11

Capitolo 10: Spettroscopia

Spettroscopia:interazione tra molecole e radiazione elettromagnetica

H HO

22

Dalla descrizione secondo Maxwell (1864) dei fenomeni elettromagnetici: radiazione elettromagnetica = campi elettrici e magnetici che si propagano come un’onda nello spazio

Onda piana, polarizzata, monocromatica che si propagalungo la direzione x

( ) 0

2, cos ( )zE x t E x ct

πλ

= − 0E : Intensità del campo elettrico

Campi elettrico e magnetico ortogonali alla direzione di propagazione

33

zE

x0

λ

0=t

λ : lunghezza d’onda

km/s)000300(m/s10988.2 8 ≅=c : velocità di propagazione della radiazione (luce) nel vuoto, indipendente da λ

zE

x0

0=t

tt ∆=tcx ∆=∆

Radiazioni monocromatiche catalogabili secondo la lunghezza d’onda

m101pmm101nmm10m1 1296 −−− ===µm10nm1.0 Angstrom1 10−==

( ) 0

2,0 coszE x E x

πλ

=

44

Radiazione monocromatica (ad un solo colore): una sola lunghezza d’onda!Radiazione non monocromatica: sovrapposizione di campi elettrici dovuti

a radiazioni con diversa lunghezza d’onda

55

Campo elettrico come funzione del tempo a 0=x

( ) 0

20, coszE t E ct

πλ

=

zE

t0

T

Periodo dell’oscillazione:

Frequenza: 1/s)Hz Hertz,(in 1 ≡=≡

λν c

T

Numero d’onda: )cmin (spesso 1 1−≡λ

ν νν c=)cmin (spesso 1 1−≡λ

ν

:,, ννλ parametri alternativi per catalogare la radiazione monocromatica

Esempio: = 5000 Angstromλ ?, =νν

cT /λ≡

66

La radiazione elettromagnetica trasporta energia !

Intensità della radiazione: flusso di energia attraverso una superficieortogonale alla direzione di propagazione, per unità di superficie e di tempo

I

I esprimibile come energia!dell' misura di unità Joule,JsJ/m2 =

Elettromagnetismo classico (Maxwell):e quindi l’intensità della radiazione può essere variata in modo continuo

20| |I E∝

Planck (1900) ed Einstein (1905): energia della radiazione quantizzatasecondo fotoni , ciascuno con energia:

hvE =Costante di Planck: Js 10626.6 34−=h

Ne consegue che = energia di un fotone ( ) numero di fotoni cheattraversano la superficie unitaria (ortogonale alla direzione di propagazione) nell’unità di tempo.

I hv ×

77

Intensità della radiazione solare che arriva sulla Terra in funzionedella lunghezza d’onda.

88

La radiazione elettromagnetica viene assorbita/emessa solo se l’energia di un suo fotone è pari alla differenza di energia tra due stati della molecola in esame:

EEEh mn ∆=−=ν

En

Em

Energia

Le varie spettroscopie si differenziano per la natura dei due stati coinvolti nella interazione con la radiazione

νh

La condizione non è sufficiente perché si abbia assorbimento o emissione: devono essere rispettate anche le regole di selezione dettate dall’interazione radiazione-molecola nella transizione

Eh ∆=ν

99

Misura dell’assorbimento di radiazione su un campione con un spettrofotometro (rudimentale)

lampada

fenditura

fend

itura

Monocromatore (prisma o reticolo)

: radiazione monocromaticacon lunghezza d’onda

campione rivelatore

I0I

λ

Frazione di fotoni trasmessi (non assorbiti): Trasmittanza 0/ IIT ≡

Spettri di assorbimento: come funzione di (o , o )T% λ ν ν

100% ≡T : trasmittanza totale = assorbimento nullo0% ≡T : trasmittanza nulla = assorbimento totale

Trasmittanza percentuale: 0/100100% IITT =≡

0I

Spettri di assorbimento: come funzione di (o , o )λ ν ν

1010

Esempio di uno spettro in trasmittanza: acetato di metile

T%

-1cm/ν

m/ µλ

Chimica Fisica Biologica A.A. 2009-2010

1111

Assorbimento misurato dall’assorbanza (adimensionale)A( )( )

( )( )λλ

λλ

I

I

I

ITA 0

100

1010 logloglog =−=−≡

010:

01:

0

0

><≤<===

ATII

ATII

Spettri di assorbimento: come funzione di (o , o )A λ ν ν

1212

Esempio di uno spettro di assorbimento nella scala di Assorbanza:Clorofilla a disciolta in acqua

12

il verde non viene assorbito

1313

Caso particolare di un soluto disciolto in un solvente che non assorbe la radiazione (in un dato campo di frequenze): legge di Lambert-Beer

: percorso ottico = distanza percorsa dalla radiazione nel campione(normalmente misurato in cm)

l

clA )()( λελ =

: concentrazione (moli/litro)c

)(λε : coefficiente di estinzione molare (litro/moli cm), dipendedalla lunghezza d’onda, ma non dalla concentrazione (o da )l

Nota: se le concentrazioni sono espresse come moli/cm , allora ha dimensioni cm /moli

3

2)(λε

1414

x

)(xI

0

0I

campione0I

x0 l

dx

xdI )(dx

xdI )(− : tasso di diminuzione (nello spazio)del numero di fotoni

)()(

xKcIdx

xdI =− K: costante di prop.

dx

xId

dx

xdI

xIKc

)(ln)(

)(

1 ==−

KcxIbxaxI −=+= 0ln)(ln

Per :lx = 00 0

0 010

ln ( ) ln ln ln ( ) ln( )

1log ln

( ) 2.3 ( ) 2.3

II l I Kcl Kcl I I l

I l

I I KA cl

I l I l

= − = − =

= = =

ε

Chimica Fisica Biologica A.A. 2009-2010

1515

SPETTROSCOPIA VIBRAZIONALE

Consideriamo prima molecole biatomiche A-B nel loro stato elettronico fondamentale

:)(rV Potenziale vibrazionale: energia (potenziale) della molecola in funzione della distanza interatomica BArr −≡

eD : Energia di dissociazione della molecola A-B (descrive la forza dellegame tra i due atomi)

er : Distanza di equilibrio

r

)(rV

er0

eD−

1616

Approssimazione armonica del potenziale vibrazionale

2/)()( 2ee rrkDrV −+−= k : costante di forza (determinata dalla

curvatura nel minimo del potenziale “vero”)

Modello meccanico del potenziale armonico: due masse trattenute da una molla.

r

)(rV

approssimazione armonica

( )( )e

dV rF k r r

dr= − = − −

1717

Relazione diretta tra forza di legame ( ) e costante di forza ( )eD k

r

)(rV

0

eD−

'eD−

k

'k

kkDD ee >⇒> ''

1818

µ : massa ridotta per il moto relativo dei due atomi A e B

BABA

BA

mmmm

mm 111 +=⇒+

=µ

µ

Esempi:

HHCl

ClHClH

H

mmm

mmmm

m

≅+

=<<

=

µ

µ

:Cl-H

2/:H-H

Effetto dell’atomo leggero: BAA mmm <<≅ se µ

1919

Moto armonico classico secondo l’equazione di Newton

2

2

( ) (scostamento dal punto di equilibrio)e

d x tkx x r r

dtµ = − ≡ −

max 0( ) cos(2 ) : moto oscillator io con frequenza

1/

2

vib vib

vib

x t x t

k

πν α ν

ν µπ

= +

≡ : frequenza vibrazionale classica

Energia dell’oscillatore armonicoclassico (riferita al minimo dell’energia):

2/2maxkxE =

può essere variata con continuità

x

)(xV

E

maxx

2020

vib

cvibvib /νν ≡

Le frequenze vibrazionali sono comprese nel campo IR della radiazione!

2121

)2/1( vibn hnE ν+=

Analisi secondo la Meccanica Quantistica (eq. di Schroedinger) dell’oscillatore armonico: le energie sono quantizzate !

energia

Energie permesse

x

n : numero quantico vibrazionale )3,2,1,0( L=n

vibν : frequenza vibrazionale classica

I livelli energetici vibrazionali sonoequidistanziati secondo vibhν

2222

Transizioni vibrazionali potenzialmente osservabili:con assorbimento di fotoni con energia: nEE →0

vibn nhEE νν =−= /)( 0

Ma bisogna tener conto delle regole di selezione (ottenibili dalladescrizione quanto-meccanica dell’interazione della molecola in unostato vibrazionale con il campo elettrico della radiazione)

Regola di selezione generale (non solo per molecole biatomiche): una transizione vibrazionale può avvenire solo se il momento di dipolo(elettrico) molecolare cambia durante la vibrazione ( in tal caso: “vibrazione IR attiva”)

Vettore momento di dipolo elettrico di due cariche opposte nello spazio

µr

q−

qµr

dqd=||µr

In condizioni ordinarie solo gli stati vibrazionali fondamentali sono significativamente popolati !

2323

Le molecole biatomiche eteronucleari (ad esempio HCl) posseggono un momento di dipolo derivante dalla polarizzazione del legame dovutoalla differente elettronegatività degli atomi

H Clqδ qδ−

µr)(|| trqδµ =r oscilla con la vibrazione della molecola:

può effettuare transizioni vibrazionali

Le molecole biatomiche omonucleari (ad esempio H ) hanno momento di dipolo nullo, e quindi non possono effettuare transizioni vibrazionaliper assorbimento di un fotone: assenza di assorbimento nell’infrarosso.

2

2424

Regola di selezione specifica (per molecole biatomiche): la radiazione può effettuare transizioni solo tra stati vibrazionali contigui ( )1±=∆n

Transizioni vibrazionali osservate in molecole biatomiche eteronucleari:con assorbimento di fotoni di energia: 10 EE → vibhEE νν =−= /)( 01

Nel caso di molecole biatomiche eteronucleari si può determinarela frequenza di vibrazione molecolare attraverso la misura dellafrequenza di assorbimento

vibν

2525

Molecole poliatomiche, ad esempio l’acqua

H H

Or 'r

ϑNel moto vibrazionale possono variare tre coordinate interne: due distanzedi legame ed un angolo di legame.

Modi normali di vibrazione : tutte le coordinate interne (e quindi le posizionidegli atomi) oscillano con la stessa frequenza (vibrazionale).

Nello spettro di assorbimento si osserva la transizione stato fondamentale primo stato eccitato

di ogni modo normale alla propria frequenza vibrazionale, se questo èattivo all’IR (vale a dire se produce un momento di dipolo oscillante)

Le molecole poliatomiche posseggono diversi modi normali caratterizzati da frequenze di vibrazione in generale diverse.

→

2626

La molecola d’acqua presenta tre modi normali detti stretching (stiramento,cioè allungamento/accorciamento di legami) simmetrico ed antisimmetrico ,e bending (piegamento molecolare dovuto a variazioni dell’angolo di legame). Tutti e tre i modi normali sono attivi all’IR.

Stiramento simmetrico

Stiramento antisimmetrico

Piegamento

Rappresentazione a baricentro fisso dei modi normali

27

Spettro IR dell’acqua (liquida)

Le bande vibrazionali hanno una larghezza finita a causa del motorotazionale e delle interazioni intermolecolari che producono unadistribuzione delle energie di transizione )( 01 EE −

2828

Quanti sono i modi normali in una molecola non lineare con N atomi?

m : n°gradi di libertà = n°coordinate per descrivere l e posizioni atomiche

Nm 3=tm : n°gradi di libertà traslazionali della molecola nel lo stato di equilibrio

3=tm

rm : n°gradi di libertà rotazionali della molecola nell o stato di equilibrio3=rm

6N3mmmM rt −=−−= : n°gradi di libertà vibrazionali della molecola== n°modi normali

Esempio della molecola (non lineare) d’acqua (N=3): 3633 =−×=M

2929

Spettro IR del Bromuro di propile (N=11): 276113 =−×=M

Spettro

3030

Spettro IR del propil benzene (N=21): 576213 =−×=M

3131

Le tipiche molecole organiche hanno molti modi normali di vibrazione che determinano uno spettro IR di forma complicata con parecchiebande di assorbimento

Esistono però dei modi che coinvolgono (piccoli) gruppi di atomi e che sono caratterizzati da frequenze di vibrazione similari indipendentemente dall’intorno molecolare. Esse sono tabulate come frequenze di gruppo , e sono molto utili per la identificazione di strutture molecolari attraverso la spettroscopia IR

3232

HOMO

LUMOhνννν

Energia

Assorbimento di un fotone UV-VIS da parte di una molecola: promozione di un elettrone dall’ HOMO al LUMO.

Spettri UV-VIS prodotti da transizioni tra orbitali molecolari degli elettroni. Le transizioni che richiedono minore energia coinvolgono gliorbitali chiamati HOMO e LUMO:

HOMO = highest occupied molecular orbital

LUMO = lowest unoccupied molecular orbital

Spettroscopia UV-VIS (elettronica)

3333

Stati di Singoletto e di Tripletto

Gli elettroni possono avere spin +1/2 (α) o spin -1/2 (β). In un orbitale (atomico o molecolare) ci possono essere al massimo due elettroni con spin opposto. Per due elettroni su due orbitali diversi si può avere:

Stati di Singoletto S: i due elettroni più esterni hanno”spinantiparallelo” quindi lo spin totale è nullo.

LUMO

HOMO

LUMO

HOMO

Stati di Tripletto T: i due elettroni piùesterni hanno ”spin parallelo” quindi lo spin totale è pari ad 1.

3434

Il passaggio da Singoletto a Tripletto non può essere indotto da assorbimento di radiazione, che non è in grado di cambiare lo stato di spin degli elettroni.

Regola di selezione per le transizioni elettroniche :

Lo stato fondamentale nella maggioranza delle molecole è un Singoletto indicato come S0.

L’assorbimento di radiazione porta dallo stato fondamentale S0 ad uno stato eccitato di singoletto Sn .

LUMO

HOMO

LUMO

HOMO

hνννν

nSS →0

S0 S1 S2

3535

In ogni stato elettronico, sia fondamentale che eccitato, esistono diversi livelli vibrazionali. Quindi le transizioni elettroniche sono accompagnate da transizioni vibrazionali (transizioni vibroniche o vibro-elettroniche)

r0

Energia

Molecola biatomica

0S

1S

Molecola generica

Stato Fondamentale S0

Stato Eccitato S1

νννν0 νννν1 νννν2

3636

Le bande di assorbimento sono la somma di picchi corrispondenti a transizioni dallo stato fondamentale a diversi livelli vibrazionali dello stato eccitato.

νννν0νννν1νννν2

Struttura vibrazionale risolta solo se le bande vibrazionali sono sufficientemente strette. Spettro di assorbimento con una unica banda per una data transizione elettronica, se le componenti vibrazionali hanno bande molto larghe.

3737

In caso di doppi legami coniugati o sistemi aromatici l’assorbimento si sposta verso lunghezze d’onda maggiori Se si passa da assorbimento dall’UV ad assorbimento nel visibile si ha una sostanza colorata (es: caroteni, clorofille)

β-carotene

200 300 400 500 600 700-20000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

ε (l

mol

-1 c

m-1)

Lunghezza d'onda (nm)

Spettro di assorbimento del �-carotene

Gran parte delle sostanze hanno transizioni elettroniche (vibroniche) nell’ultravioletto, e quindi appaiono trasparenti nel visibile (caso dell’acqua, o dell’acetone).

0 1S S→0 2S S→

3838

Spettro di assorbimento della Clorofilla a disciolta in acqua

38

il verde non viene assorbito

3939

Spettri di assorbimento UV dei principali amminoacidi aromatici (non assorbano nel visibile!)

Triptofano (Trp)

Fenilalanina (Phe)

Tirosina (Tyr)ε280 (Trp) = 5690 litro / mol cmε280 (Tyr) = 1280 litro / mol cmε280 (Phe) = 160 litro / mol cm

4040

Lo stato eccitato a minor energia che si ottiene per assorbimento di luce è il singoletto S1. Gli altri stati eccitati di singoletto ad energia maggiore sono indicati con S2, S3, …

Dagli stati S2,S3,.. si ha un rapido decadimento non radioattivo allo stato S1 in tempi di circa s.

IC = Internal Conversion: energia in eccesso dissipata come energiatermica del solvente circostante.

S0

S1

S2

S3

hν

IC

energia

Evoluzione degli stati eccitati

1310−

4141

Lo stato S1 ha tempi di vita variabili ma tipicamente di nanosecondi, e può deadere secondo diversi processi:

1) Decadimento IC allo stato fondamentale S0, senza emissione di radiazione (“decadimento non radiativo”).

S0

S1

S2

S3

energia

IC

4242

2) Il decadimento ad S0 con emissione di luce. Questo fenomeno viene detto

Fluorescenza .

S0

S1

S2

S3

energia

F

4343

S0

S1

S2

S3

energia

3) La conversione ISC (Inter System Crossing) ad uno stato di tripletto T1. Lo stato T1 a sua volta può decadere non radiativamente ad S0 o con emissione di un fotone, processo detto:

Fosforescenza (P) .

I tempi di vita di T1 sono molto lunghi (da microsecondi a secondi o minuti) a causa della transizione proibita

T1

ISC

P

4444

Rappresentazione schematica degli stati e dei processi coinvolti nei processi di assorbimento / emissione / decadimento

Diagramma di Jablonski

A FP

IC

IC

S0

S1

S2

S3

T1

ISC

4545

Fluorescenza

A

S0

S1

S2

S3

La fluorescenza avviene sempre a lunghezze d’onda uguali o maggiori dell’assorbimento.Sipuò osservare struttura vibronica anche nella fluorescenza

4646

Si definisce la resa quantica di fluorescenza come il rapporto tra il numero di fotoni emessi ed il numero di fotoni assorbiti

è un numero compreso tra 0 e 1assorbiti fotoni .

emessi fotoni .

nr

nrfl =Φ

H2O, pH = 7

I principali fluorofori biologici intrinseci sono gli amminoacidi aromatici, in particolare tirosina e triptofano. Le basi degli acidi nucleici sono pochissimo fluorescenti. Sono fluorescenti alcuni coenzimi come NADH, FAD e FMN.

4747

Sorgente

Campione

Schema di una spettrometro di fluorescenza UV-VIS (fluorimetro)

Monocromatore di eccitazione (prisma, reticolo)

Rivelatore di intensitàluminosa (tubo fotomoltiplicatore)

Monocromatore di emissione(prisma, reticolo)