RNA interference

phenotype

Forward genetics

Reverse genetics

Ricombinazione omologa in cellule embrionali staminali di topo: topi KO

RNA antisenso

RNA interference

RNA interference:Introduzione nella cellula di RNA a doppio filamento

induce il silenziamento del gene target

Esempio di Silenziamento Genico Post Trascrizionale (PTGS):

Già noto nelle piante: transgeni ad alto numero di copie e altamente trascritti inducono il silenziamento del gene endogeno

Può essere considerato come un primitivo sistema di autodifesa contro RNA esogeno (virus) o RNA endogeno trascritto in modo aberrante (trasposoni)

Un nuovo potente strumento di modulazione dell’espressione genica

Nuove e inattese rivelazione sui meccanismi di regolazione genica

fliesfungi worms mammalsplants

La Scoperta dell’ RNAiPotent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegansFire et al, 1998

In C. elegans:

introduzione di dsRNA è molto più potente nell’indurre il silenziamento genico rispetto a sRNA e asRNA

dsRNA corripsondenti a regioni introniche o al promotore non funzionano

dsRNA microiniettato nelle gonadi induce silenziamento genico in tessuti mitotici: amplification-spreading

In Drosophila:

Un estratto citoplasmatico di Drosophila + luciferasi mRNA esogeno + dsRNA luciferasi: silenziamento genico

dsRNA guida la formazione di un complesso citoplasmatico che determina la degradazione specifica di mRNA omologo

RNA interfernce is mediated by 21 and 22-nucleotide RNAsElbashir et al, 2001

Targeted mRNA degradation by double stranded RNA in vitro Tuschl et al, 1999

In Drosophila:

dsRNA è processato a 21-22nt dsRNA con 5’P, 2nt protruding

21-22-dsRNA sono sufficienti a indurre RNAi

Produzione di siRNA21-22 dsRNA, 5’ P, 2nt overhang

Riconoscimento e taglio endonucleasico del mRNA target

DICER: RNAse III ribonuclease familyspecifico per dsRNAAltamente conservato in flies, plants, worms e human

RISC-RNA Induced Silencing ComplexEndonuclease non identificata: SLICERCopurifica con ARGONAUTE e EIFC2 (elongation factor) e elicasi

DICER

RISC

I vermi sono diversi…

In C. elegans

SPREADING:dsRNA microiniettato nelle gonadi causa RNAi in tessuti mitotici nel resto dell’organismo

AMPLIFICATION: RNAi efficiente anche a partire da quantità minimi di dsRNA

TRANSITIVE RNAi: il silenziamento genico può agire in TRANS e in CIS. Movimento 3’ -5’ dell’attività nucleasica e generazione di nuovi dsRNA

RdRP:RNA polimerasi RNA dipendente

Sid1: canale di membrana

Un ruolo biologico per l’RNAi?

RNAi: Un primitivo sistema immunitario contro virus e retrotrasposons

Inattivazione dell’RNAi causa diffetti nello sviluppo in diversi organismi

Mutationi in ARGONAUTE (dsRNAbinder in RISC) causano diffetti nello sviluppo in A. thaliana, C. elegans e Drosophila

microRNApiccoli (21-22nt) ssRNA scoperti in C.elegans (Lin4 and Let7: worms development)

Altamente conservati nell’evoluzione

Silenziamento genico a livello postraduzionale: mRNA binding-blocco sintesi proteica

21-22 nt single strand RNA processati da dsRNA precursori a 70nt (miRNA)!!

Link to RNAi:DICER ko hanno alti livelli miRNA precursoridi Lin4 e Let7

RISC

DICER

Non solo mRNA….Chromatin remodelling!

Geni non codificanti nell’uomo?

mRNA

tRNA

ncRNA

snRNA: spliceosome

snoRNA: rRNA-tRNA-snRNA modifications

rRNA

GENE

PROTEINA

Cis-AS-RNA: XIST

miRNA

asRNA

NB: computationl tools developed on the basis of known miRNA seq identified 255 putative human miRNA encoding genes!

miRNA nell’uomo

miR181 is a hematopoietic specific miRNA that drive differentiation of stem cell to the Blineage

52% of analized miRNA map to genomic site involved in cancer

mRNA Antisenso nell’uomo

RNAi un nuovo strumento per lo studio della funzione genica nei mammiferi

Major limitationlong dsRNA >30nt is effective in mammals, but induce many protective pathway

Long dsRNA trigger

PKR IFN RNAseL

apoptosis dsRNA degradation

Block of protein synthesis

Phosp of ElF2a

Elbashir, S. M. et al.

Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature (2001). 2nt increase stability

easier synthesis

Source for siRNA:

Dharmacon MWGAmbion

siRNA transfection

TRANSIENT: siRNA are stable, Rate of cell growthDilutionProtein half-life

EFFICIENCY OF TRANSFECTION:Some cells are refractory to transfectionElectroporation leads to cell death

COST:siRNA are chemically sinthetized, therefore very expensive AND NOT RENEWABLE….

Use in vivo?????

siRNA is transfection is very efficient in most cell lines

siRNA silencing is immediate

PRO CONTRO

Vettori a DNA per RNAi ?

promoteri RNA polIII: U6 e H1 sintesi di short hairpin RNA (shRNA) e siRNA in vivo Nessuna sequenza richiesta dopo start site per la trascrizione

TTTT: sufficiente per terminazione

More efficiently processed by DICER!!

DNA mediated RNAi. H1/U6 clonati in vettori plasmidici

VIRUS vector mediated RNAi: H1/U6 clonati in vettori retrovirali: lintegrazione stabile nel genoma

oncoretrovirus MoMuLV or MSCVsilenziamento del provirus durante lo sviluppole cellule devono essere nel ciclo cellulare per poter essere infettate

lentivirus HIV-1nessun silenziamento: Topi transgeniciinfettano cellule quiescenti (cellule staminali….)

PROCheapStable clones for long term experimentsLong half life protein targeted

CONTROInterference require trasncription: timing….Transfection is less efficient

Plasmid vector

retroviral vector

RAS (GTP binding protein): tra gli oncogeni più frequentemente mutati nei tumori umani (30-50%)

(RAS-v12: Attivazione costituiva nello stato legato a GTP)

Proliferazione, differenziamento, migrazione e sopravvivenza cellulare.

wtRAS è essenziale per la sopravvivenza della cellula

Growth signal RAS proliferazione

H1 promotercloned in ppMSCV puro retroviral vector:pRETROsuperStably integrates in cell genome

retroviral vector

siRNA nel trattamento dei tumori umani:Terapia anticancro:

Nessuna tecnologia è in grado di colpire esclusivamente l’espressione di un oncogeno mutante attivato

tetOFF/ON H1 and U6 promoter system

Limitazioni dell’RNAi stabile:

impossibile studiare geni essenziali per sopravvivenza cellulare (housekeeping) e sviluppo

Sviluppo di nuovi vettori per l’espressione condizionale-inducibile dei shRNA

tossicitàbackground

Disegnare l’siRNA perfetto

1) stability of the hairpin2) access to RISC

9nt loop2nt TT overhangLow GC content

Empirical observationStructure of miRNA

Mittal, Nature Review Gentic, 2004

Regole per la produzione di siRNA

29 su 30 dsRNA inducono più 50% silencing su 6 geni target

Specificità…?

SI NO

siRNA against endogenous GFP expression didn’t affecct any other gene

siRNA against endogenous gene can affect other genes with weak sequence similarity

Use indipendent siRNA against same target

Rescue the observed Loss of Funtion phenotype by expressing the target gene with a silent mutation in the target region

High-throughput functional screenings

Genomewide screenings for critical players in human cancer

normal cell cancer cell

Genetic lesions

Attivazione di ONCOGENi

Inattivazione di TUMOR SUPPRESSOR

controlled growth uncontrolled growth

Tumori diversi hanno caratteristiche comuni

Hannan and Weinberg, 2000

p53pRb

Tumor suppressors

Target mRNA

Overspressione di un oncogene

Silenziamento di un TS

Possibile ruolo dei miRNA nei tumori umani

Normal cell + siRNA library

Cancer cell + siRNA

Identificazione di nuovi oncogeni o TS

Tumor phenotype

reversion of tumor phenotype

RNAi silenzia un Tumor suppressor

RNAi silenzia un oncogene

?

Genome wide functional screenings

Sequenziamento del genoma umano

Annotazione di tutte le possibili ORF

Costruzione di siRNA contro tutti i geni umani

Loss of funtion screenings by RNAi

Infect cells

with siRNA library

Phenotype of interest

The targeted gene is required for the phenotypeHow can we identify the targeted gene?

PCR with primer flanking the siRNA encoding DNA sequnece cloning sequencing

CELL SYSTEMPrimary Human fibroblast (BJ) infected with temperature sensitive LargeT from SV40:

ASSAY

Colony formation: primary cells plated at low density undergo growth arrest and senescence

Human fibroblast (BJ)+ts largeT

PCR with primer flanking the siRNA oncoding DNA sequence

cloning

sequencing

single clone isolation

shRNA library: 7914 genesCell-cycleTranscriptionSignal transductionMethabolismGenes involved in cancer

To increase knockdown:

3 shRNA/gene70%inhibition for 70% of the genes

RPS6KA6, HTATIP, HDAC4, CCT2, KIAA0828

THE EFFECT IS GENE SPECIFIC

THE targeted GENES ARE IN THE p53 PATHWAY

IONIZING RADIATION

U2OS: osteosarcoma cells

p21bax

Identified genes affect the expression of a p53 target gene

Limitations: single clone isolationre-cloning and retesting

siRNA BAR-CODE screens

Relative abundance of BARCODE in a cell population reflect the effect of the knockdown on cell viability

Infect cells

Single cell derived clones

PCR of hairpin sequence

Re-Cloning and sequencing

Test again

select phenotype

Fluorescent labelingHybridize to DNA Microarray containing hairpin sequences from library

Identification of highly represented shRNA

Infect cells select population with phenotype

Stably integraetd vectors introduce a molecular fingerprint in the infected cell: The 19 hairpin sequence is gene specific and behave as a MOLECULAR BARCODE

Silenziamento genico specifico, efficiente e stabile nel tempo (economico e veloce).Genetica inversa alla portata di tutti.

Genome-wide functional screenings.

Terapia genetica antitumorale.

Rivoluzione nella comprensione dei meccanismi di regolazione dell’espressione genica.