Mobilità di Proteine via NMR
description
Transcript of Mobilità di Proteine via NMR
Mobilità di Proteine Mobilità di Proteine via NMRvia NMR
Strutturata/Destrutturata
Moti Catene Laterali
NHH NDD
Velocità di Scambio
Moti Veloci
NOE eteronuclear NOE eteronuclear Rilassamento TRilassamento T1 1 e Te T22..
Simulazioni DMSimulazioni DM
Moti Molecolarir
c
Fenomeni Proteine e Scale Fenomeni Proteine e Scale di Tempodi Tempo
-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)
Cambiamenti Conformazionali
Esperimenti CPMG e Esperimenti CPMG e TT11
Scambio di H2O
Misure NMRDMisure NMRD
RilassamentoRilassamento
Il rilassamentorilassamento è il processo con cui, un sistema che è stato eccitatoeccitato
(oppure ha subito una perturbazione) va di nuovo ad equilibrioequilibrio...
Rilassamento Rilassamento 1515NN
Il rilassamentorilassamento è causato dai campicampi magnetici oscillantioscillanti percepiti dal
nucleo.
Le interazioni, dovute a mobilità, che possono creare campi magnetici oscillanti sul nucleo 15N sono:
Interazione Dipolare Dipolare 11H-H-1515NN. 1515N CSA N CSA ((Chemical Shift AnisotropyChemical Shift Anisotropy)). Altri:: Quadrupolare, scalare Quadrupolare, scalare......
In una proteina isotopicamente arricchita in 15N, ogni spin 15N è vicino sia a spin 1H che 15N.
Poiché l’interazione si esercita attraverso r-3, e poiché per ogni 15N lo spin di gran lunga piu’ vicino è il suo HN ammidico, l’interazione diopolare H, HN è preponderante rispetto a tutte le altre interazioni dipolari, che possono essere in prima approssimazione trascurate.
Quando una proteina in soluzione ruota, ciascun spin sente tutti gli altri come un campo fluttuante, che per effetto della rotazione della molecola si ri-orienta in continuazione rispetto allo spin studiato, creando quindi un campo magnetico oscillante
Campi Magnetici OscillantiCampi Magnetici Oscillanti
Interazione Dipolare Interazione Dipolare 11H-H-1515NNLa rotazionerotazione della molecola in della molecola in
soluzionesoluzione genera dei campi magnetici oscillanti intorno al
nucleo. Questi campi forniscono un
meccanismo di rilassamentomeccanismo di rilassamento al núcleo.
BB
00
NNSSHH
II
Anisotropia dello Anisotropia dello Spostamento Chimico Spostamento Chimico ((CSACSA))
Interazione Interazione 1515N-CSAN-CSA
xx y y
zz
BBoo
XX
BBeffeff == (1- (1-) ) BBoo == schermatura schermatura ee- -
Se la distribuzionedistribuzione della carica elettronica è anisotropaanisotropa, la schermaturaschermatura sarà anisotropaanisotropa. In soluzione si ottiene un valore valore promediopromedio dovuto alla barillatura molecolare veloce:
== ( (xx xx + + yyyy + + zzzz))//33
CSACSA:: La rotazione molecolare genera campi magnetici oscillanti che rapressentano un meccanismo di rilassamento per il nucleo osservato.
Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Proteinein Proteine
Se il rilassamento di ogni rilassamento di ogni 1515N amidicoN amidico è determinato essenzialmente dall’accoppiamentoaccoppiamento dipolare H-NH-N e dalla
anisotropia dello Spostamento Chimicoanisotropia dello Spostamento Chimico di 1515NN, ALLORA, le velocità di rilassamento di 15N dovrebbero essere ugualiuguali per tutti
gli n 15N amidici di una catena polipeptidica di n aminoacidi.
Distanza di legame
HH NN
CC
CC
OO
HH
1.021.02 ÅÅUguale per tutti
Struttura elettronica intorno a N
Uguale per tutti
Funzione di CorrelazioneFunzione di Correlazione
La Funzione di Correlazione, Funzione di Correlazione, C(t)C(t),, definisce il tempo che impiega un sistema per
reorientarsireorientarsi.Per una sfera rigida, C(t)C(t) si caratterizza per il
Tempo di CorrelazioneTempo di Correlazione.
Tempo di CorrelazioneTempo di Correlazione
Il Tempo di CorrelazioneTempo di Correlazione, cc, è la costante di tempo per il decadimento esponenziale della
Funzione di CorrelazioneFunzione di Correlazione.
C (t)C (t)
tempo (ns)tempo (ns)
cc corti fanno diminuire rapidamente C(t)C(t).
Funzione di Densità Funzione di Densità SpettraleSpettrale
FTFT
Frequenze (MHz)Frequenze (MHz)
J(J()/10)/10-9-9
La Funzione di Densità SpettraleFunzione di Densità Spettrale, JJ(()), rappresenta la distribuzione di frequenze generata per le
oscillazioni del sistema. Spiega il moto aleatoriomoto aleatorio.cc lunghi corrispondono ad alte densità spettrali in un intervallo stretto di frequenze.
Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N e Meccanismie Meccanismi
Le velocitàvelocità di rilassamento derivano dalla sommesomme di tutte le densità spettralidensità spettrali. Nel caso di 15N esse
dipendono da 3 frequenze tipiche del sistema (0, N, H).
J(0), J(N), J(H)
Intervengono su R1 ed R2 ma anche sul NOE eteronucleare tra 1H e 15N.
MisurandoMisurando RR11, RR22 ed NOENOE, io ho 3 equazioni dalla cui analisi posso ricavare il valore esatto
del cc
Equazione Stokes-EinsteinEquazione Stokes-Einstein
kT
rr 3
4 3
Il Tempo di Correlazione, Tempo di Correlazione, ,, corrisponde al Tempo Rotazionale Browniano, Tempo Rotazionale Browniano, rr,, de
molecule in soluzione seccondo l’equazione di Stokes-EinsteinStokes-Einstein.
• TT:: Temperatura.• rr:: Radio della Proteina.• :: Viscosità del Solvente.
cc non è lo stesso per Tutti non è lo stesso per Tutti
C-terminalN-terminal
Sito I
Sito II
cc==4.5 ns4.5 ns cc==10.4 10.4 nsns
Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N e Meccanismie Meccanismi
Le velocitàvelocità di rilassamento derivano dalla sommesomme di tutte le densità spettralidensità spettrali. Nel caso di 15N esse
dipendono da 3 frequenze tipiche del sistema (0, N, H).
J(0), J(N), J(H)
Intervengono su R1 ed R2 ma anche sul NOE eteronucleare tra 1H e 15N.
MisurandoMisurando RR11, RR22 ed NOENOE, io ho 3 equazioni dalla cui analisi posso ricavare il valore esatto
del cc
Interazione Dipolare Interazione Dipolare 11H-H-1515NNLa rotazionerotazione della molecola in della molecola in
soluzionesoluzione genera dei campi magnetici oscillanti intorno al
nucleo. Questi campi forniscono un
meccanismo di rilassamentomeccanismo di rilassamento al núcleo.
BB
00
NNSSHH
II
Interazione Interazione 1515N-CSAN-CSA
xx y y
zz
BBoo
XX
BBeffeff == (1- (1-) ) BBoo == schermatura schermatura ee- -
Se la distribuzionedistribuzione della carica elettronica è anisotropaanisotropa, la schermaturaschermatura sarà anisotropaanisotropa. In soluzione si ottiene un valore valore promediopromedio dovuto alla barillatura molecolare veloce:
== ( (xx xx + + yyyy + + zzzz))//33
CSACSA:: La rotazione molecolare genera campi magnetici oscillanti che rapressentano un meccanismo di rilassamento per il nucleo osservato.
Misura della Velocità di Misura della Velocità di Rilassamento Rilassamento 1515NN
100
110
120
130
12 11 10 9 8 7 6 5
15N (p
pm
)
1H (ppm)
Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Calbindin Din Calbindin D9K9K
0 10 20 30 40 50 60 700.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
R1
(s-1)
Residue Number
0 10 20 30 40 50 60 700
2
4
6
8
10
12
14
16
18
R2(
s-1)
Residue Number
0 10 20 30 40 50 60 700
1
2
3
4
5
6
R2/
R1
Residue Number
A
C
B
Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Rusticianinain Rusticianina
A
C
BR
1(s
)-1
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
0 20 40 60 80 100 120 140
R 2(s
)- 1
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100 120 140
Número de Residuo
115
H-
N N
OE
-0.4
0
0.4
0.8
1.2
1.6
0 20 40 60 80 100 120 140
Velocità di Rilassamento Velocità di Rilassamento 1515N N in Citocromo bin Citocromo b55 Ossidato Ossidato
R2
R1
NOE
Moti in Scala ns-ps del Moti in Scala ns-ps del Citocromo bCitocromo b55 (Fe (Fe3+3+))
Aumenta Aumenta MobilitàMobilità
Moti in Scala ns-ps del Moti in Scala ns-ps del Citocromo bCitocromo b55 (Fe (Fe2+2+))
Aumenta Aumenta MobilitàMobilità
Model FreeModel Free
• SS:: Parametro di Ordine • ’’ee:: Tempo di Correlazione Effetivo
• mm:: Tempo di Correlazione Rotazionale
• ee:: Tempo di Correlazione per Moti Interni
Se SSe S2 2 < 1 c’è mobilità locale< 1 c’è mobilità localeSe SSe S2 2 = 1 è rigido rispetto al sistema = 1 è rigido rispetto al sistema molecolaremolecolare
Lipari and Szabo, Lipari and Szabo, JACS JACS 19821982
log(log())
J(J())
t’t’ee
ttmmx S2
x (1-S2)
Oscillazioni in un ConoOscillazioni in un Cono
Rex
D||
D
e
1-S2
r
Il Parametro di Ordine SS22 viene dato da:
S2 = [cos(1+cos) / 2]2
Oscillazioni in un ConoOscillazioni in un Cono
Le Velocità di Rilassamento RR11 e RR22 si analizzano via el metodo Model FreeModel Free per
ottenere informazione sui moti internimoti interni che avvengono a scale di tempi inferiori a nsinferiori a ns e
pure sulla rotazione molecolarerotazione molecolare.
Parametro di Ordine in Parametro di Ordine in Calbindin DCalbindin D9K9K
10 20 30 40 50 60 700.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0S
2
Residue Number
Parametro di Ordine in Parametro di Ordine in RusticianinaRusticianina
S2
Numero di Residuo0 20 40 60 80 100 120 140
Moti Interni a Diverse Scale Moti Interni a Diverse Scale di Tempodi Tempo
t e(s)
R (s)ex -1
Número de Residuo
0
40
80
120
160
0 20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
Numero di Residuo
e (
s)
Rex (s
-1)
Strutturata/Destrutturata
Moti Catene Laterali
NHH NDD
Velocità di Scambio
Moti Veloci
NOE eteronuclear NOE eteronuclear Rilassamento TRilassamento T1 1 e Te T22..
Simulazioni DMSimulazioni DM
Moti Molecolarir
c
Fenomeni Proteine e Scale Fenomeni Proteine e Scale di Tempodi Tempo
-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)
Cambiamenti Conformazionali
Esperimenti CPMG e Esperimenti CPMG e TT11
Scambio di H2O
Misure NMRDMisure NMRD
Misura di RMisura di R22 CPMGCPMG
n
90°x180°y
180°y
M()=M0[e- /T2]
=2, 4, 6….
0
0,25
0,5
0,75
1
0 200 400 600 800 1000
T2=80ms
Se variando si ottiene un valore diverso per R2, significa che c’è un fenomeno di scambiofenomeno di scambio che agisce su una scala di tempo
dell’ordine di ordine di
è tipicamente tra 0,5 e 2ms.
Misura di RMisura di R22 CPMGCPMG
n
90°x180°y
180°y
M()=M0[e- /T2]
=2, 4, 6….
0
0,25
0,5
0,75
1
0 200 400 600 800 1000
T2=80ms
Se ci sono dei valori di R2 che nonnon sono interpretabili semplicemente ricorrendo alla analisi del model free, allora siamo in presenza di
uno scambio più lento rispetto alla scalapiù lento rispetto alla scala del r
RR22== R R22 ++ R Rexcexc
RR22 ((1/1/cpcp)) in Ca in Ca22CbCb
GdmHCl 0 MGdmHCl 0 M GdmHCl 2 MGdmHCl 2 M
• Mobilità ms-s.
• Andamento Simile.
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
0 10 20 30 40 50 60 70
R2 (
s-1)
R2 (
s-1)
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
18.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Residue Number
• Nessun Cambiamento nel Cuore.
Strutturata/Destrutturata
Moti Catene Laterali
NHH NDD
Velocità di Scambio
Moti Veloci
NOE eteronuclear NOE eteronuclear Rilassamento TRilassamento T1 1 e Te T22..
Simulazioni DMSimulazioni DM
Moti Molecolarir
c
Fenomeni Proteine e Scale Fenomeni Proteine e Scale di Tempodi Tempo
-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)
Cambiamenti Conformazionali
Esperimenti CPMG e Esperimenti CPMG e TT11
Scambio di H2O
Misure NMRDMisure NMRD
100
110
120
130
12 11 10 9 8 7 6 5
15N
(p
pm
)
0 M0 M100
110
120
130
12 11 10 9 8 7 6 5
2 M2 M100
110
120
130
12 11 10 9 8 7 6 5
1H (ppm)
3.5 M3.5 M
1H (ppm) 1H (ppm)
Destrutturazione di Apo-Destrutturazione di Apo-CbCb
Strutturata/Destrutturata
Moti Catene Laterali
NHH NDD
Velocità di Scambio
Moti Veloci
NOE eteronuclear NOE eteronuclear Rilassamento TRilassamento T1 1 e Te T22..
Simulazioni DMSimulazioni DM
Moti Molecolarir
c
Fenomeni Proteine e Scale Fenomeni Proteine e Scale di Tempodi Tempo
-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)
Cambiamenti Conformazionali
Esperimenti CPMG e Esperimenti CPMG e TT11
Scambio di H2O
Misure NMRDMisure NMRD
Scambio HN-Scambio HN-SolventeSolvente
Strutturata/Destrutturata
Moti Catene Laterali
NHH NDD
Velocità di Scambio
Moti Veloci
NOE eteronuclear NOE eteronuclear Rilassamento TRilassamento T1 1 e Te T22..
Simulazioni DMSimulazioni DM
Moti Molecolarir
c
Fenomeni Proteine e Scale Fenomeni Proteine e Scale di Tempodi Tempo
-15 -12 -9 -6 -3 0 3 log(time/s)
Cambiamenti Conformazionali
Esperimenti CPMG e Esperimenti CPMG e TT11
Scambio di H2O
Misure NMRDMisure NMRD
100
110
120
130
12 11 10 9 8 7 6 5
15N
( ppm
)
1H (ppm)
cleanexcleanex100
110
120
130
12 11 10 9 8 7 6 5
1H (ppm)
phogsyphogsy
HH22O StrutturaleO Strutturale