Parametri NMRAccoppiamento Scalare

Mario PiccioliMagnetic Resonance Center

CERMDepartment of Chemistry

University of Florence, Italy

Ringraziamenti

M.Levitt Spin DynamicsJ. Keeler Understanding NMR Spectroscopy

H.Gunther NMR Spectroscopy

Stefano MammiStefano ChimichiAlessandro BagnoDaniel CiceroPaola Turano

Termini dell’Hamiltoniano di spin

Meccanismi di accoppiamento

La partecipazione degli elettroni cambia il modo in cui l’interazione tra spin é dipendente dalla loro riorientazione

Pertanto, quando in un liquido isotropico le interazioni sono mediate per effetto del moto, rimane un termine isotropico.

Esso fornisce una diretta evidenza spettrale dei legami chimici e pertanto é un prezioso strumento per la determinazione strutturale

Gli effetti di accoppiameno dipolare indiretto sono SOLO INTRAMOLECOLARI

L’effetto é misurabile sono per un limitato numero di legami chimici

Significato fisico della J

Significato fisico della J

Accoppiamento scalare

13C 1H

13C

1H

Accoppiamento scalare

13C 1H

13C

1H

Accoppiamento scalare

1H 13C

S I

α α

β

β

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

E= -1/2 γ ħB0= - miνi

mi= - ½ , ½

E

-1/2 νA -1/2 νX

-1/2 νA +1/2 νX

+1/2 νA -1/2 νX

+1/2 νA +1/2 νX

E= -∑i miνi

Due spin isolati

νA

νA

νX

νX

E= -1/2 γ ħB0= - miνi

mi= - ½ , ½

E

-1/2 νA -1/2 νX

-1/2 νA +1/2 νX

+1/2 νA -1/2 νX

+1/2 νA +1/2 νX

E= -∑i miνi +∑ij Jijmimj

Due spin accoppiati

+1/2 νA +1/2 νX +1/4 JAX

+1/2 νA -1/2 νX -1/4 JAX

-1/2 νA +1/2 νX -1/4 JAX

-1/2 νA -1/2 νX +1/4 JAX

νA

νA

νX

νX

νX+ ½ JAX

νX- ½ JAX

νA- ½ JAX

νA+ ½ JAX

Accoppiamento debole

J<<∆ν

Accoppiamento scalare

CH3-CH2-OH

Accoppiamento scalare

2J

3J

3J

2JHβHβ’

3JHαHβ

3JHΝHα

Accoppiamento scalare

1JHC

1JHN

1JCC

n.Spin X Spin A osservato

0 νA

1 νA± ½ JAX

2 νA± ½ JAX ± ½ JAX

3 νA± ½ JAX ± ½ JAX ± ½ JAX

Freq. A osservate

Molteplicità dell’accoppiamento

Molteplicità dell’accoppiamento

Accoppiamento scalare

Accoppiamento scalare

Il segno della costante

A X A XA X

ββββ αααα ββββ αααααααα ββββ αααα ββββ

L’effetto del campo magnetico

Sistemi del 1°ordine

Accoppiamento debole

J<<∆ν

Separazione in frequenza almeno pari a 10*J

Se aumento il campo magnetico, ∆ν aumenta e J rimane costante

Aumentare il campo magnetico semplifica l’analisi dei sistemi di spin

Torneremo dopo sul concetto di accoppiamento forte e accoppiamento debole

Ma intanto ricorda che…Esperimenti in rotating frame (TOCSY, ROESY, DIPSI, sono se mpre in accoppiamento forte)

Gli esperimenti heteronucleari HSQC, HMQC, INEPT di og ni tipo…) sono sempre in accoppiamento debole

Sistema AX

Sistemi di spin A2X3

Combinando insieme accoppiamenti diversi

Sistema AMX

Sistema AMX

Spettri del 2°ordine

Accoppiamento forte significa che l’accoppiamento è forte rispetto alla differenze di energia dei livelli energetici del sistema, che determinano poi le frequenze di transizione

In effetti un accoppiamento tra due spin non cambia di valore, è il resto del sistema che cambia nel passaggio da accoppiamento forte ad accoppiamento debole

νννν1,2,3,41,2,3,41,2,3,41,2,3,4=(ννννA+ννννB)/2 ±D/2 ±J/2 νννν1,21,21,21,2=ννννA ±J/2 νννν3,43,43,43,4=ννννB ±J/2

Spettri del 2°ordine

Sistema AB

J=5Hz

I2/I1=∆ν1,4/∆ν2,3

(2C)2= (νΑ–νΒ)2 +J2

Misure dirette

JAB

2C

Sistema AB

Sistema AB

Sistema AB

From AX2 to AB2

500 MHz

200 MHz

From AX2 to AB2

From AX2 to AB2

Sistema AB2

Sistema AB2

Sistema AB2

Sistema ABX

Sistema ABX

Accoppiamento forte e accoppiamento debole

2 spin

Accoppiamento forte e accoppiamento debole

Accoppiamento debole

Accoppiamento debole

Accoppiamento forte

Accoppiamento forte

Spin Magneticamente Equivalenti

Singlet-triplet basis

Multipletti e larghezza di riga

La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T2.

In prima approssimazione, il T2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata.Piu’ la molecola è grande, piu’ il T2 è corto e piu’ i segnali sono larghi

In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto.In queste condizioni, l’accoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili

3-10 Hz

15 HzMW ca. 5000

20-35 HzMW. 10-20000

N

Importante

3J dipendono dall’angolo

diedro

INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE

3JHNHαααα= Acos2φφφφ + B cosφφφφ +C

DeMarco, Llinas, Wutrich, Biopolymers, 1978

Karimi Nejad, Schmidt, Ruterjans, Schwalbe, Grieseinger, Biochemistry, 1994

3J 1Hb-15N

Ogni costante di accoppiamento 3J

sottende un angolo diedro

3J 1Ha-1Hb

Angolo diedro χ1

Schmidt, Blumel, Lohr, Ruterjans, J. Biomol. NMR 1999

Per ogni curva di Karplus i coefficenti sono calcolati in base al confronto tra valori sperimentali e parametri

strutturali e validati con vari strumenti

3J C’C ’

N

13C Direct Detected COCO-TOCSY

a. diedro φφφφ

Accoppiamento scalare rende possibile un trasferimento di magnetizzazione tra i spin accoppiati

Questa proprietà é del tutto indipendente dal fatto che un accoppiamento sia “visibile” o “invisibile” in un esperimento NMR come

Nella maggior parte dei casi gli accoppiamenti scalari sono invisibili, ma misurabili anche in modo quantitativo attraverso NMR multidimensionale

Accoppiamento e Magnetizzazione

Heteronuclear cases

The scheme of 1J scalar couplings

The 2D Hetcor experiment

Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment

2D HETCOR Expriment

2D HETCOR Expriment

Prima dimensione

2D HETCOR Expriment

Prima dimensione

2D HETCOR Expriment

Prima dimensione

Seconda dimensione

2D HETCOR Expriment

Prima dimensione

Seconda dimensione

EsempioHETCOR

514

32

1J couplings for backbone resonances

Ca2+

Apo Cb @ 3.3 M GdmCl

Loss of secondary structure elements: unfolded protein

Refolding

Ca2Cb @ 3.3 M GdmCl

The role of metal cofactor in protein unfolding

Metal triggered protein folding

7795

5935

26

60

45 96 7

33

20

34

27

75

15 6

62

65

9472

90

137812

80

100

8

8846

4286

87

81

8568

102

582

5254 55

71

56 91

29

66

36

328

38101

255898 53

76

1674

8430

21

3969

40

9767

37

41

99 1443

6489

2448

5147

11

23

9357 19

4 10

83

22

1779

HNε1 83

HNδ 28

HNε 32

Apo vs holo protein, mapping the Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ionenvironment of the metal ion

15N

15H

3J NiC’ j

Ma il legame a idrogeno é una interazione elettrostatica?

N

O

C

3J !

Eteronuclei

205Tl in Transferrina2J 205Tl-13C

270-290Hz

Fe3+

o oC

o

Aramini et al. Biochemistry 1994

Utschig, Bryson, O’Halloran, Science 1995

199Hg

Eteronuclei