Aspetti microbiologici:

dalla raccolta dei campioni all’interpretazione critica dei risultati

24 Novembre 2010 dott.ssa Claudia Venturelli

obiettivi1. RICERCA ED ERADICAZIONE

DELL’AGENTE INFETTIVO 2. IDENTIFICAZIONE DELLA PROBABILE

FONTE D’ INFEZIONE:• Respiratoria • Addominale• Cutanea • Vie urinarie• SNC • Protesi e cateteri

La DiagnosiColture appropriate devono essere sempre ottenute prima di iniziare la terapia antibiotica.Per ottimizzare l'identificazione degli organismi che causano l'infezione, devono essere prelevate almeno due emocolture di cui una per via percutanea ed una prelevata attraverso ciascun catetere vascolare, a meno che il catetere non sia stato introdotto di recente (< 48 ore). E’ raccomandato il prelievo prima della terapia antibiotica e secondo quanto richiesto dalla clinica, di colture da altri siti come urina, fluido cerebrospinale, ferite, secrezioni delle vie respiratorie o altri fluidi corporei.

La terapia antibiotica

La terapia antibiotica deve essere iniziata possibilmente entro la prima ora dal riconoscimento della sepsi grave, dopo il prelievo delle colture appropriate.

La terapia antibiotica

Il regime antimicrobico iniziale deve sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore sulla base dei dati microbiologici e clinici, con lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più stretto per limitare lo sviluppo di resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i costi. (DE-ESCALATION)

Il controllo del focus infettivo

In ogni paziente con sepsi grave si deve valutare se è presente un focus infettivo sensibile alle misure di controllo, nello specifico il drenaggio di un ascesso o di un focus locale di infezione, l'asportazione di tessuto necrotico infetto, la rimozione di un presidio potenzialmente infetto o del controllo definitivo di un focus che si sta infettando per contaminazione microbica .

Bundle (fascio/pacchetto):a. insieme di interventi applicati ad un processo morboso che, se usati contemporaneamente, danno un outcome migliore rispetto alla applicazione individuale.

Sepsis resuscitation bundle

0-6 ore Sepsis management bundle

entro 24 ore

Non appena il paziente avverte il brivido e /o segni e sintomi di febbre

La rapidità di esecuzione in rapporto all’evento cruciale , perché …

1. La batteriemia è nella maggior parte dei casi un evento acuto e fuggevole

2. La clearance microbica è molto rapida

3. Il picco febbrile segue la poussee batteriemica di 30-60 min.

Quanti prelievi effettuare ?

Effettuare almeno 2 prelievi :1 da vena periferica1 da CVCParalleli = Allo stesso tempo Non scartare la prima quantità di sangue

prelevato perché è quella con la più alta concentrazione di microbi

Contraddistinguere ciascun prelievo con l’etichetta corrispondente alla modalità di prelievo.

Indicare su ciascun prelievo l’ora

CVC CVC VenaPeriferica

VenaPeriferica

Modalità di prenotazione in

Hospital Web

delle emocolture parallele e seriate

Cosa fare nel caso di cateteri a due vie ?

Nel caso di cateteri a piu’ lumi (ramo bianco e rosso) eseguire 3 prelievi:

1 da vena periferica 1 dal lume rosso 1 dal lume bianco

Tutti allo stesso tempo

Ricordarsi di applicare le corrispondenti

etichette correttamente ed indicare il tipo di lume sul flacone

Come conservare e inviare i flaconi alla Microbiologia ?

I flaconi, tenuti a temperatura ambiente, dovrebbero pervenire alla Microbiologia il prima possibile ed essere posti immediatamente negli appositi incubatori

L’emocoltura deve essere ripetuta nei giorni successivi ?

No. Non ci sono indicazioni per il prelievo nei giorni successivi per il follow up, perché quest’ultimo si basa sui dati clinici.

Ci sono due eccezioni:- l’endocardite (la persistenza dell’infezione può

richiedere una modifica della terapia)- le sepsi da S. aureus in cui il prelievo dopo 2 e 4 giorni

può fornire utili indicazioni di complicanze infettive insorte per via ematogena (es. endocardite o osteomielite) o per estensione dell’infezione in altre sedi (tromboflebite settica, ascessi).

Non eseguire colture di routine dei cateteri rimossi da pazienti in unita intensiva.

Analizzare microbiologicamente solo quei cateteri sospettati di essere la fonte dell’infezione o la causa della sepsi

Infatti fino al 20% dei cateteri venosi centrali sono colonizzati

alla rimozione; la maggior parte non sono associati con infezioni locali o batteriemie/fungemie.

Questo sottoporrebbe a lavoro inutile e al rischio di terapie antibiotiche inappropriate

LIQUIDI BIOLOGICI (peritoneale, ascitico, biliare)Eseguire il prelievo prima della terapia antibiotica

CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA ASPIRAZIONE PERCUTANEA1. Pulire il sito della puntura con alcool e antisepsi del sito di aspirazione.2. Aspirare in asepsi il campione di liquido necessario con siringa e ago sterili. 3. Introdurre immediatamente una parte di liquido nei flaconi per aerobi ed anaerobi.4.Un prelievo Adeguato è costituito da almeno 0,5 cc di fluido o tessuto trasportato al

laboratorio per la ricerca degli anaerobi

CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA TUBI DI DRENAGGIOLa raccolta di liquidi da drenaggio deve essere scoraggiata in favore di una diretta aspirazione

dall’area drenante1. Disinfettare il tubo con una soluzione disinfettante, lasciare asciugare ed aspirare il liquido.2. Introdurre il campione nei contenitori sterili come da protocollo di laboratorio.3. La coltura di fluidi da drenaggi posizionati da piu’ di 2 giorni potrebbe non essere

attendibile.

TRASPORTO DEL CAMPIONE1. Inviare in laboratorio quanto prima possibile. 2. Non refrigerare.

Sepsi addominali: quando e quali colture?

Si raccomanda l’esecuzione di un solo prelievo in quantità sufficiente da inviare in microbiologia per la ricerca degli anaerobi ed aerobi in apposito terreno di trasporto

Il tampone non costituisce un idoneo campione per la ricerca degli anaerobi

SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003; 37: 997-1005

Sepsi addominali: quando e quali colture?

I prelievi dai drenaggi addominali possono condurre a risultati errati per la contaminazione della porzione distale del drenaggio, con conseguente copertura antibiotica non necessaria

SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003; 37: 997-1005

Ascessi ed essudati da ferita chirurgica

INDICAZIONI GENERALI Raccogliere i campioni preferibilmente prima di

iniziare la terapia antibiotica Pulire la cute circostante con soluzione fisiologica

sterile.Per ferite chiuse e aspirati: Antisepsi della cute con soluzione di clorexidina 2% o alcool 75% .

Per ferite aperte: prelevare un frammento lavando con soluzione fisiologica sterile prima della raccolta. Prelevare tessuto infetto piuttosto che un frammento superficiale. Evitare la raccolta con tampone per la scarsa significatività, se è possibile eseguire un aspirato o un prelievo bioptico.

CONTENITORI: Flaconi per aerobi e anaerobi

TECNICA DI RACCOLTA

Ascessi chiusi: Aspirare il materiale infetto con ago e siringa, inserire l’ago nel tessuto in

varie direzioni (se possibile).

Se l’aspirazione non porta alla raccolta del campione, si può valutare l’opportunità di iniettare nel sottocute della soluzione salina sterile e aspirare nuovamente.

Inoculare il contenuto nei flaconi sterili per aerobi e anaerobi

Pus: Aspirare la porzione profonda della lesione o l’essudato, con siringa e

ago sterili. Inviare come per ascessi chiusi.

Tessuti e campioni bioptici: Raccogliere una quantità sufficiente di tessuto evitando le aree

necrotiche. Raccogliere i frammenti di tessuto piccoli nel flacone per aerobi e per

anaerobi

Utilizzare i tamponi solo se non può essere ottenuto tessuto o aspirato

Per i prelievi da ferita :Rimuovere i frammenti superficiali tramite irrigazione e pulire con soluzione salina sterile; se la ferita è asciutta raccogliere due campioni imbevuti di soluzione salina sterile; ruotare delicatamente il tampone sulla superficie della ferita per 5 volte, specialmente dove c’è pus o nelle aree infiammate

TRASPORTO DEL CAMPIONE Non refrigerare o incubare prima o durante il trasporto. Se non è possibile inviare subito il campione al laboratorio,

mantenerlo a temperatura ambiente. Consegnare gli aspirati ed i tessuti al laboratorio entro 30

minuti e comunque il prima possibile

Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi : prelievo con siringa

Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi con tampone

Nuovi scenari nella diagnosi microbiologica

di sepsi

Company ProductName

MainMethod

Blood prepMethod

DetectionPathogens

DetectionMethod

Test Times

SeegeneSeeplex® Sepsis Test

Multiplex PCRWhole bloodNo culture

54 Bacteria 6 Fungi(Resistances: 3)

Automated CE or Agarose

4 - 6 hr

Roche SeptiFastReal-timePCR

Whole blood(column)

19 bacteria 6 fungi(Resistances :1)

Real-Time(melting curve)

6 hr

BAGHealth Care

Hyplex®Blood Screen

Multiplex-PCR-ELISA

Blood culture(column)

10 bacteria (Resistances :1)

ELISA 4.5 - 6 hr

SIRS LAB VYOO™ Multiplex PCR LOOXSTER®34 bacteria 6 fungi(Resistances :5)

GelChipsequencing

6 hr

MolzymSepsiTest™Blood

qPCR MolYsis28 bacteria 5 fungi

Sequencing 4 - 6 hr

BACTfishBACTfish™Sepsis kit

in situHybridization

　 9 bacteria3 fungi

Fluorescentmicroscope

1 hr

MobidiagSepsis

ProveIt™ Lab-on-chip

Blood culture(column)

13 bacteria (Resistances :1)

chip 3 hr

Current Sepsis Test Providers

3. Il regime antimicrobico iniziale dovrebbe sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore sulla base dei dati microbiologici e clinici, con lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più stretto per limitare lo sviluppo di resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i costi.

Grado E

MIC = misura della attività antimicrobica “in vitro”

Utilità per il clinico Valutazione comparativa della

possibile efficacia “in vivo”

quale farmaco utilizzare ?

Interpretazione MIC (mg/L)

Ceftazidime S 4

Imipenem S 1

Piperacillina S 32

Ciprofloxacina R 8

Gentamicina S 2

Tobramicina S 1

Amikacina S 1

Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1| 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256

Piperacillina

Ceftazidime

Cefepime

Imipenem

Meropenem

Aztreonam

Gentamicina

Tobramicina

AmikacinaCiprofloxacina

Levofloxacina

S

S

S

S

S

S

S

S

S

R

R

MIC (mg/L) InterpretazioneRange MIC=

S

Ceftazidime 4 S < 1 - 8

Imipenem 1 S < 0.5 - 4

Piperacillina 32 S < 0.5 - 64

Ciprofloxacina 8 R < 0.25 - 4

Gentamicina 2 S < 0.5 - 4

Tobramicina 1 S < 0.5 - 4

Amikacina 1 S < 0.5 - 16

Pseudomonas aeruginosa

Trend % I/R Escherichia coli 2009-ott.2010

Tutti Materiali ND

ESBL

Trend % I/R P.aeruginosa 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

Trend % I/R Klebsiella pneumoniae 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

Produzione di ESBL (CTX-M-15)+

OMP K36

Produzione di ESBL (CTX-M-15)+

OMP K36

ERT

IMIMEM

2007-2008: Klebsiella pneumoniae da vari ospedali

Diffusione clonaleDiffusione clonale

D’Andrea et al., 19th ECCMID

Ampicillina > 16Amoxi/Clav > 16Pip/Tazo > 64Cefotaxime > 16Ceftazidime > 32Cefepime > 16Aztreonam > 16Imipenem 1-2Meropenem 2-4Ertapenem > 8Tigeciclina 1-2Colistina < 1 Isolatoproduttore di ESBL

Amikacina > 32Gentamicina > 8Tobramicina > 8TMP/SXT > 2Ciprofloxacina > 32Levofloxacina > 32

89 Klebsiella spp. 59 Enterobacter spp. (isolati non sensibili ai carbapenemi)

Woodford et al., JAC 2007; 50:582

ESBL oproduzione di AmpC

+perdita di porine

Produzione di carbapenemasi

a serina(KPC, SME, IMI)

Klebsiella pneumoniaeresistente ai carbapenemi

Resistenza emergente ai carbapenemi nelle Enterobacteriaceae

Produzione di

metallo--lattamasi

(VIM, IMP)

EARSS 2008

P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae

VIM-1 a 18IMP-1 a 23

METALLO-BETA-LATTAMASI: UN PROBLEMA GLOBALE

Acinetobacter SIM-1

P. aeruginosaP. aeruginosa

SPM-1GIM-1

P. aeruginosaAIM-1

KHM-1 Citrobacter freundii

EMERGENZA DI KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUTTORE DI KPC IN ITALIAGioconda Brigante1, Silvia Bracco1, Marco Maria D’Andrea2, Tommaso Giani2, Nicoletta Corbo1, Mario Tavola3, Gian Maria Rossolini2, Francesco Luzzaro1

1Laboratorio di Microbiologia e Virologia, Ospedale A. Manzoni, Lecco2Dipartimento di Biologia Molecolare, Sezione di Microbiologia, Università di Siena3Unità di Terapia Intensiva, Ospedale A. Manzoni, Lecco

Tra maggio e giugno 2009, Klebsiella pneumoniae produttore di KPC-2 è stata

riscontrata in 3 pazienti ricoverati presso la Terapia Intensiva dell’Ospedale A.

Manzoni (Lecco). Gli isolati erano caratterizzati da resistenza ad alto livello verso

cefalosporine, fluorochinoloni e piperacillina-tazobactam, mentre gentamicina (MIC, 2

mg/L), tigeciclina (MIC, 2 mg/L) e colistina (MIC, 0.5 mg/L) mantenevano la loro

attività. Per quanto riguarda i carbapenemi, gli isolati presentavano MIC elevate (> 1

mg/L) per tutte le molecole testate (ertapenem, imipenem e meropenem) e test di

Hodge positivo, indicando la possibile produzione di carbapenemasi. La presenza di

enzimi di tipo KPC è stata sospettata sulla base dei risultati dei test di conferma

fenotipici (test di sinergia con EDTA negativo, test di inibizione con acido boronico

positivo) e definitivamente confermata mediante sequenziamento genico.

AMCLI 2009

Suggested action plan for rapid implementation of infection control measures in settings with sporadic occurrence or complete absence of carbapenemase-producing Gram-negatives

NDM-1: una nuova MBL negli enterobatteri

Emergenza e rapida diffusione di E. coli produttore di carbapenemasi NDM-1

NDM-1

Resistenza multipla agli antibiotici in Escherichia coli produttore di carbapenemasi NDM-1

Trend % I/R Acinetobacter baumanni MDR 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

In diminuzione i casi di Acinetobacter baumanni MDR

Trend % I/R Enterobacteriaceae (escluso E.coli) 2009-ott.2010 Tutti Materiali ND

Differenze CLSI – EUCAST CARBAPENEMI e Enterobacteriaceae

CLSI 2010 EUCAST 2010

S ≤ I R ≥ S ≤ I R ≥

Doripenem - - - 1 2 - 4 8

Ertapenem 2 4 8 0.5 1 2

Imipenem 4 8 16 2 4 - 8 16

Meropenem 4 8 16 2 4 - 8 16

Breakpoints EUCAST più bassi rispetto al CLSI

Emocolture 2010 (1)

Emocolture 2010 (2)

Clone circolante di P.aerugionosa R ai carbapenemi

% I/R per Reparti

Caratteristiche Cliniche delle ESBL

Anche quando sensibili in vitro alle Cefalosporine di quarta generazione, si hanno fallimenti terapeutici in clinica

Generano difficoltà cliniche a causa della resistenza crociata con altre classi di antibiotici (p.es. Aminoglicosidi)

Sono associate ad epidemie ospedaliere caratterizzate da alte morbidità e mortalità

Determinano un sovrautilizzo di altri antibiotici ad ampio spettro

ESBLAmpC

inducibile

AmpC

plasmidica

Posizione dei geni di resistenza

Plasmidica Cromosomica Plasmidica

Più spesso trovata in

E. coli

Klebsiella spp.

P.mirabilis

altre

Enterobacter

C. freundii

S. marcescens

M. morganii

Providencia spp.

Proteus rettgeri

E. coli

Klebsiella spp.

Inibizione da Acido clavulanico SI NO NO

Cefoxitina - Cefotetan S R R

Test fenotipici A volte No ?Refertazione

Refertare tutte le Cefalosporine, Penicilline e Aztreonam come resistenti

Aggiungere commento ?

…. riepilogando :

β-lattamasi di tipo AmpC

cromosomica

costitutivaE. coli

ShigellaP.mirabilis

a basso livello

inducibile(transitoria)

EnterobacterC. FreundiiM. MorganiiProvidencia

SerratiaP.aeruginosa

derepressa(stabile)

plasmidicaE. coli

Klebsiella

ad alto livello(ceppi iperproduttori)

Problematiche Cliniche della -lattamasi AmpC

Alcune molecole ( aminocilline, cef. 1°g, a.clav.) sono forti induttori

Altre ( cef. 3°g., ureidopenicilline ) sono deboli induttori ma possono selezionare mutanti derepressi

La produzione di enzima indotta o costitutiva può causare fallimenti terapeutici

-lattamasi AmpC derepressa

Le Cefalosporine selezionano mutanti derepressi da popolazioni inducibile

Selezione si ha in circa il 20% delle batteriemia da Enterobacter

molti isolati di Enterobacter e di C. freundii sono oggi derepressi al primo isolamento

CEFTAZIDIMEa

e/oCEFOTAXIME

Screening positivo per la produzione di

ESBL

MIC 2 mg/L

Escherichia colib

Proteus mirabilisKlebsiella oxytocaKlebsiella pneumoniae

Test di conferma per la

produzione di ESBL

ESBL –

SI

NO

Specie che producono -lattamasi cromosomiche di classe C(per esempio, Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia marcescens, Morganella morganii, Providencia spp. )

Test di conferma per la

produzione di ESBL

Screening e conferma della produzione di ESBL nelle Enterobacteriaceae

Microbiologia Medica 2007; 22:281-290

BETA-LATTAMICI edEnterobacteriaceae

CLSI 2009

Regola esperta:in presenza di ESBL,refertare tutte le penicilline, le cefalosporine e l’aztreonam RESISTENTI

CLSI 2010 EUCAST 2010

S ≤ I R ≥ S ≤ I R ≥

Cefepime 8 16 32 1 2 - 4 8

Cefotaxime 1 2 4 = 1 2 4

Ceftazidime 4 8 16 1 2 - 4 8

Ceftriaxone 1 2 4 = 1 2 4

Aztreonam 4 8 16 1 2 - 4 8

Beta-lattamici ed Enterobacteriaceae

Differenze tra criteri interpretativi

secondo EUCAST e CLSI

S E R V I Z I O DI M I C R O B I O L O G I A E V I R O L O G I A ** LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA ** DIRETTORE DOTT. FABIO RUMPIANESI SIG. C UROLOGIA/156

A nato il :30/07/1951 prenotato il 17/11/2010 n. 459 prelievo del 17/11/2010 alle 18:06 Descrizione Esito ---------------------------------------------------------------------------- MICROBIOLOGIA Materiale: SANGUE Colturale batteri,miceti aerob. Automazione Bactec POSITIVO Microscopico da fl.Bactec aerobio Bacilli Gram-Negativi

Colturale batteri anaerobiosi Automazione Bactec POSITIVO Microscopico da fl.Bactec anaerob Bacilli Gram-Negativi Identificazione 1 anaerobiosi Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia Antibiogramma 1 anaerobiosi Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia Antibiogramma definitivo: la determinazione delle MIC per piperacillina/tazobactam, imipenem e meropenem sono state eseguite con metodo E-TEST. - range sensibilità M.I.C. - Amikacina 4 S <= 16 Amoxicillina/A.CLAV. >=32 R <= 8 Ampicillina >=32 R <= 8 Cefazolina >=128 R <= 8 Cefepime >=64 R <= 8 Cefotaxime >=64 R <= 8 Ceftazidime >=64 R <= 8 ESBL POS + Gentamicina >=16 R <= 4 Imipenem 0,25 S <= 4 Levofloxacin >=8 R <= 2 Meropenem 1,5 S <= 1 Norfloxacina >=16 R <= 4 Piperacillina >=128 R <= 16 Piperacillina/tazobactam >=256 R <= 128 Trimetoprim/Sulfam. >=320 R <= 40 Tygeciclina 2 S <=0,012 =>256