Metodi rapidi e innovativi per l’analisidi contaminanti negli alimenti

Michelangelo PascaleIstituto di Scienze delle Produzioni Alimentari,Consiglio Nazionale delle Ricerche (ISPA-CNR)

17 Settembre 2015Expo Milano – Mipaaf Lounge Cardo Sud

“Le soluzioni tecnologiche per la carta di MilanoLotta alle contraffazioni, diagnostica per il controllo qualità,

qualità delle produzioni alimentari”

Qualità è la totalità degli attributi e caratteristiche di unprodotto (o servizio) che concorrono alla sua capacità disoddisfare specifiche esigenze, implicite o esplicite (ISO 8402)

QUALITA’ DEI PRODOTTI ALIMENTARI

Qualità Merceologica(caratteristiche

commerciali e aspetto del prodotto)

Qualità di Autenticità(origine, tipicità, sistema di coltivazione, contraffazioni)

Qualità Igienico-Sanitaria

(garanzie di sicurezza igienico-sanitaria e di

salubrità)

Qualità Nutrizionale

(caratteristiche della composizione e degli

ingredienti)

Qualità Organolettica

(bontà, aspetti gustativi tipici o particolari)

Qualità Etica(produzione senza

sfruttamento)

Qualità Ambientale

(metodi di produzione eco-compatibili)

la qualità dei prodotti alimentari (come capacità di soddisfazione dei bisogni

del consumatore) è la risultante di un insieme

di fattori

Percezione dei rischi alimentari

Fattori di rischio percepito dai consumatori

Fattori di rischio scientificamente riconosciuti

1. Pesticidi - Metalli pesanti -Contaminanti chimici

2. Microrganismi patogeni(es. Salmonella, Listeria)

3. OGM

4. Additivi

5. Malattie/Disturbi alimentari

6. Micotossine

+

-

1. Malattie/Disturbi alimentari

2. Microrganismi patogeni(es. Salmonella, Listeria)

3. Micotossine

4. Pesticidi - Metalli pesanti -Contaminanti chimici

5. Additivi

6. OGM(EFSA, Eurobarometro 2010)

Scopo di un metodo rapido Metodo di screening (analisi high-throughput di campioni a basso

costo) Metodo quantitativo / semi-quantitativo (generalmente ad un

livello di contaminazione target) Adatto per la determinazione del contaminante ai livelli di legge Utile per scopi operazionali e logistici (process management, HACCP)

Caratteristiche di un metodo di screening semi-quantitativo Il metodo deve essere capace di classificare come positivi almeno il 95% di

campioni contaminati alla concentrazione di interesse (screening target concentration).

I campioni sospetti (positivi) necessitano di essere rianalizzati con un metodo di conferma.

I campioni negativi sono classificati come campioni che non devono essereulteriormente analizzati.

La percentuale di campioni falsi negativi non deve superare il 5%. I falsi positivi di campioni non contaminati non hanno impatto sulla salute

del consumatore, ma un numero elevato di campioni falsi positivi rende ilmetodo di screening poco affidabile.

Tempi lunghi per la preparazione del campione

• Molitura• Estrazione• Clean-up

Tempi lunghi per la rivelazione/determinazione

• GC-ECD (MS)• HPLC-DAD (FLD, MS)

Strumentazione e consumabili costosi

Operatori esperti

c’è una crescenterichiesta di metodi rapidi

e semplici

RIVELAZIONEDETERMINAZIONE

(per es. GC, HPLC)

CLEAN-UP

ESTRAZIONE

Metodo tradizionale

Tempo di analisi: 2 - 10 h

Metodi di analisi rapidi

ESTRAZIONE

Metodi rapidi

Tempo di analisi: 5 - 20 min

Metodi rapidi

RIVELAZIONEDETERMINAZIONE

(per es. GC, HPLC)

CLEAN-UP

ESTRAZIONE

Tempo di analisi: 2 - 10 h

RIVELAZIONEDETERMINAZIONE

Metodo tradizionale

Immunosaggi/immunosensori:- (Fast)Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Flow Through Immunoassay (FIA)- Lateral flow devices (LFD) or dipsticks- Fluorescence polarization immunoassays (FPIA)- Surface plasmon resonance (SPR)- Electrochemical immunosensors (ES)- Biosensor arrays

Metodi indiretti di screening: spettroscopia nel vicino infrarosso (FT-NIR), nasi elettronici

Metodi che usano nuovi recettori: aptameri, frammenti di anticorpi, polimeri a stampo molecolare (MIP), peptidi

Metodi rapidi

Il segnale è inversamente proporzionale alla concentrazione dell’analita

Incubazione

Lavaggio

Aggiunta del substrato

Interazione Substrato – Enzima: sviluppo di addotto colorato

Antigene

Coniugato antigene-enzima

Anticorpo primario specifico

Enzima con segnale cromogeno

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

FAST ELISAtempo di analisi: 10-20 minuti

r-biopharm

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) commerciali

Neogen

Romer Labs®

• Allergeni

• Micotossine

• Ormoni e anabolizzanti

• Antibiotici

• Microorganismi patogeni

0

500

1000

1500

2000

2500

0 500 1000 1500 2000ELISA DON (ng/g)

HPLC

DON

(ng/

g)

range 18.5 – 2,000 ng/g

y = 0.9011x – 1.5669r = 0.9581

n = 217

Pascale et al. 2009

DON in frumento duro: ELISA vs HPLC

RIDASCREEN® DON, r-biopharm

Progetto MICOCER (MiPAAF)

Strip tests e Lateral Flow Device (LFD)(basati sulla reazione antigene-anticorpo)

C

T

C

T

C

T

Campione positivo (contaminato): Linea di Controllo (C) colorata, Linea Test (T) assente o leggermente colorata

positivonegativo positivo

• L’uso di un lettore fotometrico permette l’analisi quantitativa

Campione negativo:Linea di Controllo (C) e Linea Test (T) colorate

Lateral flow devices (LFD) o “dipsticks”commerciali

• Ormoni e anabolizzanti

• Micotossine

• Allergeni

• Antibiotici

• Microorganismi patogeni

r-biopharm

VICAM

Charm

Incubazione a 40°C, 10 min Migrazione, 10 min

Tempo totale di analisi: 30 min per 6 micotossine

Immunosaggio multiplex dipstick per la determinazione semi-quantitativa di tossine di Fusarium in cereali

Estrazione con metanolo/acqua

Diluzione con tampone

Lettore

NEG: Linea test piùscura della linea dicontrollo

POS: Linea test meno colorata dellalinea di controllo ZEA

T2+HT2DON

FB1+FB2CTRL

Lattanzio et al., Analytical BioanalyticalChemistry, 2013, 405, 7773-7782 www.unisensor.be

Immunosaggi basati sulla polarizzazione di fluorescenza (FPIA)

Elementi di un FPIA

• Anticorpo specifico• Tracciante (antigene fluorescente)• Lettore per misurare la polarizzazione di fluorescenza

O

OOH

OH

OO NH

O

O

O

HO

O OH

DON-FL

Il saggio è basato sulla competizione in soluzione tra un antigene libero (Ag) el’antigene fluorescente marcato (Ag-FL) per un anticorpo specifico

FPIA è un immunosaggio competitivo in fase omogenea

FPIA sviluppati presso ISPA-CNR• DON in frumento e prodotti derivati (Lippolis et al., 2006; Valenzano et al., 2014)

• Tossine T-2 and HT-2 in frumento, orzo, avena, fiocchi d‘avena (Lippolis et al., 2011)

• OTA in frumento e vino rosso (Zezza et al., 2009; Lippolis et al., 2014)

y = 1.0126x – 0.0933R 2 = 0.9898

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.50 3.00

[DO

N] b

y FP

IA (µ

g/g)

[DON] by HPLC-UV (µg/g)

Livelli massimi ammissibili in

frumento duro in UE

Frumento naturalmente contaminato (n=147)

DON in frumento

Lippolis & Maragos, World Mycotoxin Journal, 2014, 7(4): 479-489

FPIA – applicazioni

Tempi di analisi 10-15 min

Nuovi materiali per l’analisi di contaminnati: aptameri

Gli aptameri sono oligonucleotidi a singolo filamento (DNA o RNA) che legano molecole targetcon alta affinità e specificità.

Gli aptameri sono prodotti mediante un processo di selezione in vitro chiamato SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential).

Gli aptameri, come gli anticorpi, possono essere utilizzati per lo sviluppo di kitELISA, biosensori, cromatografia per affinità, lateral flow devices.

SELEX procedure from McKeague M, Bradley CR, De Girolamo A, Visconti A, MillerJD, DeRosa MC. 2010, Int J Mol Sci, 11, 4864.

Aptamer

~ 4 nm

Caratteristica Aptamero Anticorpo

Produzione In vitro In vivo (uso di animali, almeno nella fase iniziale di produzione)

Variazione batch-to batch

Nessuna Possibile

Analita target Piccole molecole, macromolecole, cellule

Deve stimolare una rispostaimmunitaria

Selettività/Affinità Medio/Alta Alta

Shelf-life Anni (a differentitemperature)

Settimane (a 4°C)

Condizioni di lavoro Fisiologiche, non-fisiologiche (media)

Fisiologiche, non-fisiologiche (bassa)

Aptameri vs Anticorpi

Analisi quantitativa(Partial Least Squares Regression)

Analisi qualitativa(Linear Discriminant Analysis)

Frumento duro naturalmente

contaminato da DON

Preparazione del campione

Dimensioni delle particelle< 500 µm

Molitura

Tempo < 3 min

Nicolet Antaris II (ThermoFisher Sci. Inc)NIR region, 10000-4000 cm-1

Diffuse reflectance, Resolution 8 cm-1, 128 scans/sample

Tempo < 2 min

Analisi FT-NIR

Analisi di riferimento

Immunoaffinity clean-up HPLC/UV

Ab

sorb

ance

Wavenumber (cm-1)

Spettri FT-NIR

Sviluppo del metodo

Calibrazione (valore di riferimento vs valore

predetto)

Analisi statistica chemiometrica

Validazione(abilità di predizione del metodo)

Spettroscopia FT-NIR per lo screening di DON in frumento

Performance parameters (%) cut-off 1400 µg/kg

Overall classification rate 90

False compliant samples 5

False not compliant samples 5

Class “A”[DON] ≤ cut-off

Compliant samples

Class “B”[DON] > cut-off

Not compliant samples

Calibration/validation set

De Girolamo et al., Toxins, 2014, 6, 3129-3143

Linear Discriminant Analysis(LDA)

-6000

-4000

-2000

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000

DON by HPLC (µg/kg)

DO

N b

y FT

-NIR

(µ

g/kg

)

ycal = 0.802x + 477r2

cal = 0.802yval = 0.691x + 695r2

val = 0.634

Calibration

Validation

Statistical parameters

RMSEC (µg/kg) 1473

RMSEP (µg/kg) 1977

PC 1 (77%)PC

2 (1

1%)

Root Mean Square Error of Calibration (RMSEC)Root Mean Square Error of Prediction (RMSEP)

Partial Least Squares Regression(PLS)

Class B [DON, µg/kg] > 1400Class A [DON, µg/kg] ≤ 1400

EU maximum permitted level 1750 µg/kg

Spettroscopia FT-NIR per lo screening di DON in frumento

Naso Elettronico basato sulla tecnologia MOS (Metal Oxide Semiconductors)

Il naso elettronico (sistema olfattivo artificiale) comprende un array di sensorichimici con specificità parziale e un appropriato sistema di trattamento dati ingrado di caratterizzare e riconoscere odori semplici o complessi ed eseguire cosìun’analisi qualitativa e/o quantitativa di miscele gassose

SecondiV

aria

zion

e %

(1

00

*(R

-R0)/

R0)

Pattern sensoriale

12 sensori MOSdifferentemente drogati ANALISI STATISTICA

con

cen

traz

ion

e

specie chimiche

Pattern chimico (VOCs)

Naso elettronico basato su sensori MOS per lo screening di DON in frumento

Class C [DON, µg/kg]>2500

Class B 1000<[DON, µg/kg]<2500

Class A [DON, µg/kg]<1000

Analisi e-nose (n= 525) Discriminant Function Analysis (DFA)

Metodo di riferimento (HPLC)

105 campioni di frumento naturalmente contaminato da DON

Molitura

Percentuali di riconoscimento A (%) B (%) C (%) Media (%)

Calibrazione 90 84 86 87

Validazione 86 78 83 82

Lippolis et al., Food Control, 2014, 37, 263-271

Sensing flow channel (FC1)

Reference flow channel (FC2)

rabbit policlonalanti-OVA antibody

rabbit policlonalnegative antibody

2 FLOW CHANNELS

Ovalbumina

Pre-trattamento fast

Vino bianco

Legante: anticorpo policlonale anti-OVA

NHS/EDC

poli-antibody

Biosensore SPR per ovoalbumina nel vino

Pilolli et al., Anal. Bioanal. Chem., 2015, 407, 3787-3797

Vantaggi e svantaggi dei metodi rapidi

Metodo Vantaggi Svantaggi

ELISA Anticorpi disponibili per molticontaminnati

Buona sensibilità Analisi simultanea di un

grande numero di campioni Semplice preparazione del

campione Strumentazione poco costosa Limitato uso di solventi

organici

Alcuni test ELISA hanno lunghi tempi di incubazione (tempo totale di analisi 5-100 min)

Cross-reattività dell’anticorpo Sovrastima (interferenze di matrice) Possibili risultati falsi positivi/negativi Analisi di conferma necessaria (per i

positivi)

Dipstick / LateralFlow device

Rapido (5-10 min) Nessuna purificazione Facile da realizzare Limitato uso di solventi

organici Può essere usato in situ Quantitativo (uso di lettore) Strumentazione poco costosa

Semi-quantitativo (cut-off) Problemi di interferenze dovute alla

matrice (falsi positivi) sensibilità non sempre accettabile ai

livelli vicini ai limiti di legge Possibili risultati falsi positivi/negativi Analisi di conferma necessaria (per i

positivi)

Metodo Vantaggi Svantaggi

FPIA Rapido (10-15 minuti) Nessuna purificazione Facili da realizzare Buona accuratezza Buona precisione Poco costoso

Intervalli di linearità relativamenteristretti

Poco sensibili (per alcuni contaminanti)

FT-NIR Rapido (5 minuti) Non distruttivo Pratico

Qualitativo/semi-quantitativo Strumentazione costosa Necessità di modelli di calibrazione Necessità di basi di statistica Possibili risultati falsi positivi/negativi

Nasoelettronico

Rapido Non distruttivo Pratico

Qualitativo/semi-quantitativo Necessità di modelli di calibrazione da

aggiornare nel tempo Necessità di basi di statistica Possibili risultati falsi positivi/negativi

Vantaggi e svantaggi dei metodi rapidi

Validazione di metodi rapidi commerciali

E’ il processo per dimostrare o confermare le performance di un metodo di analisi (test kits rapidi).Coinvolgimento di laboratori indipendenti.

Performance Tested MethodsSM

Administered by AOAC Research Institute

http://www.aoac.org/iMIS15_Prod/AOAC_Member/RICF/RI_Main.aspx

GIPSA Performance Verified Rapid TestKits for Analysis of Mcotoxins

http://www.gipsa.usda.gov/fgis/tech-servsup/metheqp/GIPSA_Approved_Mycotoxin_Rapid_Test_Kits.pdf

ELISA53%LFD

27%

FIA5%

IAC/FL or UV5%

FPIA4%

SPE/FPIA4%

SPE/FL1%

IAC/FIA or FPIA 1%

182 test kits (aggiornato a Settembre 2014)

Test kits commerciali per l’analisidi contaminanti - micotossine

La validazione di kits commerciali è richiesta pergarantire l’affidabilità dei risultati

AOAC PTM2%

GIPSA-USDA24%

AOAC/GIPSA3%

no validation71%

Regolamento (UE) N. 519/2014

…………

Sfide future

Garantire la sicurezza alimentare e la nutrizione in una complessa e globalizzata catena di approvvigionamento alimentare e in un sistema alimentare che sarà dominato da catene alimentari alternative.

Food Chain Evaluation Consortium (FCEC)Final Report (2013)

(DG SANCO)

Salvaguardare la sicurezza degli alimenti e la nutrizione in una situazione di risorse alimentari di scarsa qualità e nuove condizioni climatiche, che influenzano la produzione primaria, lo stoccaggio e il trasporto.

Priorità nella ricerca scientifica

Metodi di screening rapidi e poco costosi (di facile utilizzo, accurati, affidabili, selettivi) per il controllo della contaminazione da utilizzare anche a livello di PMI

Tecniche “omics” (genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica) per la valutazione del rischi di contaminanti

Nuovi contaminanti (chimici e biologici)

Organismi Geneticamente Modificati (OGM) e loro impatto sulla salute.

Studio e uso di biopesticidi (biocontrollo)

Rischi legati alle produzioni biologiche (igiene, contaminanti)

Packaging (nuovi materiali, rilascio di sostanze tossiche)……………..

Grazie per l’attenzione

Michelangelo Pascalemichelangelo.pascale@ispa.cnr.it