MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

Microscopia a fluorescenza

FluorescenzaCapacità di assorbire radiazioni elettromagnetiche di una certa lunghezza d'onda e di emettere una frazione dell’energia assorbita con radiazione elettromagnetiche di una lunghezza d’onda differente e superiore a quella assorbita.

Microscopia a fluorescenza Usa la luce ultravioletta, a una lunghezza d’onda 200-400 nanometri le strutture sono analizzate in base alla fluorescenza che emettono nello spettro visibile.

AUTOFLUORESCENZA Prodotta da sostanze normalmente presenti nel tessuto. Es: citoplasma (debole luce bluastra), i granuli (intensa luce giallognola), e i mitocondri (forte emissione fluorescente). Il nucleo, al contrario, non è autofluorecente. FLUORESCENZA SECONDARIAIndotta da una colorazione con sostanze fluorescenti, dette fluorocromi (fluoresceina o rodamina).

Microscopia a fluorescenza

Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON HOECHST

Il colorante HOECHST fa parte della famiglia di coloranti che evidenziano il DNA al microscopio a fluorescenza.

Pertanto è utilizzato per visualizzare i nuclei e i mitocondri.

Microscopia a fluorescenza

Studio morfologia nucleare: COLORAZIONE CON ARANCIO DI ACRIDINA

L’arancio di acridina è un colorante fluorescente per gli acidi nucleici. In particolare colora in verde il DNA e in rosso l’ RNA

Immunofluorescenza

UTILIZZO DI ANTICORPI MARCATI CON UNA SOSTANZA FLUORESCENTE

TRATTAMENTO DELLE SEZIONI ISTOLOGICHE CON GLI ANTICORPI MARCATI

OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

METODO DIRETTOLa sostanza fluorescente è legata direttamente all’anticorpo prodotto

contro l‘antigene cercato.

METODO INDIRETTOAnticorpo primario che riconosce l’antigene cercato.Antcorpo secondario, a cui è legata la sostanza fluorescente, che

riconosce l’anticoro primario

Immunofluorescenza MODELLO DI MEMBRANAA MOSAICO FLUIDO

- ESTRAZIONE proteine di membrana (cellule di topo e cellule di uomo)

- INOCULAZIONE in conigli diversi

- ESTRAZIONE anticorpi (anti-topo e anti-uomo)

- MARCATURA differenziale anticorpi

- FUSIONE CELLULARE (Virus Sendai)

- TRATTAMENTO con i due anticorpi

- OSSERVAZIONE della marcatura al microscopio a fluorescenza

Topo Uomo

FUSIONE

Immunofluorescenza

MICROSCOPIA ELETTRONICA

Microscopia elettronica

Limite di risoluzione molto più grande di quello ottico

Non viene utilizzata la luce per rivelare il preparato, ma un fascio di elettroni accelerato fortemente

Immagini ultrastrutturali del preparato in bianco e nero, e non colorate come nella microscopia ottica

1) MICROSCOPIA ELETTRONICA A TRASMISSIONEIl preparato è sezionato e sono visualizzate le strutture

interne

2) MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONEIl preparato NON è sezionato e sono visualizzate le

strutture esterne, quindi la struttura tridimensionale del campione

Microscopia elettronica a trasmissione

Microscopio elettronicoa trasmissione

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparatoobiettivo

proiettore

schermofluorescente

Microscopia elettronica

PrelievoLavaggio in tampone fisiologico Taglio in frammenti molto piccoli (1mm diametro)

FissazioneGlutaraldeidelavaggi in tamponeTetrossido di osmio (OsO4)

DisidratazioneEtanolo, simile alla microscopia ottica

InclusioneResine liquide che solidificano a 70°C Piccoli contenitori cilindrici

Microscopia elettronica a trasmissione

SezionamentoUltramicrotomo

- Lama di diamante- Sezioni ultrafini (50-70 nm) - Retini dotati di griglia.

ColorazioneSali di metalli pesanti

- URANIO (acetato di uranile)- Lavaggi in acqua distillata- PIOMBO (citrato di piombo)

Microscopia elettronica a trasmissione

Microfotografia al microscopio elettronico di un linfocita B umano

Microscopia elettronica a trasmissione

Mitocondrio

Mitocondrio Lisosomi

Apparato di Golgi RER

Microscopia elettronica a scansione

Mentre nel MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE, gli elettroni accelerati attraversano la sezione del campione e producono un’immagine fortemente ingrandita su uno schermo fluorescente, col risultato di un’immagine in bianco e nero dell’ultrastuttura interna del campione, nel MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE gli elettroni colpiscono il campione non sezionato, che produce elettroni secondari che vengono raccolti da uno schermo che, integrando gli impulsi provenienti da tutte le direzioni, producono un’immagine in bianco e nero della struttura esterna tridimensionale del campione

Microscopia elettronica a scansioneOsservazione particolareggiata della superficie dei campioni

- Prelievo, lavaggio, fissazione- Essiccamento (essiccatore)- Ricopertura con oro o argento (metallizzatore)

- Il fascio elettronico urta il campione. Produzione di elettroni secondari raccolti da un sensore ed integrati in un monitor a formare l’immagine tridimensionale della struttura esterna

Microscopio elettronico a scansione

Microscopia elettronica a scansione

Microscopia elettronica

Immunolocalizzazione al microscopio elettronico: Tecnica dell’immunogold

• Particelle sferoidali di oro colloidale (5-30 nanometri) coniugate con anticorpi specifici per l’antigene cercato

• Oro è opaco agli elettroni

• Possibilità di doppie localizzazioni

Trasmissione Scansione