IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono...

59
IL MITOCONDRIO

Transcript of IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono...

Page 1: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

IL MITOCONDRIO

Page 2: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI

I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico nel quale costantemente si fondono e si dividono

Page 3: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

PROTEINE DI FUSIONE

OPA 1: Proteina dello spazio intermembrana avente attività GTPasica

Mfn: proteina della membrana esterna con un dominio GTPasico e una regione Coiled coil

PROTEINE DI FISSIONE

Fis 1: Proteina della membrana esterna

Drp1: Proteina citosolica e mitocondriale avente attività GTPasica

PROTEINE COINVOLTE NELLA FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI

Page 4: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

TESSUTI DEI MAMMIFERI ALTERATI DA DIFETTI NELLE PROTEINE DI FUSIONE

Page 5: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

LA BIOGENESI DEL MITOCONDRIO

Il mitocondrio contiene unproprio genoma e apparatidistinti di replicazione,trascrizione e traduzione.Tuttavia l’mtDNA codificasolo per un ridotto numero di proteine (13) mentre ilresto è codificato dalDNA nucleare

Page 6: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.
Page 7: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

LE PROTEINE CODIFICATE DALL’mtDNA SONOCONTENUTE NEI COMPLESSI RESPIRATORI

Page 8: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI

Costituisce circa l’ 1% del genoma: ogni cellula contiene da 103 a 104 copie di mtDNA

Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA

Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi

Page 9: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

I nucleoidi rappresentano l’unità dinamica ed ereditaria dell’mtDNA

Vertebrati : 50 - 800 nucleoidi/cellula

2 a 6 nucleoidi / organello

2 a 15 molecole di mtDNA/nucleoide

I NUCLEOIDI

Page 10: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

PROTEINE ASSOCIATE CON I NUCLEOIDI NEI VERTEBRATI

Proteine coinvolte nel mantenimento, replicazione e/o trascrizione dell’mtDNA

CopurificazioneCon mtDNA

Distribuzioneintramitocondriale

LON proteasi N.D. N.D.BRCA1 N.D. NUCLEOIDIANT1 SI N.D.PDC-E2 SI. N.D.BCKD-E2 SI N.D.PHB2 SI N.D.

Proteine con funzione sconosciuta

Tra le proteine contenute nel nucleoide alcune hanno un ruolo noto nel metabolismo dell’mtDNA, altre non sono apparentemente collegateall’mtDNA dato che svolgono un ruolo a se stante.

CopurificazioneCon mtDNA

Distribuzioneintramitocondriale

POL G A Parziale MITOCONDRIPOLG B Parziale N.D.TwinkleMtSSB

Parziale NUCLEOIDI

TFAM SI NUCLEOIDIPOLRMT N.D. N.D.MtTFB (Xenopus) N.D. N.D.TFB1M (uomo) N.D. MITOCONDRITFB2M(uomo) N.D. MITOCONDRIRnase MRP N.D. N.D.

Parziale NUCLEOIDI

Page 11: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Studi in cellule di lievito hanno portato alla proposta di un modello di rimodellamentodel nucleoide secondo il quale in seguito a cambiamenti del metabolismo cellulare (es situazioni di stress) l’aconitasiperderebbe il cluster Fe-Se si riposizionerebbe sul nucleoide, contribuendo a stabilizzare l’mtDNA

RIMODELLAMENTO METABOLICO DEI NUCLEOIDI MITOCONDRIALI

Page 12: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

MODELLO DI SEGREGAZIONE DEI NUCLEOIDI IN LIEVITO

Attraverso contatti con proteinedi membrana il nucleoide mitocondriale si collega al citoscheletro.In questo modo il nucleoide si muove con i mitocondri nelle cellule della progeniedurante la divisione cellulare

Page 13: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

IL DNA MITOCONDRIALE DEI METAZOI

•Costituisce circa l’ 1% del genoma: ogni cellula contiene da 103 a 104 copie di mtDNA

•Viene ereditato per via materna

•Viene riparato con scarsa efficienza

•Il processo di ricombinazione del DNA mitocondriale è poco efficiente

•Codifica per 2 rRNA, 13 mRNA e 22 tRNA

•Si trova in strutture ricche di proteine dette nucleoidi

•Nel mitocondrio esiste il fenomeno della eteroplasmia, ossiala presenza di più di un genoma mitocondriale nello stesso individuo

Page 14: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

La mancanza di ricombinazione del DNA mit potrebbe far pensare che il genoma mit si comporti come un organismo asessuato aploide, per cui l’accumulo di mutazioni deleteriepotrebbe determinare l’estinzione dell’organismo (Muller Ratchet).

Uno di questi meccanismi è detto bottleneck o campionamento

IL BOTTLENECK

Invece esistono meccanismi specifici che prevengono questa possibilità

Page 15: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Il bottleneck rappresenta un esempio di replicazione rilassata del DNA mitper cui durante la citochinesi alcune molecole si replicano ed altre no.

Durante i primi stadi dell’ovogenesi avviene un campionamento delle molecole di DNA mit, fino a circa 200/cellula

Successivamente nell’ovocita primario il contenuto cellulare di mtDNA e di mitocondri aumenta considerevolmente fino a 100000 molecole di mtDNA/cellula.

MECCANISMO DEL BOTTLENECK

Page 16: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Il campionamento (bottleneck) avviene durante lo sviluppo di un feto femmina destinato a diventare la madre nelle generazioni successive.

Il campionamento avviene in modo casuale senza meccanismi di selezione positivi o negativi

Mentre le cellule germinali primordiali non differiscono nel loro livello di eteroplasmia la drammatica segregazione dei genotipi mitocondriali che avvienedurante lo sviluppo degli ovociti primari dà luogo ad un alta varianza intercellulare

Page 17: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Il campionamento dell’mtDNA porterebbe alla formazione di individui Omoplasmici nei quali si sarebbero perse le mutazionidebolmente deleterie prima che esse si accumulino.Ciò eviterebbe il verificarsi del “Muller ratchet”

Tuttavia le mutazioni che sfuggono a questa selezione che sono debolmente deleterie e che non vengono rimosse, sarebbero amplificate e potrebbero diventare omoplasmicheQuesto è probabilmente il meccanismo per la patogenesi

delle malattie mitocondriali ereditate per via materna

CONSEGUENZE DEL BOTTLENECK

Page 18: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

MODELLO ASINCRONO DI REPLICAZIONE DEL’mtDNA

Page 19: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.
Page 20: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.
Page 21: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

MODELLI COMPETITIVI DI REPLICAZIONE DELL’mtDNA NEI MAMMIFERI

Replicazione asincrona (Clayton)

ReplicazioneUnidirezionaleSincrona (Holt 2000)

Replicazione bidirezionaleda siti multiplidi inizio

Page 22: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.
Page 23: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO

L’origine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimentodell’mtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dell’mtDNA e peraccellerare la replicazione dell’mtDNA in risposta a richieste fisiologiche

Page 24: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

La replicazione dell’H-strand (modello Clayton) inizia nella regione non codificante e richiede la presenza di un primer ad RNA che è sintetizzato dallaRNA polimerasi mitocondriale apartire dal promotore PL. Il principale sito di inizio della replicazione si trova a livello di una sequenza conservata CSB-1che rappresenta il punto piùimportante per la transizionetra l’RNA primer e l’mtDNA

IL DNA MITOCONDRIALE UMANO

Page 25: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

TAS

RNA DNA

CSBs

5’ 3’

IL D-LOOP

Una notevole proporzione di molecole di mtDNA di mammifero contiene una struttura a tripla elica detta D-loop, costituita da un breve tratto distrand H nascente appaiata alla strand L templato, con conseguentespiazzamento della strand H materna. Le estremità 3’ del D-loop si trovano in corrispondenza di blocchi di sequenza conservate dette TASE’ stato proposto che la struttura del D-loop rappresenti una replicazioneabortiva e che il numero di copie dell’mtDNA possa anche essere regolatodall’espansione di questa struttura.

Page 26: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA

La replicazione dell’mtDNA dipende da numerosi fattori, ognuno dei quali svolge un ruolo importante nel processo.

Page 27: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

SINTESI DEL PRIMER

Richiede:•mtRNA pol•Fattori di trascrizione TFAM

TFB1TFB2

Page 28: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

TFAM

•Attiva la trascrizione delle strand H ed L legandosi ai rispettivi promotori HSP E LSP

•Si lega al DNA anche in maniera regolare e senza specificità di sequenza svolgendo la funzione di histone-like protein

OH2 OH1

300

CS

B1

CS

B3

CS

B2

LSP HSP

TFAM

150 350 400 450 500 550200 250100

ITL ITH

•E’ essenziale per il mantenimento dell’ mtDNA in quanto la sua deplezione é letale

Page 29: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

TFAM, TFB1 E TFB2

TFAM LSP

TFB1

TFB2

• TFB1 e TFB2 sono due fattori proteici che insieme a TFAM stimolano la sintesi del primer

• Sembra che TFB1 e TFB2 colleghino TFAM con l’RNA polimerasi facilitando l’inizio della trascrizione

mtRNA pol.

Page 30: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

MATURAZIONE DEL PRIMER

RICHIEDE UNA RIBONUCLEOPROTEINA (MRP)

o

AVVIENE IN MODO PROTEINA INDIPENDENTE

Page 31: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

L’enzima MRP è un’endonucleasi costituita da una parte proteicae da una componente ad RNA.

Secondo gli autori l’enzima svolgerebbe il suo ruolo tagliandol’RNA e producendo il primer perla replicazione. Il taglio avverrebbe quando l’RNA è ibridizzato con il DNA stampo formando una struttura R-loop

Page 32: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

L’esistenza di strutture a singola strand nella regione CSB1 suggerisce che esse rappresentino dei siti di pausa della trascrizione. Pertanto la formazione del primer sarebbe indipendente dall’azione di una nucleasi

Page 33: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Utilizzando un sistema purificato di trascrizione in vitro si è osservato che la trascrizione della strand L termina nel box CSB II.Pertanto anche questo studio sostiene che la formazione delprimer è indipendente dalla presenza della endonucleasi MRP

Page 34: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

LA TERMINAZIONE PREMATURA DELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA DIPENDE DAL SUO SITO DI INIZIO

L’origine localizzata in pos 57 è responsabile per il mantenimentodell’mtDNA in condizioni di steady state mentre le altre due origini sarebbero richieste per il recupero dopo la deplezione dell’mtDNA e peraccellerare la replicazione dell’mtDNA in risposta a richieste fisiologiche

Page 35: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

FATTORI COINVOLTI NELLA REPLICAZIONEDELL’ mtDNA

Page 36: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

mtSSB

Proteina che lega il DNA a singolo filamento evitandone la rinaturazione

• stimola l’attività 3’-5’ esonucleasica e l’attività 5’-3’ polimerasica della DNA polimerasi . ed aumenta anche la processività dell’enzima

Il collegamento tra espressione di mtSSB e variazioni nel contenuto dell’mtDNA suggerisce che essa sia asssociata con meccanismi che regolano la replicazione o la stabilità dell’mtDNA

•Studi in Drosophila mostrano che l’espressione di mtSSB è regolata dal legame ad elementi DRE che controllano la replicazione del DNA di Drosophila. Ciò definisce un possibile legame tra replicazione nucleare e mitocondriale

• La deplezione di mtSSB induce la deplezione dell’mtDNA

ALTRE CARATTERISTICHE DI mtSSB

Page 37: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

ELICASI

E’ stata descritta una elicasi mitocondriale 5’-3’richiesta per la replicazionedell’ mtDNA

• L’attività di TWINKLE è stimolata da mtSSB

• Mutazioni nel gene per TWINKLE sono associate con delezioni multiple nell’mtDNA di pazienti sofferenti per l’adPEO• Studi con animali transgenici e esperimenti di RNAi hanno mostrato che l’espressione di TWINKLE è strettamente associata con il livello dell’mtDNA•TWINKLE, mtSSB e TFAM sono localizzate nei nucleodi

Essa è stata denominata TWINKLE (omologa alla elicasi-primasi di T7)

Page 38: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Le sequenze TAS potrebbero essere un segnale di riconoscimento per una DNA-binding protein che potrebbefunzionare bloccando la progressione della forca replicativa Questa proteina potrebbe svolgere un azione antielicasica

COME VIENE REGOLATA L’ESTENSIONE DEL D-LOOP ?

RNA DNA

CSBs

5’ 3’

IPOTESI

TAS

Page 39: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Gli autori identificano una proteina di circa 45KDa chesi lega alle regioni TAS A E TAS B del DNA mit umano

Page 40: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

P.lividusmtDNA

12 S Cyt b ND5ND6

FQ

T EQ

N C R

mtDBP

OH

mtDBP

P

mtDBP, THE D-LOOP BINDING PROTEIN IN SEA URCHIN

Page 41: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

• MtDBP works as a bidirectional transcription termination factor in an in vitro heterologous transcription assay.

bmtDBP - -

RO

TT

pDBP-term(F) pDBP-term(R)

mtDBP IS A TRANSCRIPTION TERMINATION FACTOR

Page 42: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Is mtDBP involved in mtDNA replication, perhaps by

impeding the synthesis of nascent DNA (“contrahelicase

activity”) ?

NCR

1098 1126 1175

12S TE

OH

Q NPATG-rich

nascent H-strand

RNA primer

mtDBP AND mtDNA REPLICATION……..

mtDBP

Page 43: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

• Recombinant purified mtDBP

G-rich G-rich

mtDBPmtDBP

helicase substrates

• Partial duplex substrates that contain mtDBP binding site alone or followed by its flanking region, in both orientations

IN VITRO HETEROLOGOUS HELICASE ASSAY

•SV40 large T Antigen (replicative helicase)

Page 44: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Substrate: mtDBP binding site

OH

DBP.For

T Ag

5’

3’

* 1090 1246

T Ag+ + + +

mtDBP

100 °C

100 86 65 37 10

*

* % helicase activity

+-

3’5’

T Ag

OH

10901246

*DBP.Rev

mtDBP

*

*

% helicase activity 100 95 90 44 5

+ + + + T Ag100 °C +-

DNA-BOUND MTDBP EXHIBITS A NON-POLAR CONTRAHELICASE ACTIVITY

Page 45: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

It terminates transcription bidirectionally

It is a bidirectional contrahelicase that could act as a negative regulator of mtDNA synthesis.

MTDBP IS A DUAL FUNCTION PROTEIN:

MtDBP could coordinate the interplay between replication and transcription.

Page 46: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

- block the replication fork in a polar mode (contrahelicase)- exert a polar stop to elongating RNA pol;

passage of an RNA transcript from the permissive side of DNA-protein complex causes dislodging of the protein: the arrested helicase is restored.

Bacterial factors Tus and RTP (D. Bastia and coll.):

blocking sidepermissive side

3’

5’

5’

3’

blocking side

RNApol

replic.

replic.

RNApol

replic.

replic.

PROKARYOTIC FACTORS MEDIATING TERMINATION OF TRANSCRIPTION AND

REPLICATION

Blocked RNApol

Page 47: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

What is the mechanism that allows

mtDNA synthesis to resume?

MODEL

Dissociation of DNA-bound mtDBP caused

by the passage, in the opposite direction,

of the RNA polymerase through the protein-

DNA complex.

Page 48: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

T7 RNA pol

T7 promoter

T7 RNA pol transcribes and invades mtDBP-DNA complex

mtDBP

T7 promoter

32PmtDBP is dislodged and trapped by a labelled DNA

probemtDBP

DNA template

DNA templatemtDBPT7 RNA pol

+ ++ + _+ _

+ +_ _ _+ _

+ ++ + + _ +

free oligonucleotide

mtDBP/DNA complex_

_

DNA:prot. 1:6 1:13

NTPs + _+ + + + +

IMPACT OF TRANSCRIPTION INVASION ON THE DNA-BOUND MTDBP

Page 49: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

Transcription invasion of the protein-DNA complex causes dislodging of mtDBP. The arrested helicase is restored and mtDNA replication can resume.

Readthrough transcription dislodges mtDBP

A POSSIBLE MODEL FOR THE ABROGATION OF mtDBP CONTRAHELICASE ACTIVITY

mtRNA pol

elongating H-strand

12S E T P Q

OH

DNA helicase

12S

arrested H-strandOH

TE P Q

mtRNA pol

G-rich

G-rich AT

AT

mtDBP

Page 50: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

DNA POLIMERASI

Nelle cellule animali la DNA polimerasi mitocondriale (DNA pol ) é una proteina costituita da due subunità:

• subunità catalitica con attività esonucleasica 3’-5’ ed attività polimerasica 5’-3’ di circa 140 kDa

•subunità regolatrice di 35-54 kDa

La subunità regolatrice è omologa alle aminoacil-tRNA sintetasi di classe IIEssa aumenta l’affinità della polimerasi per l’mtDNA epromuove un più forte legame dei nucleotidi aumentando la velocità di polimerizzazione

Page 51: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIE DEL DNA

Il numero di copie del DNA può dipendere:

da fattori direttamente coinvolti nella replicazione

da fattori coinvolti nella biogenesi del mitocondrio

da fattori coinvolti nel ciclo cellulare

Page 52: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

REGOLAZIONE DELLA BIOGENESI MITOCONDRIALE

Page 53: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

In risposta a danni al DNA, p53 interagisce con l’mtDNA e con la DNA polimerasi aumentando la velocità di replicazione

Page 54: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

MODELLO PER LA REGOLAZIONE DEL NUMERO DI COPIEDELL’mtDNA DA PARTE DELLA VIA DI CONTROLLO

Mec1/Rad 53 DEL CICLO CELLULARE

Page 55: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

IL NUMERO DI COPIE DELL’ mtDNA DIPENDE DA FATTORI PROTEICI E DA ELEMENTI LIMITANTI COME IL POOL DEI NUCLEOTIDI

Page 56: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

MAPPA DELLE MUTAZIONI PATOLOGICHE DEL DNA MITOCONDRIALE UMANO (DI MAURO 2005)

Page 57: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

ASPETTI CLINICI, MORFOLOGICI E BIOCHIMICI DI DISORDINI COLLEGATI A MUTAZIONI DELL’mtDNA

Page 58: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

GENI NUCLEARI COINVOLTI NEL MANTENIMENTODELL’mtDNA

Page 59: IL MITOCONDRIO. FUSIONE E FISSIONE DEI MITOCONDRI I mitocondri sono organelli cellulari. Essi sono connessi con il citoscheletro e sono in uno stato dinamico.

SOSTITUZIONI AMINOACIDICHE NELLA DNA POL RESPONSABILI DI MUTAZIONI PATOLOGICHE O DI POLIMORFISMI

AdPEO

Sporadic PEO

Sindromedi Alper

SANDO

Male infertility

Mutazioni autosomiche recessive