SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE … · Relazione tra gli spettri di eccitazione e gli...
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1 Analitica 26 16/17
SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA MOLECOLARE 27
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2 Analitica 26 16/17
Spettroscopia di fluorescenza molecolare
La fluorescenza è un processo di fotoluminescenza, molto
importante dal punto di vista analitico, in cui gli atomi o le
molecole vengono eccitate mediante assorbimento di
radiazione elettromagnetica.
Le specie eccitate ritornano al loro stato fondamentale
emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni.
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3 Analitica 26 16/17
✔enorme sensibilità; da uno a tre ordini di grandezza
migliore di quella offerta dalla spettroscopia di
assorbimento
✔elevato intervallo di linearità; significativamente
superiore a quello della spettroscopia di assorbimento
✖meno largamente applicabili rispetto ai metodi di
assorbimento per il ridotto numero di sistemi chimici in
grado di dare fluorescenza
Vantaggi e svantaggi dei metodi di fluorescenza
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4 Analitica 26 16/17
La forma ridotta del coenzima Nicotibammide Adenin-
Dinucleotide (NADH) assorbe la radiazione a 340 nm
La molecola fluoresce emettendo una radiazione a 465 nm
Un esempio pratico
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5 Analitica 26 16/17
Teoria della fluorescenza molecolare
La figura è una raffigurazione schematica parziale della distribuzione di energia per una specie molecolare ipotetica.
Con E0 esprimiamo lo stato fondamentale mentre E1 e E2 sono gli stati elettronici eccitati. A ciascuno degli stati elettronici sono associati q u a t t r o s t a t i e c c i t a t i vibrazionali.
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6 Analitica 26 16/17
Teoria della fluorescenza molecolare
Nella figura (a) è evidente come l’irradiazione
della specie E0 mediante una banda di
radiazione di lunghezze d’onda da λ1 a λ5
origina un momentaneo popolamento dei
cinque livelli vibrazionali del primo stato
eccitato E1.
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7 Analitica 26 16/17
Nella figura (a) è evidente come l’irradiazione della specie E0 mediante una banda di radiazione di lunghezze d’onda da λ1 a λ5 origina un momentaneo popolamento dei cinque livelli vibrazionali del primo stato eccitato E1.
Teoria della fluorescenza molecolare
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8 Analitica 26 16/17
Allo stesso modo sempre sulla
figura (a) si osserva che quando
le molecole sono irradiate da
una banda di radiazione più
e n e rg e t i c a , c o s t i t u i t a d a
lunghezze d’onda più piccole da
λ’1 a λ’5, risultano popolati
rapidamente i cinque livelli
v i b r a z i o n a l i d e l l o s t a t o
energetico più elevato E2.
Teoria della fluorescenza molecolare
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9 Analitica 26 16/17
Il tempo di vita di una specie
eccitata è molto breve poiché
sono numerosi i modi con cui
una molecola o un atomo
eccitato può perdere l’energia
assorbita e rilassarsi sino al
proprio stato fondamentale.
Due meccanismi importanti di
questo tipo di processo sono:
➲ rilassamento non-radiativo
[figura(b)]
➲ rilassamento fluorescente [figura(c)]
Teoria della fluorescenza molecolare
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10 Analitica 26 16/17
L a d i s a t t i v a z i o n e v i b r a z i o n a l e o
rilassamento è indicata in figura (b) dalle
piccole frecce ondulate tra i livelli di
energia vibrazionale e avviene durante le
collisioni tra le molecole eccitate e le
molecole del solvente.
L’energia vibrazionale eccedente viene
trasferita alle molecole del solvente in una
serie di passaggi come indicato in figura
(b).
La vita media di uno stato vibrazionale
eccitato è solo di 10-15 sec.
Rilassamento non-radiativo
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11 Analitica 26 16/17
Talvolta può avvenire il
rilassamento non-radiativo
tra il livello vibrazionale più
basso di uno stato elettronico
eccitato e quello più alto di
un altro stato elettronico.
Questo processo è detto
conversione interna ( vedi
figura b) ed è molto meno
efficiente del rilassamento
vibrazionale.
La vita media di uno stato
elettronico eccitato è tra i
10-9 e i 10-6 sec.
Rilassamento non-radiativo
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12 Analitica 26 16/17
Come è mostrato in figura (c)
quando le molecole diventano
fluorescenti vengono prodotte
bande di radiazioni poiché le
m o l e c o l e e c c i t a t e
elettronicamente possono subire
un processo di rilassamento verso
uno qualsiasi dei numerosi stati
vibrazionali dello stato elettronico
fondamentale.
Rilassamento fluorescente
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13 Analitica 26 16/17
Le linee con cui terminano le due bande di fluorescenza a lunghezza d’onda più piccola, o ad alta energia, (λ1 e λ’1) sono identiche in energia alle due linee indicate da λ1 e λ’1 nello schema di assorbimento della figura (a). Queste linee sono dette linee di risonanza in quanto l e l u n g h e z z e d ’ o n d a dell’assorbimento e della fluorescenza sono identiche.
Linee di risonanza e spostamento di Stokes
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14 Analitica 26 16/17
Le bande di fluorescenza molecolare sono costituite
soprattutto da linee con lunghezze d’onda maggiori, e quindi
con minore energia, delle bande di radiazione assorbite
responsabili del loro eccitamento.
Questo spostamento verso lunghezze d’onda maggiori è
talvolta chiamato spostamento di Stokes.
Linee di risonanza e spostamento di Stokes
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15 Analitica 26 16/17
Relazione tra gli spettri di eccitazione e gli spettri di fluorescenza
Le differenze tra gli stati vibrazionali sono simili sia
per lo stato fondamentale che per quelli eccitati per
cui l’assorbimento o spettro di eccitazione e lo
spettro di fluorescenza per un composto appaiono
come immagini approssimativamente speculari
l’uno dell’altro con sovrapposizione nella linea di
risonanza.
Antracene in alcol
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16 Analitica 26 16/17
Specie fluorescenti
La fluorescenza è uno dei molteplici processi per il quale una
molecola ritorna allo stato fondamentale dopo che viene
eccitata mediante assorbimento di radiazione.
Tutte le molecole sottoposte a tale processo potenzialmente
possono emettere fluorescenza.
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17 Analitica 26 16/17
Specie fluorescenti
La maggior parte tuttavia non lo fa perché la loro struttura
determina percorsi di rilassamento non-radiativi che avvengono a
velocità superiori rispetto all’emissione fluorescente.
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18 Analitica 26 16/17
Specie fluorescenti
Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare è semplicemente il rapporto tra il numero di molecole che emettono fluorescenza e il numero totale di molecole eccitate.
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19 Analitica 26 16/17
Molecole altamente fluorescenti hanno efficienze quantiche che
raggiungono l’unità mentre specie non fluorescenti hanno valori
molto prossimi allo zero.
Specie fluorescenti
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20 Analitica 26 16/17
Fluorescenza e struttura
I composti contenenti anelli aromatici
danno la più intensa e la più utile
emissione fluorescente molecolare.
I più semplici eterocicli (piridina, furano,
t iofene e pirrolo) non mostrano
fluorescenza molecolare mentre strutture
fuse contenenti questi anelli fluorescono.
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21 Analitica 26 16/17
Una sostituzione su un
a n e l l o a r o m a t i c o
determina spostamenti
nella lunghezza d’onda
d e i m a s s i m i d i
assorbimento e variazioni
corrispondenti nei picchi
d i f luorescenza . La
sostituzione interferisce
talvolta sull’efficienza
della fluorescenza.
�
Fluorescenza e struttura
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22 Analitica 26 16/17
La fluorescenza viene favorita in modo
particolare dalle molecole rigide.
Nell’esempio riportato a fianco l’efficienza
quantica del fluorene è circa 1 mentre
quella del bifenile è circa 0.2.
La differenza di comportamento è
imputabile all’aumento di rigidità dovuto
al ponte del gruppo metilenico nel
fluorene.
Effetto della rigidità strutturale
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23 Analitica 26 16/17
La rigidità fa diminuire la velocità di rilassamento non-radiativo sino ad un valore per cui diventa competitivo il rilassamento mediante fluorescenza. L’influenza della rigidità spiega anche l’aumento in fluorescenza di alcuni agenti organici chelanti quando questi sono complessati con uno ione metallico. Le molecole libere dell’8-idrossichinolina in soluzione vengono velocemente disattivate mediante le collisioni con le molecole del solvente e quindi non fluorescono. La rigidità del complesso Zn-8-idrossichinolina migliora la fluorescenza.
Effetto della rigidità strutturale
8-idrossichinolina
Complesso con lo zinco dell’8-idrossichinolina
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24 Analitica 26 16/17
Temperatura ed effetti del solvente
L’efficienza quantica di fluorescenza decresce con l’aumentare della temperatura poiché l’aumento della frequenza delle collisioni a temperature elevate fa aumentare la probabilità di un rilassamento collisionale. La diminuzione della viscosità nel solvente porta agli stessi risultati.
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25 Analitica 26 16/17
L’intensità della radiazione fluorescente F è proporzionale al potere radiante del raggio di eccitazione assorbito dal sistema:
F = K’ (P0 – P) dove P0 rappresenta il potere radiante incidente sulla soluzione e P il suo valore, dopo che il raggio ha attraversato una lunghezza b della soluzione. K’ dipende dall’efficienza quantica di fluorescenza. Per esprimere F in funzione della concentrazione c della particella fluorescente scriviamo la legge di Beer nella forma:
P/P0 = 10-εbc
Sostituendo si ha
F = K’ P0 (1- 10-εbc) Quando εbc = A < 0.05
F = Kc
Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza
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26 Analitica 26 16/17
Un diagramma della potenza fluorescente di una
soluzione contro la concentrazione delle specie emettenti
mostra linearità a basse concentrazioni.
Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza
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27 Analitica 26 16/17
Quando però c diventa abbastanza grande
da determinare un valore di assorbanza
superiore a circa 0.05( o una trasmittanza
inferiore al 90%) la linearità scompare ed F
si trova al di sotto della retta di
e s t r apo laz ione (ASSORBIMENTO
PRIMARIO).
A concentrazioni molto alte, F raggiunge un
massimo e può anche cominciare a
d i m i n u i r e c o n l ’ a u m e n t a r e d e l l a
c o n c e n t r a z i o n e a c a u s e
dell’ASSORBIMENTO SECONDARIO in
cui la radiazione emessa viene aasorbita da
latre molecole di analita.
Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza
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28 Analitica 26 16/17
L’effetto precedentemente descritto è il risultato
dell’autospegnimento per cui le molecole dell’analita
assorbono la fluorescenza prodotta dalle altre molecole
dell’analita stesso.
In realtà, a concentrazioni molto elevate, F raggiunge un
livello massimo e poi comincia a decrescere man mano
che aumenta la concentrazione.
Effetto della concentrazione sull’intensità di fluorescenza
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29 Analitica 26 16/17
Strumenti per la misura della fluorescenza
La figura a fianco mostra
una tipica configurazione
d e g l i e l e m e n t i c h e
compongono i fluorimetri e
gli spettrofluorimetri.
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30 Analitica 26 16/17
Strumenti per la misura della fluorescenza
La figura a fianco mostra una tipica configurazione degli elementi che compongono i f l u o r i m e t r i e g l i spettrofluorimetri.
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31 Analitica 26 16/17
I f luor imet r i , cos ì come i l
fotometro, utilizzano i filtri per la
selezione delle lunghezze d’onda.
Gli spettrofluorimetri utilizzano
invece un filtro per selezionare la
radiazione di eccitazione ed un
monocromatore a reticolo per
d i s p e r d e r e l a r a d i a z i o n e
fluorescente emessa dal campione.
Strumenti per la misura della fluorescenza
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32 Analitica 26 16/17
Generalmente tutti gli strumenti per la fluorescenza sono del tipo a doppio raggio per compensare fluttuazioni nella potenza della sorgente.
Strumenti per la misura della fluorescenza
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33 Analitica 26 16/17
Il raggio diretto verso il
c a m p i o n e p a s s a p r i m a
a t t r a v e r s o u n f i l t r o o
monocromatore primario il
quale trasmette le radiazioni che
stimolano la fluorescenza ed
e s c l u d e o l i m i t a q u e l l e
corrispondenti alle lunghezze
d’onda della fluorescenza.
Strumenti per la misura della fluorescenza
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34 Analitica 26 16/17
Strumenti per la misura della fluorescenza
La radiazione di fluorescenza viene
emessa dal campione in tutte le
direzioni ma può essere osservata in
modo conveniente ad angolo retto al
raggio di eccitazione; ad angoli
diversi l’incremento della diffusione
della radiazione da parte della
soluzione e dalle pareti della cella
genera grossi errori nella misura
dell’intensità.
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35 Analitica 26 16/17
La radiazione emessa raggiunge
un rivelatore fotoelettrico dopo
essere passata attraverso il filtro,
o monocromatore secondario, che
isola un picco di fluorescenza per
la misurazione.
Strumenti per la misura della fluorescenza
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36 Analitica 26 16/17
Il raggio di riferimento passa
attraverso un attenuatore che
d i m i n u i s c e l a s u a p o t e n z a
approssimativamente fino a quella
della radiazione di fluorescenza.
I segnali provenienti dai fototubi del
riferimento e del campione sono
successivamente processati da un
amplificatore la cui uscita è
monitorata da un registratore.
Strumenti per la misura della fluorescenza
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37 Analitica 26 16/17
◆ I f l uo r ime t r i sono p iù sens ib i l i deg l i
spettrofluorimetri poiché i filtri hanno una maggiore
capacità di trasmissione della radiazione rispetto ai
monocromatori.
◆ La sorgente ed il rivelatore possono essere posti più
vicino al campione nello strumento più semplice e ciò
ne incrementa la sensibilità.
Strumenti per la misura della fluorescenza
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38 Analitica 26 16/17
Applicazione dei metodi di fluorescenza
I metodi di fluorescenza sono più sensibili dei metodi basati sull’assorbimento da uno a tre ordini di
grandezza poiché la loro sensibilità può essere
aumentata sia mediante l’aumento di potenza del raggio
di eccitazione sia amplificando il segnale del rivelatore.
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39 Analitica 26 16/17
Metodi fluorimetrici per specie inorganiche
Esistono due diversi metodi fluorimetrici applicabili alle
specie inorganiche:
➲metodi diretti: basati sulla reazione dell’analita con un agente chelante per formare un componente che sia
fluorescente
➲metodi indiretti: basati sulla diminuzione o estinzione
della fluorescenza di un reagente come risultato della sua
reazione con l’analita
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40 Analitica 26 16/17
Metodi fluorimetrici per specie inorganiche
✔ metodi diretti: vengono usati principalmente per la determinazione dei cationi ✔ metodi indiretti: vengono usati soprattutto per la determinazione degli anioni
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41 Analitica 26 16/17
Reagenti fluorimetrici
I reagenti fluorimetrici più efficaci per la determinazione dei cationi sono composti aromatici con due o più gruppi funzionali donatori che permettono la formazione di chelati con lo ione metallo.
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42 Analitica 26 16/17
Reagenti fluorimetrici
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43 Analitica 26 16/17
Metodi fluorimetrici per specie organiche e biochimiche
Il numero delle applicazioni dei metodi fluorimetrici in questo
settore è notevole.
Indiscutibilmente la sensibilità e la selettività del metodo lo rendono uno strumento particolarmente valido per l’analisi di
prodotti alimentari, farmaceutici, campioni clinici e prodotti
naturali.
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44 Analitica 26 16/17
Spettroscopia Molecolare di Fosforescenza
La fosforescenza è un fenomeno di fotoluminiscenza abbastanza simile alla fluorescenza. La fluorescenza avviene con transizioni da uno stato eccitato di singoletto ad uno stato fondamentale di singoletto (vita molto breve 10-5 s o meno) La fosforescenza molecolare coinvolge invece una transizione a uno stato eccittato di tripletto ad uno stato fodamentale di singoletto. Tale transizione è molto meno probabile (vita media da 10-4 s a 104 s)
Fondamentale singoletto
Eccitato singoletto
Eccitato tripletto
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45 Analitica 26 16/17
Spettroscopia Molecolare di Fosforescenza
La lunga vita media della fosforescenza è anche uno dei suoi svantaggi. Iprocessi non radiativi possono competere per disattivare lo stato eccitato. Per aumentare questa efficienza generalmente si abbassava la temperatura in matrici rigide come I vetri. Oggi è possibile la fosforescenza a temperatura ambiente. In questa tecnica la molecola viene adsorbita su un asuperficie solida o racchiusa in un acavità molecolare (MICELLE o CAVITA’ della ciclodestrina)
Fondamentale singoletto
Eccitato singoletto
Eccitato tripletto