Esperimenti FT-NMR a impulsi · Esperimenti FT-NMR a impulsi Sequenza di impulsi PW = ampiezza...

Esperimenti FTEsperimenti FT--NMR a impulsiNMR a impulsi

Sequenza di impulsi Sequenza di impulsi

PW = ampiezza dell’impulsoPW = ampiezza dell’impulsott11 = tempo di = tempo di asquisizioneasquisizionedd11 = tempo di recupero (= tempo di recupero (delaydelay) )

Recupero della magnetizzazione MRecupero della magnetizzazione M00

La RF applicata contiene un intervallo di La RF applicata contiene un intervallo di frequenze centrate alla frequenze centrate alla frequenzzafrequenzza νν00. La . La durata dell’impulso dipende dall’ampiezza durata dell’impulso dipende dall’ampiezza dello spettro osservata. Si usano impulsi dello spettro osservata. Si usano impulsi brevi e di elevata potenza per garantire brevi e di elevata potenza per garantire l’eccitazione di tutti i nuclei in quanto si l’eccitazione di tutti i nuclei in quanto si genera una banda larga (di frequenze).genera una banda larga (di frequenze).

L’accumulo di molti FID consente di L’accumulo di molti FID consente di migliorare il rapporto S/N. Il rapporto migliorare il rapporto S/N. Il rapporto S/N aumenta proporzionalmente alla S/N aumenta proporzionalmente alla radice quadrata del radice quadrata del numero di numero di scansioniscansioni

SN

~ nScan


Dipendenza della fase del segnale dalla direzione dell’impulsoDipendenza della fase del segnale dalla direzione dell’impulsoQueste sequenze vanno sotto il nome di “Queste sequenze vanno sotto il nome di “phasephase cyclingcycling” e ” e sono alla base delle moderne tecniche di indagine NMR.sono alla base delle moderne tecniche di indagine NMR.

Si registra un segnale RF oscillante nel tempo che tende a decadSi registra un segnale RF oscillante nel tempo che tende a decadere in seguito ai ere in seguito ai processi di rilassamento (FID). Si registra l’intensità del segnprocessi di rilassamento (FID). Si registra l’intensità del segnale in funzione del ale in funzione del tempo!!!!tempo!!!!

Al fine di ottenere l’informazione di frequenza si applica la trAl fine di ottenere l’informazione di frequenza si applica la trasformata di asformata di FourierFourier..


Esperimenti NMREsperimenti NMR--2D2DNegli esperimenti bidimensionali, le due dimensioni sono rappresNegli esperimenti bidimensionali, le due dimensioni sono rappresentate da entate da due assi che riportano misure di frequenza (due assi che riportano misure di frequenza (chemicalchemical shiftshift); in realtà ); in realtà l’intensità del segnale è nella terza dimensione! Si eseguono dul’intensità del segnale è nella terza dimensione! Si eseguono due trasformate e trasformate di di FourierFourier su due domini dei tempi indipendenti e ottenuti da opportune su due domini dei tempi indipendenti e ottenuti da opportune sequenze di impulso. sequenze di impulso.

ννAA

ννxx

ννxx ννAA

νν11

νν22

IntensitàIntensità

Prototipo di sequenza per un Prototipo di sequenza per un esperimento 2D; il tempo esperimento 2D; il tempo incrementale incrementale ∆∆tt1 1 ((µµss) e il tempo di ) e il tempo di acquisizione acquisizione tt22 (s) sono trasformati (s) sono trasformati (FT) nei valori di frequenza (FT) nei valori di frequenza νν11 e e νν22delle due dimensioni. delle due dimensioni.

Esperimenti NMREsperimenti NMR--2D2D

Tutte le sequenze biTutte le sequenze bi--dimensionali si basano sullo stesso principio e dimensionali si basano sullo stesso principio e hanno un formato base che può essere suddiviso in 4 fasi:hanno un formato base che può essere suddiviso in 4 fasi:1.1.PreparazionePreparazione2.2.EvoluzioneEvoluzione3.3.MixingMixing4.4.Detection (Acquisizione del segnale)Detection (Acquisizione del segnale)

Nel periodo di evoluzione si determinano le condizioni per la seNel periodo di evoluzione si determinano le condizioni per la seconda conda dimensione in quanto consente l’ottenimento di una variazione dedimensione in quanto consente l’ottenimento di una variazione della lla magnetizzazione in funzione del tempo.magnetizzazione in funzione del tempo.

Esperimenti NMREsperimenti NMR--2D2DConsideriamo la seguente sequenza a due impulsi di 90° applicataConsideriamo la seguente sequenza a due impulsi di 90° applicata ad ad un sistema con un solo nucleo, es. CHClun sistema con un solo nucleo, es. CHCl33. .

Effetto della sequenza a due Effetto della sequenza a due impulsi sulla magnetizzazione impulsi sulla magnetizzazione netta. netta.

Evoluzione in base al Evoluzione in base al chemicalchemical shiftshift

L’intensità del segnale L’intensità del segnale dipenderà dal fattore dipenderà dal fattore

sinsin360360ννtt1 1 e sarà correlata al e sarà correlata al tempo di evoluzionetempo di evoluzione


Analizzando i vari FID ottenuti variando il tempo di evoluzione Analizzando i vari FID ottenuti variando il tempo di evoluzione tt11, si ottengo una serie di , si ottengo una serie di spettri i cui segnali mostrano una intensità che varia nel tempospettri i cui segnali mostrano una intensità che varia nel tempo. . Nel’Nel’esempio è riportato il esempio è riportato il risultato relativo al CHClrisultato relativo al CHCl33. .

Si riconosce una Si riconosce una modulazione di ampiezzamodulazione di ampiezza nel tempo. nel tempo. Il segnale inoltre diminuisce di intensità per alti valori di Il segnale inoltre diminuisce di intensità per alti valori di tt11a causa del rilassamento Ta causa del rilassamento T22**


La variazione di intensità nel tempo La variazione di intensità nel tempo consente di ricavare un secondo FID che consente di ricavare un secondo FID che è funzione di è funzione di tt11. Sottoponendo questo . Sottoponendo questo nuovo FID creato “artificialmente” è nuovo FID creato “artificialmente” è possibile ricavare la seconda possibile ricavare la seconda dimensione dimensione ff11 con l’informazione di con l’informazione di chemicalchemical shiftshift. .

ff22

ff11

La notazione La notazione ff11 e e ff22 segue l’ordine derivante dai tempi segue l’ordine derivante dai tempi tt11 ee tt22. .

ff22

ff11 ννAA

ννxxννxx ννAA

Esperimenti NMREsperimenti NMR--2D2DRappresentazione di uno Rappresentazione di uno spettro 2D come spettro 2D come contourcontour plot plot con curve di livellocon curve di livello


Esperimenti di correlazione attraverso i legami:Esperimenti di correlazione attraverso i legami:--OmonucleareOmonucleare

COSY, DQFCOSY, DQF--COSY, COSY, COSYCOSY--ββ , TOCSY, INADEQUATE ….., TOCSY, INADEQUATE …..

--EteronucleareEteronucleare

HMQC, HSQC, HMBC, HETCOR …….HMQC, HSQC, HMBC, HETCOR …….

Esperimenti di correlazione attraverso lo spazio: effetto NOEEsperimenti di correlazione attraverso lo spazio: effetto NOE--OmonucleareOmonucleare

NOESY (1D, 2D), ROESY (1D, 2D), EXSY …..NOESY (1D, 2D), ROESY (1D, 2D), EXSY …..

--EteronucleareEteronucleare

HOESY ….HOESY ….

COSY: COSY: COCOrrelationrrelation SSpectroscoppectroscopYYIn questo tipo di tecnica 2D si ritrovano diverse sequenze d’impIn questo tipo di tecnica 2D si ritrovano diverse sequenze d’impulso che consentono di ulso che consentono di realizzare esperimenti di diverso tipo (COSY, DQFrealizzare esperimenti di diverso tipo (COSY, DQF--COSY, COSY, COSYCOSY--bb, COSY, COSY--90). Da questi 90). Da questi esperimenti è possibile ricavare informazioni riguardanti la coresperimenti è possibile ricavare informazioni riguardanti la correlazione di protoni (o nuclei dello relazione di protoni (o nuclei dello stesso tipo) accoppiati tra loro a 2 o 3 legami (accoppiamento sstesso tipo) accoppiati tra loro a 2 o 3 legami (accoppiamento scalare).calare).

O

OAcAcO

O

OAcAcO

O

HNN3

O

O

A B

12

34

561

2

34

56

Spettro COSY 500 Spettro COSY 500 MHzMHzdi un di un carbopeptidecarbopeptide. I due residui dello zucchero . I due residui dello zucchero sono contrassegnati con le lettere sono contrassegnati con le lettere AA e e BB. In . In rossorosso sopra la diagonale sono evidenziate le sopra la diagonale sono evidenziate le correlazioni per lo zucchero correlazioni per lo zucchero AA e in e in neronero, sotto la , sotto la diagonale, quelle per lo zucchero diagonale, quelle per lo zucchero BB

COSY: COSY: COCOrrelationrrelation SSpectroscoppectroscopYY

11

33 33225555448 + 68 + 677

COSY: COSY: COCOrrelationrrelation SSpectroscoppectroscopYY

CH2

CH2

CH3H3C

H

HO

21

3

4

5

6

7

8

1

Esperimenti di correlazione attraverso i legami: Esperimenti di correlazione attraverso i legami: EteronucleareEteronucleareIn questo tipo di esperimenti è possibile ricavare informazioni In questo tipo di esperimenti è possibile ricavare informazioni di correlazioni tra di correlazioni tra eteronucleieteronuclei. Ad esempio nella correlazione . Ad esempio nella correlazione 1313CC--11H è possibile risalire ai carboni H è possibile risalire ai carboni direttamente legati a protoni. Usando particolari sequenze è posdirettamente legati a protoni. Usando particolari sequenze è possibile fare sibile fare correlazioni a lunga distanza. correlazioni a lunga distanza.

HETCOR: con HETCOR: con rilevazione sul rilevazione sul

canale del Carboniocanale del Carbonio

HMQC, HSQC, HMBC: con HMQC, HSQC, HMBC: con rilevazione sul canale del rilevazione sul canale del

protoneprotone

HETCOR: con rilevazione sul canale del CarbonioHETCOR: con rilevazione sul canale del Carbonio

C6C6C7C7 =CH=CH22

C8C8 C4(OH)C4(OH) C3C3 C5C5

C2C2C1C1

HMQC (HMQC (HeteronuclearHeteronuclear Multiple Quantum Multiple Quantum CorrelationCorrelation) ) con rilevazione sul canale del protonecon rilevazione sul canale del protone

CH2

CH2

CH3H3C

H

HO

21

3

4

5 6 7

8

1

HMBC (HMBC (HeteronuclearHeteronuclear Multiple Multiple BondBond CoherenceCoherence) con rilevazione sul canale ) con rilevazione sul canale del protone. Si osservano correlazioni long del protone. Si osservano correlazioni long rangerange 22JJCHCH e e 33JJCHCH

Il tempo delay 1Il tempo delay 1\\2J 2J puopuo’ ’ essereessereottimizzatoottimizzato a a secondaseconda delladella J J cheche sisidesideradesidera trovaretrovare. . NelloNello spettrospettro HMBC non HMBC non sisi osservanoosservano le le costanticostanti direttedirette. .

CH2

CH2

CH3H3C

H

HO

21

3

4

5

6

7

8

1

NOESY (NOESY (NuclearNuclear OverhauserOverhauser SpectroscopySpectroscopy))E’ una tecnica utile per le analisi strutturali e le determinaziE’ una tecnica utile per le analisi strutturali e le determinazioni oni stereochimichestereochimiche. Si sfrutta l’interazione dipolare (NOE) tra nuclei . Si sfrutta l’interazione dipolare (NOE) tra nuclei spazialmentespazialmente vicini. I picchi di correlazione sono in antifase rispetto allavicini. I picchi di correlazione sono in antifase rispetto alladiagonale. diagonale.

H10

2.672.67HH1616

2.06, H2.06, H1717

2.40, H2.40, H1313

3.35, H3.35, H1111

4.18, H4.18, H1010

5.29, H5.29, H55

NOESY (NOESY (NuclearNuclear OverhauserOverhauser SpectroscopySpectroscopy))

scambio

scambio

CorrelazioneH13 – H17

2.992.99OHOH3.04, 2.303.04, 2.30CHCH2220.4620.4618182.06, 1.882.06, 1.88CHCH2235.8535.851717

2.672.67CHCH40.8240.821616qq42.9942.991515

2.442.44CHCH3343.1243.1214142.59, 2.402.59, 2.40CHCH2246.4746.471313

3.843.84CHCH3356.4056.4012123.353.35CHCH58.9258.9211114.184.18CHCH66.4366.4310104.894.89CHCH91.3991.39996.666.66CHCH113.03113.03886.576.57CHCH119.58119.5877

qq127.30127.30665.295.29CHCH128.30128.3055

qq131.13131.13445.715.71CHCH133.43133.4333

qq142.23142.2322qq146.38146.3811

11H(H(ppmppm))1313C (C (ppmppm))

Spettro 1H 600 MHz chinina

HUN

HT

HU

HT1HT2HO HN

HR

HPHQ

HSHFHK

HL

HOHG

NH3CO

1

2 3

45

HHT1T1

HHUU

HHT,T2T,T2

HHSS

HHR,QR,QHHSS

DMSODMSO

HHOOHHNN

HHL,KL,K

HHGG

OHOH

HHFF

CHININACHININA

COSY (COSY (CorrelationCorrelation SpectroscopySpectroscopy) CHININA) CHININA

HUN

HT

HU

HT1HT2HO HN

HR

HPHQ

HSHFHK

HL

HOHG

NH3CO

1

2 3

45

NOESY (NOESY (NuclearNuclear OverhauserOverhauser SpectroscopySpectroscopy) CHININA) CHININA

HUN

HT

HU

HT1HT2HO HN

HR

HPHQ

HSHFHK

HL

HOHG

NH3CO

1

2 3

45

In blu sono indicati i picchi di correlazione in antifase rispetto alla diagonale. Nota due picchi di scambio in rosso

HUN

HT

HU

HT1HT2HO HN

HR

HPHQ

HSHFHK

HL

HOHG

NH3CO

1

2 3

45


HUN

HT

HU

HT1HT2HO HN

HR

HPHQ

HSHFHK

HL

HOHG

NH3CO

1

2 3

45


Picchi di correlazione in rosso

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