Cenni di Spettroscopia NMR bidimensionale di

correlazione

Testi consigliati: Stradi, Chiappe (esempi dal Silverstein)

A che dimensioni ci riferiamo??

Gli spettri protonici e del C-13 che abbiamo considerato sino ad ora sono grafici delle intensità rispetto alla frequenza: sono quindi grafici a due dimensioni, ma vengono definiti monodimensionali riferendosi alla presenza di una sola dimensione per la frequenza.

A che dimensioni ci riferiamo??

Analogamente i cosiddetti spettri bidimensionali sono in realtà dei grafici a tre dimensioni in cui l’intensità viene riportata in funzione di due frequenze.

Spettro monodimensionale Spettro bidimensionale

Come introduciamo la seconda frequenza??

Negli esperimenti bidimensionali si ripete n volte una certa sequenza di impulsi, ad es:

evoluzione

acquisizione

Impulsi di radiofrequenz

a

In ognuna delle n ripetizioni un parametro di tempo (di solito nell’ambito del periodo di evoluzione) viene incrementato regolarmente, generando così una risposta che varia nel tempo.

n

Come introduciamo la seconda frequenza??

Effetto del primo impulso “90Y”: rotazione della magnetizzazione netta di 90° attorno all’asse y

Andiamo a vedere che cosa succede alla magnetizzazione netta nel piano xy dopo questo impulso e come il suo destino

influenza lo spettro

Come introduciamo la seconda frequenza??

Analizziamo come varia il segnale di un singoletto (originato ad es. dai protoni dell’acetone) al variare del tempo di evoluzione t1.

Come introduciamo la seconda frequenza??

Analizziamo come varia il segnale di un singoletto (originato ad es. dai protoni dell’acetone) al variare del tempo di evoluzione t1.

Il secondo pulso agisce soltanto sulla componente di Mxy lungo l’asse y.

Come introduciamo la seconda frequenza??

Come introduciamo la seconda frequenza??

Mettiamo insieme tutti gli spettri così ottenuti, ordinandoli in funzione del tempo di evoluzione t1.

Adesso abbiamo i dati relativi alla frequenza f2 (che abbiamo ottenuto attraverso la trasformata di Fourier del FID acquisito in t2) in funzione del tempo di evoluzione t1.

Come introduciamo la seconda frequenza??

La variazione di intensità in funzione di t1 è periodica e possiamo costruire un pseudo FID analizzando ciascuna delle frequenze di f2 in funzione del tempo t1.

Come introduciamo la seconda frequenza??

Adesso abbiamo una serie di pseudo FID in t1 (uno per ciascuna frequenza di f2 di cui consideriamo la variazione in t1) e possiamo effettuare su ciascuno di essi una seconda trasformata di Fourier che ci consente di passare da un grafico dell’intensità in funzione di f2 e t1 a un grafico dell’intensità in funzione di due frequenze, f2 e f1, ottenendo lo spettro NMR 2D.

Come introduciamo la seconda frequenza??

In questo caso semplice (e con questo tipo di sequenza di esperimenti multi impulso) osserviamo un unico picco che cade alla stessa frequenza nei due assi, e che quindi si trova lungo la diagonale dello spettro. Nei casi in cui i picchi siano numerosi il tipo di rappresentazione dello spettro 2D mostrato in figura non è utile e si ricorre a dei diagrammi a livelli in cui si rappresentano tutti i picchi generati dall'esperimento visti dall'alto.

Come introduciamo la seconda frequenza??

Rappresentazione dello spettro bidimensionale visto dall’alto

Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza?

Nel semplice esempio considerato allo scopo di capire come si possa introdurre una seconda frequenza non abbiamo ottenuto informazioni in più rispetto ad un normale esperimento NMR.

In sistemi di spin più complicati, ed eventualmente con sequenze di impulsi più elaborate, durante il tempo di evoluzione t1 i nuclei interagiscono tra di loro in vari modi e tali interazioni si riflettono nello spettro ottenuto in t2.f2

f1

Se effettuiamo su un sistema AX un esperimento simile a quello precedentemente mostrato otteniamo uno spettro di questo tipo (spettro bidimensionale visto dall’alto).

Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza?

Lo spettro 2D si presenta come un diagramma simmetrico in cui entrambi gli assi riportano il chemical shift dei protoni; f2 cresce come di consueto da destra a sinistra, mentre f1 cresce dall’alto in basso (n.b.: il verso può anche essere opposto)

f2

f1

Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza?

I normali spettri protonici monodimensionali vengono solitamente riportati sugli assi f1 e f2 per facilitare la lettura del bidimensionale.

X

f2

f1

A

A

X

Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza?

Dall’angolo in alto a destra a quello in basso a sinistra si sviluppa la “diagonale” che contiene i picchi (in blu) per i quali 1 = 2. Questi picchi non forniscono alcuna informazione addizionale rispetto a quella dello spettro monodimensionale.Fuori diagonale in corrispondenza dei segnali tra i quali si ha accoppiamento si osservano dei picchi (chiamati cross peaks): in uno spettro complesso da questi picchi fuori diagonale possiamo identificare gli shifts di segnali accoppiati!

Lo spettro 2D si presenta come un diagramma simmetrico in cui entrambi gli assi riportano il chemical shift dei protoni; f2 cresce come di consueto da destra a sinistra, mentre f1 cresce dall’alto in basso

X

f2

f1

A

A

X

Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza?

Con opportune modifiche della sequenza di impulsi che abbiamo visto è possibile ottenere degli spettri 2D che permettono di correlare i segnali di spin accoppiati, sia attraverso legami che attraverso lo spazio, sia nel caso omo che eteronucleare.

Correlazioni di shift omonucleari

La sequenza di impulsi per un esperimento 1H-1H COSY (acronimo di COrrelation SpectroscopY) è del tipo considerato nell’esempio introduttivo.

1H-1H COSY

evoluzione

acquisizione

Impulsi di radiofrequenz

a/2 /2

Il tipo di spettro che si ottiene è quello visto nei lucidi precedenti per il sistema AX.

La sequenza di impulsi per un esperimento 1H-1H COSY (acronimo di COrrelation SpectroscopY) è del tipo considerato nell’esempio introduttivo.

1H-1H COSY

evoluzione

acquisizione

Impulsi di radiofrequenz

a/2 /2

L’esperimento 1H-1H COSY permette di stabilire la connettività H-H della molecola senza dover necessariamente effettuare una approfondita analisi delle costanti di accoppiamento e degli spostamenti chimici.

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

I picchi contenuti sulla diagonale corrispondono allo spettro monodimensionale.

f2

f1

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

f2

f1

I picchi contenuti sulla diagonale corrispondono allo spettro monodimensionale.

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. Questi cross-peak indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro.

f2

f1

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. Questi cross-peak indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro.

f2

f1

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Si inizia la lettura scegliendo un picco di cui si conosce l’attribuzione da cui partire per stabilire le correlazioni.

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

In questo caso sappiamo che il metile più schermato è il metile in 7 (il metile 1 è vicino al gruppo carbonilico)

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Rintracciamo il picco relativo sulla diagonale

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Tracciamo una retta ortogonale all’asse sino a incontrare un cross peak

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Dal cross peak tracciamo una linea ortogonale alla prima per andare a incrociare sulla diagonale il picco correlato

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Dal cross peak tracciamo una linea ortogonale alla prima per andare a incrociare sulla diagonale il picco correlato

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Dal picco sulla diagonale torniamo sull’asse delle frequenze ed identifichiamo il picco correlato al 7 che corrisponde ai protoni in 6

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Dal picco sulla diagonale attribuita agli idrogeni in posizione 6 tracciamo una segmento ortogonale all'asse delle frequenze sino ad incontrare i cross peak

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Un cross peak è relativo all’accoppiamento con 7, l’altro deve essere relativo all’accoppiamento con 5

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 tracciamo un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 tracciamo un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 tracciamo un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Dal picco dei protoni 5 identifichiamo seguendo la stessa procedura quello dei protoni in 4. Analogamente possiamo operare con l’altro semplice sistema di spin.

1H-1H COSY: come leggere lo spettro

Dal picco dei protoni 5 identifichiamo seguendo la stessa procedura quello dei protoni in 4. Analogamente possiamo operare con l’altro semplice sistema di spin.

Ipsenolo

DQFCOSY: modifica della sequenza COSYin cui vengono rimosse alcune

transizioni

Correlazioni di shift eteronucleari

Correlazione di shift eteronucleari: HETCOR

L’esperimento HETCOR permette di correlare lo spostamento chimico dei nuclei 13C con quello dei protoni ad essi direttamente legati.

Negli spettri HETCOR l’asse F1, che deriva dall’incremento del tempo t1, è l’asse del protone; l’asse F2, ottenuto dalla registrazione del segnale nell’intervallo t2, è l’asse del carbonio. In questo tipo di spettri non vi è simmetria.

HETCOR

Tramite questo spettro possiamo attribuire i segnali del carbonio conoscendo lo spettro protone e viceversa. I cross-peaks mettono in correlazione ciascun protone, o gruppo di protoni, con i carboni cui sono direttamente legati.

A differenza degli esperimenti HETCOR che prevedono la rivelazione sul canale del 13C, negli esperimenti HMQC la rivelazione è effettuata sul canale del più sensibile spin protonico.

Lo spettro HMQC è molto simile a quello HETCOR e differisce da esso solo per il fatto che gi assi sono invertiti: l’asse F1 è l’asse del 13C e l’asse F2, ottenuto dalla registrazione del segnale nell’intervallo t2, è l’asse del 1H.

Correlazione di shift eteronucleari: HMQC