La gestione delle emocolture nella

diagnosi microbiologica della sepsi

Luigi Principe Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Socio Sanitaria Territoriale di Lecco

Corso di Diagnosi, Terapia e Critical Appraisal in Nefrologia e Discipline correlate

Lecco, 7 Novembre 2017

Esame colturale che si prefigge di rilevare la presenza di

microrganismi (batteri, funghi) nel sangue fornendo loro le

migliori condizioni di replicazione.

Per emocoltura si intende la coltura di un campione di

sangue ottenuto da una singola venipuntura,

indipendentemente dal numero di flaconi in cui il campione

viene inoculato. Un set di emocoltura comprende un flacone

aerobio ed un flacone anaerobio.

Diagnostica microbiologica: l’emocoltura

Nota bene

Alcuni microrganismi non crescono nei comuni terreni di coltura

(virus, protozoi, legionelle, micoplasmi, clamidie)

L’emocoltura: procedura di prelievo

Prelievo da catetere vascolare

per verificare il sospetto clinico

di batteriemia

correlata al catetere (CRBSI)

Prelievo

• da vena periferica:

prelievo raccomandato

• da arteria:

minore frequenza di positività

• da catetere vascolare:

maggiore frequenza

di contaminazione cutanea

Eseguire allo stesso tempo due emocolture (una da CVC e una da vena periferica) prelevando per ogni sito 8-10 ml di sangue da inserire nel flacone BacT/ALERT FA Aerobio (le infezioni da catetere sono sostenute da aerobi) Le due emocolture devono essere prontamente (e contemporaneamente) consegnate in laboratorio, in modo che possano essere inserite allo stesso tempo nel sistema automatico di monitoraggio continuo

Il test è positivo se l’emocoltura da catetere vascolare si positivizza almeno 2 ore prima rispetto a quella da vena periferica: stesso microrganismo, stesso antibiotipo (batteriemia associata a infezione del catetere vascolare, CR-BSI)

La sequenza del prelievo

Prelievo da catetere vascolare (CR-BSI)

L’emocoltura: procedura di prelievo

Metodiche di disinfezione:

prima di procedere all’antisepsi della cute

accertarsi che non ci sia sporco visibile

(in tal caso procedere al lavaggio

della parte con acqua e sapone).

È preferibile l’utilizzo di clorexidina 2%

in soluzione alcolica (Neoxidina).

Prima di eseguire il prelievo,

attendere un tempo adeguato;

(nel caso della clorexidina: 30”-1’).

L’esecuzione di 2-3 venipunture per ciascun episodio settico (entro 1 ora) prima della terapia antibiotica permette:

Diagnosi in > 95% degli episodi settici

Supporto a interpretazione di contaminanti

Il volume di sangue è la variabile più importante

(ogni flacone deve contenere al massimo 10 ml di sangue)

Adulti: Carica batterica <10 CFU/mL di sangue Volume da 20 a 40 mL + 19% di positività (2° set) Volume da 40 a 60 mL + 10% di positività (3° set)

Bambini: In genere > 100 CFU/mL (spesso > 1000 CFU/mL) Prelievi di 0.5 – 1 mL sono considerati sufficienti

L’emocoltura: procedura di prelievo

Gli anaerobi rappresentano meno del 2% del totale delle BSI

La coppia flacone aerobio + flacone anaerobio individua un numero maggiore di batteri (p = 0.002), cocchi Gram-positivi (p = 0.03), Staphylococcus aureus (p = 0.05), Enterobacteriaceae (p = 0.02) ed anaerobi (p = 0.01)

Uso dei flaconi per anaerobi

Batteriemia: definizioni

Batteriemia significativa:

isolamento di un microrganismo patogeno anche da una sola emocoltura.

Stafilococchi coagulasi-negativi e Streptococchi viridanti sono

da considerare patogeni solo se ottenuti da più emocolture o

in caso di situazioni clinicamente evidenti

Pseudobatteriemia:

isolamento da una sola emocoltura di possibili contaminanti

quali: Stafilococchi coagulasi-negativi, Corynebacterium spp.

(eccetto C. jeikeium), Lactobacillus spp., Bacillus spp.

(eccetto B. anthracis), Propionibacterium spp.

Grace et al., Clin Infect Dis, 2001; 32:1651

Identificati il 46.4% dei casi

Emocolture in corso di terapia?

La presenza di batteri nel sangue è maggiore in prossimità

del picco febbrile

Nessuna differenza tra prelievi simultanei e intervallati

(il periodo di intervallo fra i prelievi non incide sulla

positività)

In conclusione

Prelevare al picco febbrile, prima della terapia

antibiotica, non meno di due emocolture (flacone

aerobio+anaerobio) da siti venosi differenti (se

necessario, prelevare le emocolture simultaneamente da

braccio dx e braccio sin)

Li et al, J Clin Microbiol, 1994; 32:2829

L’emocoltura: i tempi di prelievo

Paziente “settico”

Esecuzione dei prelievi

Invio al laboratorio

Incubazione delle bottiglie

Emocoltura positiva

Semina su terreno

Crescita su piastra

Identificazione ed antibiogramma

Risultato finale

Colorazione di Gram

Mediamente 96 h

Mediamente 48 h prima del risultato diagnostico

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 8 16 24 32 40 48 56 64 72Incubation time (hrs)

% P

os

itiv

e s

am

ple

s

BACTEC 9240

BacT/Alert

EMOCOLTURE: DIAGRAMMA DI FLUSSO

Terreno di coltura liquido

Sensore

LED Fotodiodo

Luce riflessa

Sistemi a monitoraggio continuo

Una emocoltura può essere definita “negativa”

dopo 5 giorni di incubazione a 35°C in un sistema

automatico a monitoraggio continuo

Il 95% dei microrganismi cresce entro 3-4 giorni di incubazione, anche per germi tradizionalmente ritenuti difficili: Brucella, HACEK, Capnocytophaga, Campylobacter.

Non è necessario (diversamente a quanto in uso in anni precedenti) prolungare l’incubazione nel sospetto di endocardite o di brucellosi.

Sistemi a monitoraggio continuo

Esame microscopico (colorazione di Gram)

Semina in terreni solidi di arricchimento, selettivi e differenziali

CONS E. coli C. albicans

P. mirabilis S. aureus H. influenzae

Abg diretto: Staphylococcus aureus Isolato resistente alla meticillina (MRSA)

Abg diretto: Escherichia coli Isolato produttore di ESBL (CTX-M-15)

Abg diretto: Klebsiella pneumoniae Isolato produttore di carbapenemasi (KPC)

Flacone positivo

Semina su terreno

Identificazione ed antibiogramma

Risultato finale a 24 ore

Colorazione di Gram

Identificazione a 3-4 ore

(resistenze intrinseche!!)

Prelievo e incubazione dei flaconi

Giorno 1 (Terapia empirica)

Giorno 2 (T. e. ragionata)

Positivizzazione dei flaconi

ID biochimica e ABG

Giorno 3 (T. mirata)

24 h 48 h

Crescita delle colonie

Giorno 4 (T. ottimale)

72 h

Metodi tradizionali ID e ABG definitivi

Introduzione della spettrometria di massa

Prelievo e incubazione dei flaconi

Positivizzazione dei flaconi

ID MALDI-TOF da flacone positivo

Giorno 1 (Terapia empirica)

Giorno 2 (T. mirata)

Giorno 3 (T. ottimale)

24 h 48 h

ABG

Gram ABG diretto in Kirby-Bauer

ID e resistenze intrinseche

ABG definitivo

Identification by mass spectrometry and automated susceptibility testing from positive bottles: a simple,

rapid, and standardized approach to reduce the turnaround time in the management of blood cultures

BMC Infect. Dis, 2017 – In press

C. Mauri, L. Principe, S. Bracco, E. Meroni, N. Corbo, B. Pini, F. Luzzaro

Non richiede estrazione preliminare

Risultato in circa 1 ora

Rispetto ai sistemi “home made” (non certificati e spesso molto laboriosi), i metodi molecolari commercialmente disponibili presentano numerosi vantaggi quali una elevata automazione associata a semplicità d’uso, rapidi tempi di risposta, alta sensibilità e specificità.

Un limite di tutti i metodi molecolari è rappresentato dal fatto che essi identificano ciò che conoscono ed eventuali varianti possono sfuggire alla identificazione determinando pericolosi falsi negativi.

I costi, inoltre, sono in genere elevati e rendono difficile l’introduzione di queste tecniche molecolari nella pratica di routine.

Vantaggi e limiti dei metodi molecolari

Luigi Principe Laboratorio di Microbiologia e Virologia Azienda Socio Sanitaria Territoriale di Lecco

Grazie per l’attenzione