P.Pecile

Dip. Medicina Sperimentale e Clinica

Università di Firenze

I nuovi test microbiologici rapidi

cambieranno definitivamente

l’approccio alla terapia antibiotica e

non solo?

La diagnostica “ molecolare “ in microbiologia clinica

o Indipendente dalla necessità di

isolare il patogeno in coltura /

visualizzarlo al microscopio

o Possibile automazione

- Sensibilità (patogeni non/

difficilmente coltivabili/

visualizzabili, patogeni non vitali)

- Rapidità

polisaccaridi,proteine, acidi nucleici

microbiologia fast

o Maggiore rapidità

o Maggiore sensibilità

o Maggiore accuratezza

Informazioni diverse/complementari vs. diagnostica tradizionale

FENOTIPICI

o Spettrometria di massa con tecnologia MALDI-

TOF per l’identificazione di batteri e miceti 1-5 h

o AB rapido fenotipico mediante tecnologia

light-scattering (misurazione nefelometrica crescita

batterica) 7h

o Immunolelettroforesi laterale 15’

o QuantaMatrix AB rapido fenotipico

mediante time lapse 4-6h

MOLECOLARI

o Biologia molecolare per ID e AB molecolare

1-2 ore

o Next-Generation Sequencing ( NGS)

Pannelli sindromici

MISTI

Single cell automated time-lapse microscopy (SC-

ATLM) Ibridazione in situ + analisi morfocinetica cellulare

ID 2 h AB 6 h

Direttamente da sangue

T2 Magnetic Resonance (T2MR)

risonanza magnetica miniaturizzata

ID 4/5 h

Meccanismi di resistenza

ID 4/5 h

Meccanismi di resistenza

Identificazione (ID)Antibiogramma (AB)

Gram ID BIOCHIM

1-2 h

Tempi di risposta (TTR) teorici dalla

positivizzazione

IncubazioneCheck-in

AB

Positivizzazione

AB

preliminare

ID BIOCHIM

preliminare

16 -24 h >= 40 h

Aggiustamento

ter. empirica

Aggiustamento

ter. empirica

Ter.

definitiva

Emocoltura: lo standard-of-care per la diagnostica microbiologica della sepsi

2 – 110 h

mediana 21 h

Empirica

- 1 giorno

Gram

48h

IncubazioneCheck-in IdentificazioneAntibiogramma

Gram

Incubazione

2h

ID MALDI

Check-in

T e r a p i a a n t i b i o t i c a

Riduzione TTR :spettrometria di massa MALDI-ToF

Definitiva

Empirica

Revisione

più precisa

subcoltura rapida 24h24h

4h

ID +

ATB

- 1 giorno

Gram

48h

IncubazioneCheck-in IdentificazioneAntibiogramma

Gram

Incubazione

LFIA

Check-in

T e r a p i a a n t i b i o t i c a

Riduzione TTR : LFIA ( immunocromatografia laterale)

Definitiva

Empirica

Revisione

più precisa

subcoltura rapida

LFIA+ ID MALDI

24h24h

- produzione enzima

- tipo di carbapenemasi

ID +

ATB

- 1 giorno

Gram

48 h

IncubazioneCheck-in IdentificazioneAntibiogramma

Gram

Incubazione

NAAT

Check-in

T e r a p i a a n t i b i o t i c a

Riduzione TTR : NAAT

Definitiva

Empirica

Revisione

più precisa

subcoltura rapida 24h24h

Escherichia coli,

Enterobacter spp.

Klebsiella oxytoca,

Klebsiella pneumoniae

Serratia marcescens

Proteus spp.

Citrobacter spp.

Acinetobacter spp.

Pseudomonas aeruginosa

CTX-M (ESBL)

KPC

OXA

VIM

NDM

IMP

ID +

ATB

Empiric Definitive

Gram

Incubation2 h

ID

AB

7 h

Single-cell

automated

time-lapse

microscopy

- 2 days

Gram

48 h

ID +

ATBIncubation IdentificationAntibiogram

Riduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse Microscopy

Definitive

Gram

48 h

Incubation IdentificationAntibiogram

Riduzione TTR : T2

• C. albicans e C. tropicalis (A / T)

• C. krusei e C. glabrata (K / G)

• C. parapsilosis (P)

E. coli

K. pneumoniae

P. aeruginosa

A. baumannii

S. aureus

E. faecium

4 -5 h

Revisione

più precisa

Incubation+subcoltura

rapida

ID +

ATB

ID +

ATB

24h24h

1515 33

99

MERS-CoVMERS-CoV

cc

OXA (carbapenem resistance)OXA (carbapenem resistance)

Filmarray pneumonia panel

Nuovo pannello sindromico

KPC OXA-48Ceftazidime

Avibactam

Imipenem

Relebactam

Aztreonam

AvibactamNDM

Meropenem

VaborbactamKPC

VIMOXA-48

Cefiderocol

KPC

KPC

KPC OXA-48 VIM NDM

NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship

Emocoltura positiva dopo 12 ore

Sepsi in paziente post-cardiochirurgico

Empirica: MEROPENEM + VANCOMICINA

Revisione anticipabile di 1-2 giorni

Cocchi Gram-positivi

++

-----------

------

-----

---

emocultura: positiva dopo 11 hrs

Gram-negativi bacilli

Sepsi in pz con chirurgia addominale

Empirico: Pip/Tazo + Vancomicina Escherichia coli,

Enterobacter spp.

Klebsiella oxytoca,

Klebsiella pneumoniae

Serratia marcescens

Proteus spp.

Citrobacter spp.

Acinetobacter spp.

Pseudomonas aeruginosa

CTX-M (ESBL)

KPC

OXA

VIM

NDM

---+-----

-+---

NAAT + microarray

Verigene® GN

1.5 hrs

AST molecolare

ID molecolare

Upgrade terapia anti-CRE con anticipo 24/48 ore

NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship

Dopo 22 h: emocoltura positiva per bacilli Gram-

Considera downgrade a Pip/Tazo (anticipato di 24-48 h)

Empirico: Imipenem/Cilastatin

ID molecolare = E. coli;

AB molecolare: negativo per CTX-M (la più

comune ESBL) e carbapenemasi (KPC, OXA-48,

VIM, NDM)

1.5 hrs

Paziente settico proveniente da casa di riposo (storia

pregressa di UTI)

NAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardshipNAAT per emocolture positive: impatto su antimicrobial stewardship

Molecular ID and antibiogram: impact on antimicrobial stewardshipMolecular ID and antibiogram: impact on antimicrobial stewardship

Blood culture positivity, 5 hrs

A case of febrile neutropenia (SCT recipient)

Empiric: MEROPENEM + LINEZOLID

Molecular ID (1 h 30’):

K. pneumoniae

Molecular ATB (1 h 30’):

Resistance genes

CTX-M negative

KPC positive

VIM negative

OXA-48 negative

NDM negative

Revision anticipated by 2 days

Revision? upgrade to anti-CRE regimen

Film Array BCID system – studi cliniciFilm Array BCID system – studi clinici

Study designNo.

patientsCountry/ setting Patients Outcomes

Effect on time

to appropiate

therapy

Overall

study

quality

Reference

Single center,

Pre/post68

USA, medical

center

Adults with

VRE BSI

No differences in:

- 30-day mortality

- readmission rate

- ICU LOS

Yes Good

MacVane et

al. Infectious

diseases 2016

Single center,

Pre/post100

UK, Tertiary

Children's

Hospital

Children with

BSI

Several cases

conducted to early

discharge

Yes LowRay et al. –

PIDJ 2016

Prospective

randomized

controlled

617USA, Tertiary care

hospital

Adults and

children with

BSI

No differences in:

- 30-day mortality

- LOS

- Total cost per

patient

Yes HighBanerjee et

al. CID 2015

- No differenze in mortalità e durata degenza

- terapia appropriata in tempi ridotti

Impact of the FILMARRAY pneumonia panel on antimicrobial stewardship inpneumonia patients

results of the FA-PP would have led to an early switch of antibiotics in 50/63 episodes (79%):

de-escalation in 35/63 (55%) and escalation in 15/63 (24%).

FA-PP results combined with advice from an antimicrobial stewardship expert, would have

saved 133 days of broad-spectrum antibiotics.

Conclusions: FA-PP has the potential to optimize antimicrobial treatment and reduce

inappropriate use of broadspectrum antibiotics in pneumonia patients. These promising

results must be confirmed by randomized studies.

Diagnostica microbiologica fast: limiti

Arena et al – Fut Microbiol 2017

o NAAT : ricerca solo alcuni patogeni / meccanismi di R

o NAAT : possibile sovrastima resistenze (geni non espressi)

o Possibili falsi negative per mutazioni del target

o Informa prevalentemente su resistenze

o No informazioni sulla MIC

o Informazioni di tipo diverso / non sostitutivo

o Costi : una diagnostica non applicabile a tutti I pazienti

Gram

Incubation2 h

ID

AB

7 h

Single-cell

automated

time-lapse

microscopy

No eccezionale corrispondenza MIC alcune associazioni micorganismo/antibiotico

P. aeruginosa (categorical agreement 71.9%; with cefepime 33.3%, piperacillin-tazobactam 77.8%, ceftazidime 0%)

Gram

+ 2 giorni

ID BIOCHEM

Incubation IdentificationAntibiogram

ID MALDI

AntibioticMIC mg/L

(S/I/R)

Cefazolin ≥32 R

Cefriaxone ≥8 R

Ceftazidime ≥32 R

Cefepime ≥32 R

Pip/Tazo 128 R

Ertapenem 2 R

Meropenem ≥8 R

Amikacin ≥64 R

Gentamicin ≤1 S

Ciprofloxacin ≥4 R

Colistin ≤0.5 S

K. pneumoniae isolate

Riduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse MicroscopyRiduzione TTR : Single Cell Automated Time-lapse Microscopy

Polimicrobici???Descours et Al Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2018

AntibioticMIC mg/L

(S/I/R)

Amoxi/Clav >16 R

Pip/Tazo >128 R

Ceftriaxone >4 R

Ceftazidime >128 R

Cefepime >32 R

Ertapenem >1 R

Imipenem >16 R

Meropenem >64 R

Fosfomycin >128 R

Amikacin >16 R

Gentamicin 1 S

Ciprofloxacin >4 R

Tigecycline 1 S

Colistin >8 R

CAZ-AVI 4 S

antibiogramma fenotipico

Antibiogramma molecolare

Genii resistenza:

CTX-M negativo

KPC positivo

VIM negativo

OXA-48 negativo

NDM negativo

- Presunta resistanza ai beta-

lattamici, inclusi

carbapenemi

- Probabile sensibilità a CAZ-

AVI

- Nessuna informazione sulla

sensibilità a altre molecole

- No MIC

Antibiotic

Amoxi/Clav R

Pip/Tazo R

Ceftriaxone R

Ceftazidime R

Cefepime R

Ertapenem R

Imipenem R

Meropenem R

Fosfomycin ?

Amikacin ?

Gentamicin ?

Ciprofloxacin ?

Tigecycline ?

Colistin ?

CAZ-AVI S

Antibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipicoAntibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipico

Klebsiella pneumoniae

AntibioticMIC mg/L

(S/I/R)

Amoxi/Clav 8 S

Pip/Tazo 4 S

Ceftriaxone 0.12 S

Ceftazidime 0.25 S

Cefepime <0.12 S

Ertapenem 0.12 S

Imipenem <0.50 S

Meropenem <0.12 S

Fosfomycin 8 S

Amikacin 4 S

Gentamicin 1 S

Ciprofloxacin >4 R

Tigecycline 0.5 S

Colistin 0.5 S

- Probabile sensibilità ai

carbapenemi; possibile

sensibilità cefalosporine

e BLICs

- Nessuna informazione sulla

sensibilità a altre molecole

- No MIC

Antibiotic

Amoxi/Clav S?

Pip/Tazo S?

Ceftriaxone S?

Ceftazidime S?

Cefepime S?

Ertapenem S

Imipenem S

Meropenem S

Fosfomycin ?

Amikacin ?

Gentamicin ?

Ciprofloxacin ?

Tigecycline ?

Colistin ?

antibiogramma fenotipico

E. coli

Geni resistenza

CTX-M negative

KPC negative

VIM negative

OXA-48 negative

NDM negative

Antibiogramma molecolare

Antibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipicoAntibiogramma molecolare e antibiogramma fenotipico

Assenza dei più comuni geni codificanti per carbapenemasi: l’informazione non

consente di predire il profilo di resistenza ai ß-lattamici. Probabile sensibilità a

ceftalozano/tazobactam

A recent survey of infectious disease physicians demonstrated that 67.5% think that new diagnostic testing is becoming too complex for non-infectious disease physicians.The reporting of increasingly specific,species-level identification of

pathogens not widely familiar to general clinicians can create confusion.

Clinicians may also require decision support to navigate some of the pitfalls in the

interpretation of rapid molecular infectious disease diagnostics.

Diagnostic stewardship is needed to implement appropriate tests for the clinical setting and

to direct testing toward appropriate patients. Antimicrobial stewardship is needed to ensure

prompt appropriate clinical action to translate faster diagnostic test results

in the laboratory into improved outcomes at the bedside.

6. Early microbiological diagnosis and AST

1)..

2) Make every effort to reduce identification and

AST turnaround times (adopt matrix-assisted

laser desorption time of flight and molecular

diagnostic systems for microbial identification and

detection of key resistance mechanisms).

3) Design personalized diagnostic workflows and

rationalize the use of new technologies, adopting

patient stratification criteria (severity of illness

and/or risk of rapid clinical progression).

4) Actively support ASP components and other

clinicians in interpretation of the clinical

microbiology laboratory results.

5) Implement the use of rapid diagnostics in

primary care settings, in order to guide antibiotic

prescription by general practitioners.

Bioscore: uno strumento per scegliere il percorso diagnostico-terapeutico“Chi va in diagnostica rapida? O meglio qual è il giusto paziente che può beneficiare al meglio della diagnostica rapida?”

L’utilizzo combinato e integrato di score clinici validati può aiutare il clinico in tale arduo compito. Di fatto il

bioscore è un approccio pratico per indirizzare a un percorso microbiologico rapido con l’obiettivo di

conseguire un’indicazione esplicita e condivisa all’inserimento della diagnostica microbiologica rapida nella

pratica clinica

Diagnostic stewardship: prioritizing patients for access to fast-track Micro Labs

Verso la differenziazione dei processi diagnostici per “intensità di cura”

Evoluzione tecnologia

• Evoluzione competenze microbiologo

• Evoluzione competenze clinici

• Formazione continua e continua riqualificazione delle risorse umane con rafforzamento delle competenze specifiche delle varie professionalità

conclusioni

o Nuove tecnologie diagnostiche consentono di accorciare

significativamente i tempi di risposta e la sua accuratezza

ma è necessaria la consapevolezza dei vantaggi e

limiti

o Evidenze per impatto clinico: presenti ma ancora

limitate (complessità degli studi di validazione)

o Impatto economico ed organizzativo: necessità di

posizionarle correttamente nel percorso diagnostico

(stewardship diagnostica) e necessità di seri programmi

di stewardship antimicrobica

o Verso la differenziazione dei processi diagnostici per

“intensità di cura”