CH2)14H3C

H C

H C(CH2)7H3C

I fosfolipidi:

Doppi strati lipidici e liposomi

Transizione di fase gel-cristallo liquido