RNA RNA interferenceinterference e sue e sue applicazioniapplicazioni

Cosa è l’RNA interference

Come funziona

Funzione biologica nei diversi organismi

Come può essere utilizzata per fini applicativi e

di genetica funzionale

Che cosa è l’ RNA interference?

•L’RNA interference (RNAi o shRNA) è un fenomeno di silenziamentopost-trascrizionale dell’espressione genica (PTGS) -> Knockdown dell’mRNA

• E’ basato sull’ attivazione del processo di degradazione dell’RNA citoplasmatico sequenza- specifico

• Meccanismo di silenziamento genico presente ed applicabile in protozoi, nematodi, Drosophila, piante, funghi e mammiferi

• I ruoli biologici dell’RNAi sono molteplici: difesa da virus patogeni ad RNA, da elementi genetici mobili come trasposoni, regolazione dell’espressione genica endogena, modulatore dei processi di sviluppo embrionale, azione sul patrimonio genico

Annullamento della funzione di un gene

Knock out Knock down

Eliminazione dell’mRNA del gene

Mediante RNA antisenso,

oligodeossinucleotidi, ribozimi, o RNAi

Eliminazione del gene

Mediante inattivazione genica specifica (ad es.

iniezione del gene interrotto nell’oocita

fecondato o nelle ES)

Precedentemente si era osservato nelle piante ……

• Richard Jorgensen, nel 1990, nel tentativo di up-regolare la pigmentazione di petunie transgeniche, ha introdotto il transgene della calcone sintasi (chsA), enzima implicato nella produzione delle antocianine

?cosoppressione

La perdita di chsA mRNA citosolico non era associata ad una ridotta trascrizione ma l’espressione del transgene portava alla formazione di dsRNA a causa di sequenze ripetute

……poi in altri organismi

• sono in grado di rispondere all’infezione da RNA virali portando il genoma virale alla degradazione meccanismo di difesa

• Meccanismi analoghi si ritrovano anche in Neurospora, nei metazoi come Drosophila, C.elegans e nei mammiferi

Piante

DrosophilaCellule HeLa

C. elegans

Quelling in Neurospora crassa

In Neurospora crassa l’introduzione del transgene causa il silenziamento del gene omologo endogeno albino-1 (al-1) codificante una proteina del pathway biosintetico dei carotenoidi

wt wt + transgene al-1

Romano e Macino (1992)Cogoni et al., (1996)

al-1 mutante

Il transgene causa la soppressione sia del gene endogeno che esogeno

Modelli di studio dell’ RNAi

- studi genetici in C. elegans e in piante

- studi biochimici in estratti di Drosophila

L’RNAi avviene in tutti gli organismi con meccanismi di base comuni che poi si specializzano a seconda del tipo di funzione biologica

Evidenze in Drosophila in vitro e in vivo

-Estratti embrionali di Drosophila (cellule S2)

- Iniezione di dsRNA in cellule S2

a AAAAAAAAAAAA

+mRNA luciferasi

luciferasi

bAAAA

AAAA

+ AAAA

dsRNA > 500 nucleotidi+

Prima fase:processamento del dsRNA in frammenti di 21-23 nt

• dsRNA (>500 nucleotidi) incubato con lisati di embrioni di Drosophila viene processato a specie di 21-23 nucleotidi

• Il processo richiede ATP

• dsRNA diretto contro sequenze introniche sono inefficienti per il silenziamento

• CHI PROCESSA dsRNA?

3427212016 siRNA

Zamore et al., (2001)

Gli siRNA hanno una struttura definita

19 nt duplex

2 nt 3’’overhangs

Filamento senso

Filamento antisenso

P--P

-OHOH-

siRNA hanno la stessa struttura dei prodotti di digestione della RNA-asi III di E.coli

Fase I: processamento del dsRNA in frammenti di 21-23

Dicer

-Isolato in estratti di embrioni di Drosophila

- Interferenza con la funzione di Dicer riduce la capacita’ di silenziamentogenico

- Il mutante DCR-1in C.elegans produce un omologo di Dicer ed e’incapace di effettuare il silenziamento genico

short-interfering RNA

Dicer contiene 4 distinti dominiDCR-1 (C. elegans)

CAF/SIN-1(Arabidopsis thaliana)

“Dicer” e “Drosha” in mammals and Drosophila

Organismi mutanti per Dicer hanno difetti nello sviluppo

- RNA elicasi N-t ATP dipendente

- 2 domini RNA-asi III

- dsRNA binding domain c-t

- dominio PAZ (Piwi,Argo,Zwille/Pinhead che condivide con proteine RDE1/QDE2/Argonaute, associate al processo di inteference)

- Funziona come enzima dimerico

Fase II: il complesso RISC

Il prodotto di Dicer RNAiviene rilasciato ed incorporato nel complesso RISC, complesso RNA nucleasico-proteico che degrada l’mRNA target

Taglio endonucleoliticonella regione di omologia tra RNAi e mRNA, nel mezzo della regione duplex

Riepilogo del meccanismo

RISC contiene- contiene una elicasiche srotola il dsRNA

-endoribonucleasiresponsabile del taglio sull’mRNA

(21-23 nt)

Solo uno dei 2 filamenti di RNA viene caricato su RISC

Viene scelto il filamento termodinamicamente meno stabile al 5’

Fase II: il complesso RISC

• complesso nucleasico-proteico

• contiene una elicasi ed una endoribonucleasi

• si associa all’RNAi

• taglia l’mRNA 11-12 nucleotidi a valle dal 5’ dell’RNAi

• l’mRNA viene successivamente degradato molto probabilmente da una esonucleasi

• in alcuni organismi i frammenti di mRNA possono essere convertite in dsRNA da una RNA polimerasi RNA dipendente(RdRP) AMPLIFICAZIONE

Amplificazione dell’RNAiMeccanismo noto in C.elegans, N.crassa, Dictyostelium discoideum, piante ma non nei mammiferi

RNA-dependent RNA polymerase (RdRP)

• poche molecole di siRNA sono sufficienti per portare alla continua degradazione dell’mRNA (in piante e C.elegans)

• in estratti embrionali di Drosophila si sono isolati dsRNA completi generati da siRNA marcati

• sia dsRNA che ssRNAsono utili per funzionare da templato per la RdRP

• la RdRP richiede siRNA che abbiano P-5’ e OH-3’ per l’amplificazione

• nelle piante e nei nematodi l’effetto di silenziamento si diffonde anche nelle cellule circostanti, e viene ereditato anche dalla progenie

• in C.elegans la proteina di membrana SID-1 permette il trasporto di dsRNA da cellula a cellula

E in cellule di mammifero?

PKR

PP

PEIF2α

dsRNA

Blocco della sintesi proteica

Produzione diinterferone

Mortecellulare

apoptosi

Attivazione della protein-chinasi RNA dipendente

2’-5’ oligoadenilatosintasi

RNA-seL

E in cellule di mammifero?

Kumar M, Carmichael GG. “Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes.”Microbiol Mol Biol Rev (1998) 62:1415-34

E in cellule di mammifero?

• Tuschl e colleghi hanno dimostrato che l’introduzione diretta di dsRNAdi 20 nucleotidi, che simulano i prodotti di degradazione di Dicer, e’efficiente nel silenziamento e non scatena la risposta dell’interferone

• gli siRNA vengono direttamente incorporati da RISC

• gli siRNA non sono riconosciuti da PKR

• nei mammiferi l’effetto dell’RNAi e’ transiente poiche’ non c’e’amplificazione

Funzioni biologiche dell’RNAi

Negli animali e nelle piante sono presenti piccoli RNAs di 21-23 nucleotidi, che regolano post-trascrizionalmemte l’espressione di alcuni geni. Il meccanismo con cui agiscono comprende 2 diversi pathway: siRNA e stRNA

siRNA (small interfering RNA) quando questi RNA degradano l’mRNA tramite appaiamento sequenza specifica

stRNA (small temporal RNA) quando bloccano la traduzione dell’mRNA tramite appaiamento non perfettamente sequenza-specifico

• abbondanti in tutti i tipi cellulari anche in cellule di mammifero

• molecole di RNA a singolo filamento ma che si conformano in strutture ad hairpin a causa di zone di complementarieta’

• variano da poche centinaia per cellula a 40.000 molecole per cellula

• Vengono codificati dal genoma

• Regolano l’espressione di geni distinti attraverso appaiamento di basi, inibendo la traduzione in proteine

• miRNA regolano geni diversi (circa 100 geni/miRNA)

siRNA microRNA

Degradazione dell’mRNA Blocco della traduzione

• Il grado di inibizione della traduzione da parte di miRNA dipende da quante molecole di miRNA sono legate all’mRNA target

• Diversi miRNA possono avere un unico mRNA nella regione al 3’ non tradotta come target

• non codificano proteine

COSA FANNO I MicroRNA?-Nei nematodi e nelle piante regolano lo sviluppo

- In Drosophila regolano la divisione cellulare e la morte cellulare

- Nelle cellule umane regolano l’espressione genica e il differenziamento cellulare

A seconda del grado di appaiamento con l’mRNA target i miRNA possono anche portare alla degradazione

- miR-375 (nell’uomo) e’ naturalmente espresso nel pancreas-> la sua espressione sopprime la secrezione di insulina

stRNA o microRNA e siRNA

stRNA in C.elegans

Nei nematodi le fasi di sviluppo sono regolate dai geni eterocronicilin-4 e let-7, che espressi in momenti diversi, controllano il susseguirsi dello sviluppo larvale

Early Late AdultLin-14 Lin-41

Lin-4 Let-7

Espressione proteica dei geni eterocronici

Proteina e RNA di lin-14 e lin-4Studio dei mutanti Lin14gain of function e Lin4 loss of function:non diventano adulti

Proteina ·Lin-4 ha una sequenza complementare a lin-14

·Nel mutante gain of functionci sono mutazioni nella regione di formazione del duplex

·Lin-4 blocca la traduzione di lin-14

Alti livelli di RNA non si traducono in alti livelli di proteina:regolazione dell’mRNA

10x

RNA

7 siti di complementarieta’tra lin-4 e lin-14

MicroRNA che inibiscono la traduzione

Tra i fenomeni di silenziamento post-trascrizionale(impiego di ODN e ribozimi) l’RNAi e’ il piu’ efficace nel bloccare l’espressione di un gene- Silenziamento prossimo al 100%- Occorrono basse concentrazioni di interferente

Applicazioni di RNAi

• Ricerca biologica– Definire funzioni geniche (alternativa al

difficile e laborioso knockout) • C. elegans genome RNAi projects

– Definire pathways biochimici• microarray screening di RNAi knockdown su

p53

• Trattamenti terapeutici– cancro– Infezioni virali– Infezioni da parassiti– Malattie neurodegenerative– Malattie geniche dominanti

Modalita’ di somministrazione

• siRNA sintetici: facile, si possono provare molti target contemporaneamente ma costoso, effetto non duraturo(la durata dipende dal tipo cellulare)

- Sintesi chimica di nucleotidi ad RNA- Trascrizione in vitro di corti RNA- Trascrizione in vitro di lunghi RNA seguito da taglio con RNA-asiIII

• Vettori a DNA: duraturi, problema dell’integrazione random

- Plasmidi- Vettori virali

•Geni RAS frequentemente mutati nel cancro (soprattutto nel cancro del pancreas 85% e del colon 40%)

•Le proteine codificate dai geni RAS (K-RAS, H-RAS e N-RAS) regolano proliferazione, differenziamento e sopravvivenza cellulare trasduzione del segnale

•Mutazioni puntiformi bloccano la proteina oncogenica RAS mutata in una forma legante GTP persistentemente attivata

•La proteina wild-type e’ essenziale per lo sviluppo dell’organismo topi nullizigoti per K-Ras muoiono nella fase embrionale

Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference

Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Cancer Cell 2002 Sep;2(3):243-7

Come eliminare la funzione dell’allele mutato endogeno K-RasV12?Carcinoma del

pancreas

L’RNAi K-RASV12 e’ specifico per l’allele mutato!

Come rendere le cellule che portano l’allele mutato stabilmente trasfettate con l’interferente

per K-RasV12? Vettore retrovirale

Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference

Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Cancer Cell 2002 Sep;2(3):243-7

Le cellule wt non crescono su soft agar

Topi nude iniettati con CAPAN-1

Trasfettate con H-Ras oncogene

Grande passo avanti per la terapia genica

•Specificita’ del target

•Riduce lo sforzo di lavorare sul vettore per conferire il tropismo per cellule target

•Le cellule “normali” non vengono danneggiate

• Approccio utile non solo per geni con mutazioni puntiformi ma anche per traslocazioni

cromosomiche