La fluorescenzaLa fluorescenza

Una breve introduzioneUna breve introduzione

La luminescenzaLa luminescenza

Luminescenza:Luminescenza: emissione di luce da atomi, molecole o cristalli emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamente.eccitati elettronicamente.

Eccitazione luminosa:Eccitazione luminosa: Eccitazione chimica:Eccitazione chimica: Chemiluminescenza

fosforescenzafluorescenza

Fluorescenza e fosforescenzaFluorescenza e fosforescenza

I materiali fluorescentifluorescenti cessano di essere luminosi al cessare dello stimolo che ne determina la luminosità

I materiali fosforescentifosforescenti continuano ad emettere la luce per un certo periodo dopo la fine dello stimolo

Esempi noti a tutti…Esempi noti a tutti…Detersivo “più bianco del bianco”

Discoteca: i denti ed i vestiti che “brillano”

Sveglie con il quadrante fluorescente

Formula 1: per determinare i punti di attrito fra aria ed auto

Inchiostri per banconote contro i falsari

• • Che cosa succede alla luce che e’ stata assorbita da Che cosa succede alla luce che e’ stata assorbita da una molecola?una molecola?

L’energia della luce assorbita da un oggetto qualsiasi viene generalmente dissipata sotto forma di calore. Alcune sostanze invece liberano parte dell’energia assorbita attraverso l’emissione di luce di un colore diverso da quella assorbita (fluorescenza).

Le molecole che assorbono Le molecole che assorbono non sempre fluorescono.non sempre fluorescono.

1)1) eccitazione

2) rilassamento 10-12 s decadimento non radiativo isoenergetico fra stati di uguale molteplicità

3) decadimentonon radiativo

4) decadimento

radiativo

tra stati elettronici di uguale tra stati elettronici di uguale molteplicitàmolteplicità

Emissione di radiazione da parte di una molecola eccitata. Il nome deriva dalla fluorite, minerale di calcio e fluoro, in cui è stato osservato per la prima volta il fenomeno

}} 1010-9-9 s s

Cos’è la fluorescenza ?

Diagramma di JablonskiDiagramma di Jablonski

EE11

EE00

Cos’è la fosforescenza?Cos’è la fosforescenza?

E0

Stati elettronici Stati elettronici eccitatieccitati

Stato elettronico Stato elettronico fondamentalefondamentale

Quali sono le molecole fluorescenti?Quali sono le molecole fluorescenti?

Sono fluorescenti le molecole con sistemi ad elevata . coniugazione

Strutture con molti elettroni Strutture con molti elettroni coniugati coniugati

Strutture planari con anelli aromaticiStrutture planari con anelli aromatici

Esempi: fluoresceina, flavine,cianine, rodamine, porfirine.

N

NH2H2 N

+

CH2 CH3

Br-

Ethidium Bromide

N = C = S

O O OH

Fluorescein isothiocyanate

( FITC )

COOH

Alcuni esempi di molecole….

Molti dei materiali usati tradizionalmente in pittura presentano, anche se debole, una emissione per fluorescenza nel visibile.

L’emissione per fluorescenza dipende dal contributo degli strati più esterni dell’opera d’arte, ovvero dalle vernici (semi-trasparenti), e dagli strati dipinti, generalmente composti da leganti e pigmenti (bianco di zinco, lacca di garanza, giallo indiano), e dalle loro interazioni chimiche.

…..e di materiali pittorici

Giudizio Universale: immagine nel VIS (sinistra) e in fluorescenza indotta UV (destra): l'azzurro di lapislazzuli, utilizzato da Michelangelo,

e' riconoscibile dalla presenza di una fluorescenza bianco-verdastra

Ricordate? Tecniche spettroscopiche in assorbimento

Diagramma schematico di uno Diagramma schematico di uno strumento di fluorescenzastrumento di fluorescenza

Monocromatore di eccitazione Monocromatore di

emissione

campione

lampada Rivelatore

Il fluorimetroIl fluorimetro

Lampada

Monocromatore di eccitazione

Lente

Lente

ecc.

em.

Campione

PMT“segnale”

Computer Monocromatore di emissione

FF

(nm)(nm)

Diagramma di Jablonski: conseguenze

Stokes shift (spostamento ad energie più basse).

Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza d’onda di eccitazione).

Regola dell’immagine speculare.

E1

E2Conversione internaConversione interna

FluorescenzaFluorescenzaAbsAbs

E0

Informazioni ottenibili:

Concentrazione della sonda fluorescente (fluoroforo), fino a nM. Numero e popolazione di specie presenti in soluzione.Riconoscimento del materiale fluorescente sulla base dello spettro caratteristico di fluorescenza.Possibilità di distinguere i diversi materiali, anche quando questi presentano lo stesso colore in condizioni di luce diurna.Confrontando l’emissione di alcuni materiali noti con l’immagine di fluorescenza di un’opera d’arte, è in principio possibile classificare l’immagine, e localizzare sulla superficie i diversi materiali utilizzati.

L’intensità di fluorescenza da cosa dipende?L’intensità di fluorescenza da cosa dipende?

Dipende da:

•Concentrazione di fluoroforo•Efficienza dell’assorbimento di radiazione ()•Efficienza dell’emissione radiativa (resa quantica, )

assorbiti fotoni

emessi fotoniquantica resa

Osservabili: intensità e resa quantica

L’intensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da:

•Intensità della lampada•Efficienza dei monocromatori•Banda passante utilizzata•Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore

Ossia dallo strumento con cui è stata determinata!!!!

Al contrario•l’assorbanza è una misura assoluta •la resa quantica è una misura assoluta standards

L’ esperienza di laboratorio……L’ esperienza di laboratorio……

Spettri di fluorescenza in soluzione acquosa di alcune molecole fluorescenti

Verifica dello Stokes shift e delle regole di Kasha e dell’immagine speculare per i fluorofori analizzati.

Spettro di fluorescenza di una porfirina deposta su di una superficie (tecnica “front face”).

Ad esempio……Ad esempio……

La 5,6-carbossifluoresceina…

Abs 0.8

0.6

0.4

0.2

assorbimento….assorbimento…. fluorescenza….fluorescenza….

Ricordate?Ricordate?

Anche in questo caso possiamo Anche in questo caso possiamo operare direttamente sull’opera operare direttamente sull’opera d’arted’arte

ApplicazioniApplicazioniQuando un’opera viene irradiata con una radiazione di lunghezza d’onda compresa nella regione dell’ultravioletto, tale radiazione viene in parte riflessa e in parte assorbita dagli strati superficiali. Parte dell’ energia assorbita viene quindi riemessa nuovamente per fluorescenza nella banda del visibile (400-700 nm).La sua realizzazione è pratica e semplice: basta disporre di una lampada di Wood e oscurare l’ambiente di lavoro.

Vantaggi:Vantaggi:•Metodo non invasivo •Risposta immediata

Qual’ è la sorgente luminosa?Serve una sorgente che emette radiazioni nell’UV

Particolare di un affresco del Particolare di un affresco del Parmigianino nella Cappella di San Parmigianino nella Cappella di San Giovanni, a ParmaGiovanni, a Parma

Stesso particolare Stesso particolare illuminato da una lampada illuminato da una lampada di Wooddi Wood

Stesso particolare con una lampada Stesso particolare con una lampada di Wood e con un filtro passa alto a di Wood e con un filtro passa alto a 470 nm per mettere in risalto la 470 nm per mettere in risalto la fluorescenzafluorescenza

La misura di fluorescenza La sorgente luminosa usata per irradiare la superficie è una semplice

lampada di Wood L’immagine viene formata su di un sensore opportuno (carta fotografica)

usando un normale obbiettivo fotografico o per telecamera Un filtro nero davanti all’obbiettivo elimina le componenti visibili dalla

radiazione

Utile per esaltare e rendere più leggibili scritte sbiadite dal tempo su documenti e manoscritti antichi.

La fluorescenza UV-VISLa fluorescenza UV-VIS

E’ una tecnica ottica per ottenere immagini di superfici dipinte usando radiazione nella banda spettrale dell’ultraviolettobanda spettrale dell’ultravioletto

Si raccoglie la fluorescenza emessa dalla superficie

Se applicata all’analisi di dipinti antichi, può rivelare la presenza di vernici, leganti, coloranti o particolari pigmenti di restauro