Post on 15-Feb-2019
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.1
CAP.IV
ERGOCINETICHE E CHEMIO-BIO CINETICHE
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.2
4.0.0.0.- Ergo-cinetiche e Chemio-bio-cinetiche1. Xenobiotici. Inquinamento e bilanci
energetici. Il trade-off
L’ergo-cinetica é lo studio dell’assunzione, dell’accumulo, della distribuzione, della
trasformazione e dell’eliminazione dell’energia negli organismi viventi.
La tossico-cinetica é lo studio delle velocità (cinetiche) delle reazioni ambientali con particolare
riguardo ai processi d'assunzione, accumulo, distribuzione e di release (eliminazione) dei composti
chimici xenobiotici (e non) immessi negli ecosistemi da parte degli organismi viventi.1
Un composto xenobiotico è definito come un composto estraneo ad un organismo ossia che non
ha un ruolo essenziale nei processi biochimici di quell’organismo. Da ciò discende che un composto
chimico normale per un organismo può essere xenobiotico per un altro. Così composti xenobiotici
possono esistere anche d’origine antropogenica originati forse fin dall’inizio della vita evolutiva nel
nostro mondo terrestre.
Da un punto di vista evolutivo l’esistenza naturale di composti xenobiotici che potremmo
considerare aggressivi chimici, è di considerevole interesse. Per esempio si conosce l'evoluzione dei
meccanismi di detossificazione che gli animali hanno sviluppato nei confronti di xenobiotici prodotti
da piante.
É chiaro, peraltro, che noi ci occuperemo prevalentemente dei composti xenobiotici non
naturalmente prodotti ma di quelli che, originati dall’attività industriale (seppur connessa con l'attività
antropica della vita comune), si sono immessi negli ecosistemi pervenendo, come target finale,
all’uomo. É comunque importante ricordare che composti xenobiotici esistenti naturalmente negli
ecosistemi come, ad esempio, le piretrine, la nicotina, vari tipi di micotossine ecc., seguono, nelle
strutture biologiche, gli stessi processi tossicocinetici dei composti xenobiotici prodotti dai processi di
sintesi industriale sia come materie prime che come cataboliti della stessa attività processuale.
LA CHEMIO-BIO-CINETICA é una parte fondamentale dell’ecotossicologia perchè permette la
comprensione e la previsione del comportamento di sostanze inquinanti negli organismi viventi. Il suo
studio s'innesta nella linea dell'ecotossicologia che studia la dinamica ambientale ossia il movimento
degli xenobiotici nell’ecosistema globale (modello LI(f)ER), nell’aria, nell’acqua e nel suolo.
1. Viene usato spesso anche il termine tossicocinetica ma il termine tossico non é dei migliori in quanto indicherebbe un’azione tossica (e non solo chimica). Invece i processi studiati in queste cinetiche sono validi anche per composti “benefici” nei confronti dell’organismo bersaglio (es.: xenobiotici).
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.3
Anche se il processo che chemio-bio-cinetico é prevalentemente d’interesse per i composti
organici lipofili (in grado quindi di ripartirsi prevalentemente nella fase lipidica) chiaramente i cammini
di tutti i composti chimici sono gli stessi; varieranno solo le velocità dei processi d’assunzione, di
distribuzione e di rilascio.
L’ERGO-CINETICA, a livello cellulare, é di pari importanza della tossicocinetica se non in misura
superiore. Infatti come un composto chimico si ripartisce nelle varie componenti dell’organismo, così
fa l’energia condizionandone la vita e la sopravvivenza.
Anche l’energia, assunta tramite l’alimentazione ed eliminata nella forma più degradata (calore)
come catabolita, segue i principi della termodinamica (pare ovvio!) che regolano il comportamento
della tossicocinetica.
In ergocinetica un parametro importante da sviluppare é quello dei bilanci d’energia negli
organismi espresso dal concetto di trade-off.
Come vedremo tale concetto fornirà un’ottica nuova per valutare e definire i processi
d’inquinamento e l’inquinamento medesimo attraverso l’inferenza e l'interferenza con i processi vitali
d'energia degli organismi.
É un concetto nuovo e forse poco comprensibile di primo acchito ma che s’inserisce
perfettamente nei principi dell’energia che abbiamo sviluppato e sottolineato fin dai primi capitoli di
Fig.4.1 – Il trade-off questo trattato e di cui, qui di seguito, parleremo più estesamente.
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.4
Il termine trade-off, mutuato dalle scienze economiche, in Ecotossicologia intende il bilancio
globale di materia e quindi d'energia che un sistema biologico realizza durante la sua esistenza e che
corrisponde ad un dare-avere tra l'energia assunta attraverso l'alimentazione (o in alcuni casi
attraverso i raggi solari) e l'energia consumata nei processi biochimici essenziali: metabolismo
basale, sintesi e accrescimento, manutenzione cellulare e tissutale, escrezioni e produzione
(riproduzione), come riportato nello schema precedente.
I processi d’inquinamento vanno visti in termini ecotossicologici come interferenti nell’equilibrio di
trade-off del sistema biologico interessato.
L’inquinamento si pone come processo competitivo dei processi base energetici e, quindi,
può essere considerato come antagonista nell’uso delle energie destinate agli obiettivi più nobili dei
processi vitali.
In sostanza la cellula vitale considera il composto inquinante (o, in termini più generali, lo
stressore chimico o fisico o psicologico che sia) come una molecola estranea alla sua funzionalità biologica, corpo estraneo che si oppone alla stessa sua sopravvivenza.
La verifica di tale fenomeno induce la cellula ad usare quanta più energia possibile per mettere in
essere tutte le difese biochimiche (e quindi energeticamente depauperanti) per eliminare l’agente
xenobiotico ostile.
Ovviamente le energie utilizzate e consumate nel processo di difesa non sono più disponibili
(o lo sono in misura ridotta) per gli altri processi vitali con rallentamento se non con inibizione totale
degli stessi.
Tutti sono ben coscienti che una malattia infettiva ci lascia molto deboli e debilitati: abbiamo
una prova evidente che uno stressore (il biochimismo dell’agente patogeno) ha consumato parte
delle nostre energie (anche se aiutato da un “contributo energetico” dei xenobiotici) lasciando
l’organismo in carenza d'energia. Una febbre violenta, che passi da sola senza l’aiuto di terapie,
lascia ancora di più l’organismo a livello di disponibilità energetiche assai basso.2
L’interferenza dello stressore può essere così elevata ed intensa da provocare non solo
rallentamenti nello sviluppo somatico e nervoso ma anche impedire la normale riproduzione. E se
l'inquinamento si traduce in una perdita di riproduzione, danneggia anche il meccanismo
d’acquisizione delle risorse e d'accumulo fino alla negazione della possibilità di produrre energia per
la detossificazione.
In questo secondo caso si riducono le possibilità di morte pagando il costo in termini di perdita di riproduzione. In pratica tutte le risorse energetiche, incluse una parte di quelle destinate
alla riproduzione (ma non la parte pregiata d'energia, gelosamente stoccata e tenuta di riserva per il
processo finale della riproduzione stessa che non viene e non può essere utilizzata se non per lo
2 Basti pensare al pacchetto energetico di “calore” che la febbre provoca e che é dato dai processi di difesa dell’organismo che, aumentando la temperatura, tentano di produrre condizioni inibitorie per lo stressore patogenico
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.5
specifico obiettivo), vengono indirizzate contro la minaccia alla propria sopravvivenza rappresentata
dallo stressore.
In tale processo tutti i "soldati" d'energia vengono inviati al “fronte” e le riserve, "in caserma" non
sono in grado di attivare i processi di riproduzione per i quali esisterebbero, comunque, le risorse
energetiche.
In tal modo l'organismo tenta di mantenere la sua propria esistenza a discapito della
procreazione di nuovi individui che, come sappiamo, é il destino entropico del sistema biologico. Suo
malgrado, ma in una logica stringente in termini d'energia, l'organismo scambia la perdita di
produzione (riproduzione) con la riduzione del tasso di mortalità.
In un certo modo si potrebbe pensare a questo scambio tra tasso di riproduzione e tasso di
mortalità come ad un affare commerciale coatto (trade-off) che si sviluppa in una nazione in
condizioni di crisi (guerre ecc.) tra l'industria della produzione e quella della difesa, perchè i
meccanismi che servono a difendere la sopravvivenza della nazione stessa attingono alle stesse
risorse necessarie per un armonico sviluppo economico e tecnologico della nazione che, di
conseguenza, si ferma (morbilità economica ed ambientale) quand'anche non arrivi alla completa
distruzione (mortalità economica ed ambientale).
Questo modo d'intendere l'inquinamento ben s’inquadra nel concetto di "Scope for Growth"
(SFG) definito come la differenza tra l'accumulo d'energia e le perdite metaboliche totali.
Studi in campo e in laboratorio hanno confermato come le conseguenze a lungo termine sulla
crescita e sulla sopravvivenza degli individui possano essere predette da effetti misurati sul bilancio
d’energia a livello d’individuo.
Ad esempio Widdows e Donidri (1991) hanno rilevato come la causa della riduzione nell'
SFG in Mytilus edulis in luoghi contaminati possa essere assegnata ad inquinanti specifici.
Il modo con cui gli animali si difendono dagli inquinanti (tossici od interferenti) è di varia natura: il
principale è quello di copularli con una struttura chimica eliminabile con i liquidi organici, e quindi
permetterne la fuoriuscita dal corpo cellulare.
Un secondo sistema è quello di bloccarli in situ dopo averli resi innocui, o attraverso una forma di
riduzione (precipitazione di granuli di metallo nella cellula o in siti intracellulari) o inglobandoli in
proteine di difesa (metallotioneine).
Ambedue i processi possono coesistere e, come sempre, prevarrà quello che energicamente
sarà più favorito. Tutti questi processi sono naturalmente a costo energetico più o meno elevato a
seconda dell'intensità del processo stesso depauperando il budget energetico di base di cui abbiamo
precedentemente parlato.
4.1.0.0.- Processi ergo-cinetici: I modelli energetici
Il trade-off si può studiare attraverso vari modelli energetici. Nella nostra trattazione
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.6
considereremo due classi d'animali: i molluschi ed i pesci, cui applicheremo le considerazioni bio-
energetiche.
In particolare ci occuperemo dei processi d'assunzione/eliminazione che saranno oggetto della
seconda parte del capitolo relativa alle tossicocinetiche dei nutrienti.
Nel caso dei molluschi il processo d’assunzione/eliminazione in termini energetici è stato
proposto in maniera ottimale da Kooijman3 che ha tentato di spiegare numericamente le modifiche
delle condizioni fisiologiche dell'animale. Tale modello, noto come Dynamic Energy Budget (DEB),
descrive le dinamiche energetiche in funzione della crescita e della riproduzione dell'animale.
In tale modello si considera l'assunzione del cibo direttamente dall'ambiente e l'eliminazione del
tossico attraverso la riproduzione tramite l'emissione dei gameti nell'ambiente, oltre alle vie principali
d’accumulo ed eliminazione
Un fattore che appare importante nel modello è il contenuto in lipidi nel tessuto che sembra
condizionare la velocità d’assunzione e di rilascio.
Poiché il contenuto in lipidi nell'animale varia nel tempo, è presumibile pensare che essi
influenzino la concentrazione del tossico nell'animale anche quando il tossico permane costante
nell'ambiente nel quale l'animale vive.
Un punto relativamente critico del modello DEB, è che le condizioni fisiologiche dell'individuo
utilizzato per lo studio non vengano alterate dal composto utilizzato nell'esperimento.
É ovvio pensare che la presenza di un tossico possa altresì influenzare le risposte fisiologiche
dell'animale e quindi è importante sapere qual è il limite critico al quale questo processo ha luogo.
Nel caso dei mitili, secondo la sperimentazione valori dell'ordine dei 100 µg L-1 non influenzano
negativamente i processi fisiologici della respirazione, della crescita e della ingestione del tossico.
L’interpretazione di dati ecotossicologici e di monitoraggio ambientale è stata perfezionata
dalla conoscenza della relazione tra la concentrazione degli elementi xenobiotici nell’ambiente e nei
tessuti dei biota.
La maggior parte degli studi sulle cinetiche di assunzione e di eliminazione ammettono
implicitamente delle condizioni di stato stazionario per gli altri processi fisiologici nell’organismo. I dati
di monitoraggio in campo e sperimentali sono quindi il più delle volte analizzati con modelli di
assunzione e rilascio monocompartimentali.
Questi modelli però non si adattano sempre bene ai dati ottenuti, specialmente quando
l’organismo cambia condizioni fisiologiche con un andamento paragonabile
all’assunzione/eliminazione degli elementi xenobiotici come nel caso del ciclo riproduttivo o del
cambiamento di taglia o di riserve d’energia4.
Il modello d’assunzione/eliminazione proposto da Kooijman e van Haren vuole spiegare i
cambiamenti nelle condizioni fisiologiche (alimentazione/lipidi) dell’organismo. 3 Kooijman et al., 1990
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.7
Il carico di xenobiotico in M. edulis è influenzato da molte variabili fisiologiche tra cui temperatura,
taglia e ciclo riproduttivo: sono state riscontrate correlazioni tra mitili della stessa taglia e quantità di
cibo. La concentrazione di xenobiotico viene di solito espressa come peso secco del tessuto e dato
che i pesi dei vari tessuti variano con la stagione e la temperatura, le variazioni di concentrazione del
cadmio sono difficili da interpretare.
Infatti il peso secco riflette in parte la condizione in cui si trovano le gonadi e le riserve di energia,
in parte la taglia del mitilo. Interessanti studi sui PCB hanno dimostrato, ad esempio, come il carico di
PCB aumenti all’aumentare della lunghezza della conchiglia e diminuisca con l’emissione dei gameti.
Lo sviluppo del modello tiene conto soltanto della parte dell’alimentazione dividendo uno
stadio giovanile pre-riproduttivo ed uno stadio adulto riproduttivo. Vengono distinte quattro frazioni
separate del corpo: la frazione acquosa (p.e. sangue), la componente strutturale, le riserve
accumulate di energia, e una componente a parte per la riproduzione (i mitili perdono 40-70 % del
peso umido durante la fecondazione, che recuperano durante tutto il resto dell’anno).
4.1.1.0.- Processi ergo-fisiologici
L’assunzione del cibo è proporzionale all’area di superficie (dell’apparato filtratore e dell’intestino)
del mitilo e segue un responso funzionale del tipo II di Holling
f =X
K + X dove f indica il responso funzionale scalare, X la quantità ambientale di cibo e K la costante di
saturazione. Si considera costante la conversione cibo-energia dell’intestino. L’energia entrante si
aggiunge a quella delle riserve, che segue un processo del primo ordine:
ddt
e = vV −1/ 3( f − e)
dove e è la densità pesata di immagazzinamento, V è il volume strutturale (lunghezza) e v è la
conduttività elettrica (l t-1) (p.e.: una misura di resistenza per il flusso di energia dall’acquisizione
energetica all’utilizzazione dell’energia). L’energia utilizzata viene presa dalla parte immagazzinata di
cui una frazione fissa k è usata per la crescita e il mantenimento, che è considerato proporzionale al
biovolume. Conseguentemente, la crescita è data da una differenza pesata tra l’area di superficie e il
volume:
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.8
ddt
V =V 2/ 3ev − Vgm
e + g dove g è un rapporto di investimento adimensionale (costi energetici per nuovo biovolume in
relazione al massimo di energia disponibile per la crescita più il mantenimento) ed m la costante del
contributo al mantenimento (t-1) (rapporto dei costi per il mantenimento e sintesi di biovolume). La
crescita si blocca quando c’è un calo delle riserve d’energia:
e < V1/3mg / v
Una frazione 1 - k dell’energia usata per l’immagazzinamento è usata nello sviluppo più la
riproduzione. Si assume che il mantenimento allo stadio adulto sia pari a (1 - k ) gmVj dove Vj è la
taglia all’inizio dello stadio adulto (lunghezza ). Da questa regola di distribuzione segue che
l’investimento nella riproduzione è dato da:
ddt
G =(1− k)e
e+ g(vgV 2/ 3 + gmV) − (1− k)gmVj
e, per organismi che non crescono:
ddt
G = evV 2 /3 − kgmV − (1 − k)gmVj
dove G = Ggo + Gga è il volume delle gonadi e dei gameti. I gameti vengono conservati in un
organulo che viene svuotato una volta all’anno al momento della riproduzione. Ciò causa un
sostanziale cambiamento nel contenuto in lipidi attraverso le stagioni all’interno del mitilo. I gameti
accumulati, Gga, non sono metabolicamente disponibili per altri scopi. La densità del volume
riproduttivo é r = G/V ed il suo cambiamento:
drdt
= V −2 V dGdt
− G dVdt
⎛ ⎝
⎞ ⎠ = V −1 dG
dt− GV −2 dV
dt
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.9
4.4.0.0.- Processi chemo-bio-cinetici: I bilanci di materia 4.4.1.0.- Aspetti qualitativi 4.4.1.1.- Generalità La concentrazione che un tossico viene ad assumere in un organismo animale o vegetale
dipende da due processi antagonisti: il processo d’assunzione (Uptake) e quello di rilascio o di
depurazione. I due processi per ogni stadio o nella loro globalità sono esprimibili con due costanti che
indicano la velocità di accumulo e/o di clearance del tossico da quello specifico stadio biologico o dal
corpo completo dell'animale.
La prima costante (Ka) é chiamata la costante della velocità d’assunzione (Uptake Rate Costant)
ed é espressa in ml g-1 h-1 o, assumendo la densità del tessuto in un grammo per millilitro, in h-1).
La seconda costante, indicata con Ke e la costante del primo ordine di eliminazione
(depurazione) dell'animale o di clearance (anch'essa in h-1).
Una volta che il composto chimico è entrato attraverso la membrana cellulare nell’organismo,
potremmo individuare, in quest’ultimo, quattro siti importanti di reazione: i siti dell’azione tossica, i siti
del metabolismo, i siti di stoccaggio ed i siti di escrezione.
A) I siti dell’azione tossica. In tali siti la forma tossica della sostanza inquinante interagisce con una macromolecula
endogena (es.: una proteina o DNA) od una struttura biologica (es.: la membrana cellulare) portando
a manifestazioni tossiche nell’intero organismo.
B) I siti del metabolismo.
Sono rappresentati da enzimi che metabolizzano i composti xenobiotici. Di solito il processo
metabolico porta alla detossificazione del composto. Attenzione, però, poiché in alcuni casi il
processo metabolico porta all’attivazione (aumento della tossicità) del composto.
C) I siti di stoccaggio. In questi siti il composto xenobiotico viene inertizzato sotto forma di una struttura inerte dal punto
di vista della attività tossicologia (granuli di metallo, per esempio).
D) I siti d’escrezione.
L’escreto può essere la stessa sostanza inquinante originale inalterata. Prevalentemente, però,
ciò che viene escreto é il prodotto di biotrasformazione (metabolita o composto coniugato).
Il modello più semplice di tossicocinetica é rappresentabile da un modello monocompartimentale
ove si assume che il composto xenobiotico entri, si accumuli, e si metabolizzi in un solo “reattore”. In
realtà i compartimenti di un organismo sono molti e l’ubicazione del tossico può essere molto varia.
Così, uno xenobiotico può essere immagazzinato sia in depositi grassi che in membrane inerti.
Anche una struttura bersaglio per un tossico o per un xenobiotico può essere multipla e localizzata in
parti diverse dell’organismo. Ad esempio una potente neurotossina come la colinesterasi può
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.10
incontrare siti bersaglio sia nel sistema nervoso centrale che in quello periferico.
Dopo il processo di uptake la sostanza inquinante é trasportata ai diversi compartimenti del corpo
da sangue e linfa (vertebrati) o dall’emolinfa (insetti). Il passaggio negli organi e nei tessuti si realizza
per diffusione attraverso barriere di membrana o, per composti estremamente lipofili attraverso co-
trasporto con lipidi.
Molecole prive di carica, con pesi molecolari inferiori a 600 (impedimento sterico!) e con un
discreto coefficiente di ripartizione ottanolo/acqua, si muovono attraverso le membrane per diffusione
passiva. Anche le lipoproteine agiscono come carrier “dissolvendo” composti particolarmente lipofili.
I composti non metabolizzati vengono immagazzinati in strutture di deposito dei grassi od altre
strutture lipofile come le membrane o le lipoproteine.
Tali depositi di composti lipofili potenziamente tossici possono essere protettivi a breve termine.
A lungo termine, comunque, può succedere che il processo si inverta e vi sia un rilascio del
composto dalla struttura di accumulo. Questo processo é sempre legato al potenziale chimico
assunto dal composto nella struttura di storage (stoccaggio).
Quando il potenziale chimico o la fugacità eccedono le “resistenze” della struttura, si ha il rilascio
del tossico stoccato. Questo può condurre a improvvisi effetti tossici nella cellula interessata. Questo
fenomeno, chiamato anche tossicità ritardata (delayed toxicity) é stato osservato nel caso di alcuni
insetticidi clorurati come la dieldrina.
La bassa fugacità dei composti xenobiotici nelle strutture lipidiche espressa da alti valori di Kow
rispetto alla fase acquosa, porta al fatto che il composto non viene espulso direttamente nelle feci o
nelle urine degli organismi.
Riportiamo, nella figura che segue, i quattro processi di trasporto prevalenti attraverso la
membrana citoplasmatica dei metalli:
1. Processi di trasporto carrier-mediated. (Fig.4.2 - prima figura dall'alto). Sono quelli mediati da
un trasportatore, in cui alcune proteine (L) formano, con il metallo, un complesso solubile nei lipidi,
ML; il complesso diffonde entro la membrana, ed il metallo può essere rilasciato nel citosol (il
contenuto acquoso della cellula vivente). La maggior parte dei metalli entra nella cellula attraverso
questo percorso.
2. Processi di trasporto attraverso i canali proteici. (Fig.4.3 - seconda figura dall'alto) Ioni del
metallo possono essere trasportati fra le proteine che si estende attraverso la membrana e che
presentano molti gruppi idrofilici.
3. Processi di trasporto per diffusione passiva. (Fig.4.3 - terza figura dall'alto). Specie del metallo
che sono solubili nei lipidi (non polari) si possono dissolvere nella membrana e rapidamente
attraversarla. Questo processo è invocato spesso per spiegare l’uptake rapido di metalli-alchili da
organismi unicellulari.
4. Processi di trasporto per endocitosi. (Fig.4.3 - quarta figura dall'alto). La membrana plasmatica
è fluida. Una regione della membrana può invaginare ed avvolgere una particella contenente il
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.11
metallo e fondersi con essa per formare una vescicola intracellulare.
Fig.4.2
4.4.1.2.- La clearance plasmatica
In ecotossicologia ed in tossicologia umana il processo più importante è come venga eliminato lo
xenobiotico dalla struttura biologica e quanto tempo esso persista nell’organismo. Questi due fattori
sono essenziali per valutare la capacità tossica dello xenobiotico tenendo conto di quanto aveva
affermato Paracelo ….dosis facit venenum. Noi aggiungeremmo anche: tempus facit venenum.
Considereremo, quindi, per ora in modo qualitativo, i processi di clearance .
La clearande plasmatica e totale esprime la capacità complessiva dell'organismo di eliminare
irreversibilmente uno xenobiotico ed è data dalle somme delle singole clearances degli organi
(compartimenti) che concorrono all'eliminazione del xenobiotico (ad esempio, nell’uomo: fegato, rene,
polmone e così via). In termini concreti si definisce clearance plasmatica il seguente rapporto:
plasmaticaclearanceplasmaticaioneconcentraz
neeliminaziodivelocità=
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.12
dove per eliminazione si intende la somma di tutti i processi di metabolismo ed escrezione
attraverso i reni, il fegato, i polmoni, le ghiandole salivari, le ghiandole sudoripare, la ripartizione
nell'intestino o nei muscoli.
Per la maggior parte dei xenobiotici, la clearance è costante entro la gamma di concentrazioni
plasmatiche o ematiche che si incontrano in una forma di intossicazione normale. Ciò sta a
significare che l'eliminazione non è un processo saturabile e che la velocità assoluta di eliminazione è essenzialmente funzione lineare della concentrazione plasmatica ossia che una
frazione costante di xenobiotico verrà eliminata nell'unità di tempo.
Quando invece il meccanismo di eliminazione di un dato xenobiotico assume le caratteristiche di
un processo saturabile, una quantità costante di xenobiotico verrà eliminata nell'unità di tempo
indipendentemente dalla concentrazione di xenobiotico che entra nel sistema. In questo caso è da
aspettarsi un’accumulo dello xenobiotico nel compartimento biologico bersaglio.
La velocità di eliminazione di uno xenobiotico da un singolo organo può essere definita tenendo
presente il flusso ematico che entra ed esce da un dato organo e la concentrazione ematica del
xenobiotico.
L'arrivo di un xenobiotico ad un dato organo sarà espresso dal prodotto del flusso ematico per la
concentrazione del xenobiotico nel plasma che giunge all'organo considerato (Q.Ca), ove Ca è la
concentrazione arteriosa. L'uscita di un xenobiotico da un dato organo sarà espressa dal prodotto del
flusso plasmatico per la concentrazione del xenobiotico nel sangue che lascia l'organo considerato
(Q.Cv) dove Cv è la concentrazione venosa. La differenza tra questi due prodotti allo stato stazionario
( condizioni di equilibrio dinamico o di steady-state) esprime la velocità di eliminazione del
xenobiotico.
va CQCQneeliminaziodivelocità .. −=
Dividendo questa equazione per la concentrazione del xenobiotico che entra nell'organo di
eliminazione (Ca) si ottiene un'espressione atta ad indicare la clearance del xenobiotico da parte
dell'organo in questione. Se ad esempio consideriamo la clearance epatica potremo scrivere:
a
va
a
vaepatica C
CCQC
CQCQlearancec −=
−=
..
ove (Ca — Cv)/Ca viene considerato come E cioè rapporto di estrazione del compartimento considerato.
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.13
La biodisponibilità di xenobiotici, ad esempio, che abbiano un elevato grado di estrazione
epatica sarà estremamente sensibile a piccole variazioni nel rapporto di estrazione epatica (E). Più
precisamente, qualunque evento o fattore fisiopatologico capace di indurre piccole variazioni di E per
un xenobiotico ad elevata estrazione epatica potrà provocare drammatiche variazioni di
biodisponibilità.
4.4.1.4.- L’ Emivita (t1/2)
L'emivita è il tempo necessario affinchè la concentrazione plasmatica ad equilibrio di
distribuzione raggiunto, si riduca del 50%. Tale parametro ci da un'idea di quanto a lungo un
xenobiotico permanga nell'organismo e permette di calcolare l'intervallo di dosaggio più opportuno.
L'emivita, t1/2, di maggior interesse in xenobioticocinetica è quella relativa al processo di
eliminazione. Per poter calcolare il t1/2 bisogna conoscere la modalità con cui un xenobiotico si
allontana dal torrente circolatorio.
Nel più semplice dei casi il xenobiotico somministrato diffonde e poi lascia l'organismo come se
questo fosse un unico compartimento di dimensioni corrispondenti al volume di distribuzione (modello
monocompartimentale), ma per molti xenobiotici l'organismo si presenta come un sistema
multicompartimentale. In tal caso il xenobiotico nel primo compartimento, il torrente circolatorio e gli
organi più irrorati, si equilibria rapidamente con il xenobiotico presente negli altri compartimenti, i
tessuti meno irrorati.
Nel modello monocompartimentale la determinazione del t1/2 è relativamente semplice, ma è più
complessa nel secondo caso ove il t1/2 viene calcolato nella parte terminale della retta che esprime la
cinetica di eliminazione del xenobiotico. In termini di farmacocinetica, la clearance plasmatica è forse
il parametro più importante quando si debba formulare un razionale regime di dosaggio. In molti casi
è opportuno mantenere le concentrazioni di steady-state (Css) di un dato xenobiotico entro i limiti
della gamma delle concentrazioni ematiche terapeutiche. Lo steady-state verrà raggiunto quando la
velocità di input (velocità con cui il xenobiotico attivo raggiunge la circolazione sistemica) eguaglia la
velocità di eliminazione dello stesso xenobiotico.
Nell’esempio riportato nella fig.4.3 si può vedere il comportamento di uno xenobiotico che viene
immesso in un circuito di liquidi organici (sangue e plasma) con due compartimenti con la classica
similitudine dei vasi comunicanti.
La cinetica esprimente il variare della concentrazione dello xenobiotico nel beaker è illustrata nei
grafici di destra. Nel primo caso (A) il xenobiotico non fuoriesce dal beaker cosicché la cinetica
concentrazione-tempo riporta solo una rapida salita iniziale seguita dal mantenimento di una fase di
plateau. Nel secondo caso (B) esiste una via d’eliminazione e la cinetica concentrazione-tempo
esprime una lenta fase di caduta dopo il rapido incremento iniziale. Poiché il livello del contenuto nel
beaker scende, anche la pressione che guida il processo di eliminazione decresce, la pendenza della
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.14
curva si attenua avvicinandosi asintomaticamente allo steady-state. Questa è una curva di
decadimento esponenziale. Nel terzo caso (C), lo xenobiotico immesso nel primo compartimento
(sangue e tessuti più riccamente vascolarizzati) si equilibria rapidamente con un secondo
compartimento (tessuti extravascolari meno riccamente vascolarizzati) e la quantità di xenobiotico
presente nel primo compartimento declina logaritmicamente fino a raggiungere un nuovo steady-
state. Il quarto caso (D) illustra una più realistica combinazione di meccanismo di eliminazione e di
equilibrio con i compartimenti meno riccamente vascolarizzati. Il grafico riporta, dopo l'iniziale salita
della concentrazione ematica, una rapida e precoce fase di distribuzione seguita da una più lenta
fase d’eliminazione.
Fig.4.3 Effetto di una rapida entrata endovenosa di uno xenobiotico.
L'emivita è un parametro utile nell'indicare:
1. il tempo necessario a raggiungere lo steady-state (è necessario un tempo
corrispondente a circa 4 emivite per raggiungere nel sangue una concentrazione
di xenobiotico corrispondente a circa il 90% della concentrazione allo steady-
_______________________________________________________________
G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.15
state),
2. il tempo necessario affinché il xenobiotico venga rimosso dall'organismo.
Bisogna però ricordare che l'età, gli stress e le interazioni con altri xenobiotici possono
modificare la clearance plasmatica e/o il volume di distribuzione di un xenobiotico e il
conseguente valore di emivita.
Dal punto di vista tossicologico si può prevedere che uno xenobiotico esplichi la sua
massima attività tossica in corrispondenza del raggiungimento della concentrazione
plasmatica allo steady-state.
Minore l'emivita di eliminazione di un xenobiotico, più rapido il raggiungimento della
concentrazione plasmatica allo steady-state (Css). Così ad esempio un xenobiotico con una
vita media di otto ore, raggiungerà il 90% della concentrazione allo steady-state in trentadue
ore. Tuttavia, più corta l'emivita maggiori le oscillazioni delle concentrazioni plasmatiche tra
un input (contaminazione) e l'altro a parità di intervallo di intossicazione. Un xenobiotico con
un'emivita media di 2-3 ore, mostrerà variazioni di concentrazione plasmatica molto marcata
tra un input ed un altro se questi si verificano ogni sei ore.
Fig.-4.4 Decadimento monoesponenziale della concentrazione plasmatica di un xenobiotico (input
unico e.v. iniezione rapida, ad es. 500 mg) che conferisce all'organismo le caratteristiche cinetiche di un sistema monocompartimentale.
Nell’esempio di fig.4.4, le concentrazioni plasmatiche vengono determinate a partire dalla
seconda ora dalla somministrazione ed espresse in scala semilogaritmica. La linea
tratteggiata rappresenta l'estrapolazione alle ordinate (intersezione = Cp0 = concentrazione
plasmatica al tempo zero) della retta che congiunge le concentrazioni plasmatiche osservate
sperimentalmente. L'emivita biologica, leggibile direttamente dal grafico, è di quattro ore e
_______________________________________________________________
G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.16
corrisponde al tempo necessario affinchè la concentrazione ematica C4 si dimezzi a C2. Da
questo grafico si può calcolare il volume di distribuzione (Vdj = dose/Cp0). Calcolando per Cp
quella rilevata sull'asse delle ordinate al tempo 0 (Cp = 16 ug ml-1), il volume di distribuzione
corrisponderà a 31.3 L o 0.45 L Kg-1.
Fig.4.5 Decadimento esponenziale della concentrazione plasmatica di un xenobiotico (dose unica input rapido,) che conferisce all'organismo le caratteristiche cinetiche di un sistema a bicompartimentale. Le concentrazioni plasmatiche vengono espresse in scala semilogaritmica. La linea curva iniziale rappresenta la fase di distribuzione (fase a) durante la quale il xenobiotico si distribuisce ai tessuti meno irrorati. La parte lineare della curva (fase beta) rappresenta l'eliminazione del xenobiotico. Il t1/2 di eliminazione (12 h) può essere calcolato in due modi: o direttamente dal grafico calcolando il tempo necessario affinché la concentrazione ematica C1 si dimezzi a C2 o dal rapporto t1/2 = 0.693/beta dove beta è il coefficiente angolare del segmento lineare terminale.
b) Se l'emivita di eliminazione si prolunga al di sopra del suo valore normale, in strutture
biologiche particolarmente stressate, il tempo necessario per raggiungere lo steady-state sarà più
lungo e le concentrazioni raggiunte saranno considerevolmente più elevate del normale con una
accentuazione dei fenomeni tossici che possono portare anche alla morte dell’individuo.
4.4.1.4.- Uptake ripetuti
Il problema della valutazione delle concentrazioni tossiche in una struttura biologica si complica
quando lo xenobiotico entra nell’organismo per il tramite di uptake multiplo. In questo caso la
concentrazione dello xenobiotico oscilla nel plasma tra valori massimi e minimi e a periodi di attività
tossica dello xenobiotico possono seguire periodi di inattività; quindi solo con il raggiungimento delle
concentrazioni plasmatiche più elevate compaiono segni e sintomi di tossicità. Se la frequenza di
uptake é più frazionata nel tempo, le oscillazioni sono meno marcate.
_______________________________________________________________
G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.17
Fig.4.6 - Correlazione tra frequenza di uptake e concentrazioni plasmatiche massime e minime
4.4.2.0.- Biodisponibilità degli xenobiotici
Vediamo ora quale è il significato del termine biodisponibilità e come misure di
biodisponibilità possono servire a valutare le modalità caratteristiche di assorbimento dei
composti chimici xenobiotici.
La biodisponibilità misura la velocità ed il grado in cui un xenobiotico raggiunge immodificato la circolazione sistemica; essa è quindi la misura qualitativa e quantitativa
del passaggio di un xenobiotico, somministrato in una forma adeguata, dalla sede di uptake
extra-vasale al circolo sistemico.
Gli effetti sistemici degli xenobiotici dipendono anche dal punto di entrata (uptake) nella
circolazione sistemica. Differenti vie di uptake, infatti, possono produrre differenti
assorbimenti dello stesso xenobiotico. È così possibile che due miscele di uno stesso
xenobiotico, pur contenendo lo stesso principio attivo, abbiano diversa biodisponibilità a
causa della diversa via di somministrazione (uptake)
4.4.2.1.- La biodisponibilità relativa ed assoluta
Quanto discusso finora riguarda essenzialmente quell'aspetto della biodisponibilità che
concerne il confronto tra diversi composti xenobiotici in termini di entità e velocità di
passaggio del composto in forma non modificata dalla sede di somministrazione al circolo
sistemico. In altre parole si tratta di valutare la biodisponibilità relativa di mettere cioè a
confronto le caratteristiche di assorbimento tra due o più xenobiotici assunti dall’organismo.
La biodisponibilità relativa si determina confrontando i parametri ricavabili dalle cinetiche
delle concentrazioni ematiche o plasmatiche o sieriche nel tempo, ottenute dopo
somministrazione dello xenobiotico in esame per una stessa via extravasale.
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.18
La biodisponibilità assoluta permette di valutare la quantità assoluta di xenobiotico che
raggiunge immodificato il circolo sistemico. La biodisponibilità assoluta si ottiene confrontando le aree
sottese alle curve di concentrazione-tempo ottenute somministrando la stessa dose di xenobiotico per
via endovenosa, con quelle di forme idonee alla via extravascolare.
Tale confronto suggerisce la natura e l'importanza di fattori capaci di influenzare l'assorbimento di
un dato xenobiotico in un dato individuo per la via extravascolare scelta. Se questa è ad esempio la via
orale, processi di biotrasformazione ad opera della flora batterica intestinale e degli enzimi della
parete intestinale e soprattutto del fegato (eliminazione presistemica o effetto di primo passaggio)
possono concorrere a ridurre la biodisponibilità dello xenobiotico somministrato.
Per gli xenobiotici che presentano un intenso effetto di primo passaggio con produzione di
metaboliti ancora attivi, la valutazione della biodisponibilità assoluta pone il problema della valutazione
non solamente del xenobiotico immodificato, ma anche di tutti i metaboliti che raggiungono il circolo
generale. Verranno allora valutate le aree sottese alle curve di concentrazione ematica-tempo sia del
xenobiotico progenitore, sia di tutti i suoi prodotti di biotrasformazione e questo dopo somministrazione
endovenosa ed extravasale dello xenobiotico. Il confronto delle aree ottenute per le due vie di
somministrazione permetterà così di distinguere tra assorbimento incompleto e presenza
dell'eliminazione presistemica, e di valutare inoltre l'entità di questa ultima.
4.4.2.2.-La bioequivalenza La bioequivalenza si riferisce a due o più forme diverse dello stesso xenobiotico (miscele dello
xenobiotico con altri componenti), che offrono analoghe caratteristiche di biodisponibilità in uno
stesso individuo quando somministrate per una stessa via con regimi di uptake equivalenti. Tali miscele
vengono dette bioequivalenti poiché hanno analogia di assorbimento, cosicché daranno luogo a
concentrazioni ematiche corrispondenti nel tempo. Tali miscele si possono anche definire
tossicologicamente equivalenti, poiché in uno stesso individuo avranno essenzialmente la stessa
efficacia tossica.
È però importante ricordare che due o più miscele che contengano eguali quantità di uno stesso
principio attivo xenobiotico in identica concentrazione e che abbiano un diverso contenuto di ingredienti
inerti o inattivi, possono avere diversa biodisponibilità, e, quindi, non equivalersi dal punto di vista
tossicologico. Determinando i livelli ematici di uno xenobiotico, assorbito in forme diverse, è possibile ottenere
una misura indiretta della risposta tossicologica partendo dall’ipotesi che miscele ambientali diverse di
uno stesso xenobiotico, qualora portino a concentrazioni ematiche corrispondenti, sovrapponibili nel
tempo, inducano risposte tossicologiche equivalenti.
Il confronto tra risultati aspettati da tale ipotesi e risultati obbiettivi sperimentali ci dà informazioni
sulla reale bioequivalenza o sulla inequivalenza delle forme xenobiotiche in esame e ci da un'idea di
come, a parità di dosaggio diversi fattori possano concorrere a influenzare la velocità ed il grado di
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.19
assorbimento. Questi fattori possono essere inerenti alla forma chimica stessa (ad esempio la
speciazione).
4.4.1.5.- Determinazione della bioequivalenza (o inequivalenza)
Immaginiamo di somministrare uno xenobiotico, per via extravascolare, ad esempio per via orale, e
di procedere poi, ad opportuni intervalli di tempo, al prelievo di campioni ematici e alla determinazione
della concentrazione del xenobiotico nel sangue o nel siero o nel plasma, concentrazione che verrà poi
trascritta in un sistema di coordinate cartesiane sull'asse delle ascisse mentre sull'asse delle ordinate
verranno indicati i tempi di prelievo a partire dal momento della somministrazione (t = 0).
Otterremo così la cinetica delle concentrazioni ematiche o plasmatiche o seriche, otterremo cioè
una curva esprimente le variazioni della concentrazione ematica o plasmatica o sierica nel tempo. Al
tempo t=0 la concentrazione ematica del xenobiotico sarà nulla. Quando il xenobiotico entra nel sangue
inizia l'assorbimento. Nel sangue si riscontreranno concentrazioni progressivamente crescenti fino al
raggiungimento della concentrazione più elevata che viene chiamata picco delle concentrazioni ematiche nel tempo.
Fig.4.7 - Profilo concentrazione-tempo di un xenobiotico nel sangue e azione farmacologica dopo una dose singola
somministrata per una via extravascolare.
La figura illustra i rapporti tra i livelli ematici di un xenobiotico e l'effetto tossicologico atteso.
Generalmente si ritiene che il xenobiotico debba raggiungere una certa concentrazione ematica prima
che si possa osservare la comparsa dell'effetto.
Questa viene chiamata concentrazione minima attiva (CMA) superata la quale, ulteriori
incrementi nella concentrazione ematica si tradurranno in una intensificazione dell'effetto desiderato.
Esiste però una concentrazione ematica minima tossica (CMT) oltre la quale potranno comparire i
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.20
primi segni di tossicità. L'intervallo tra la concentrazione minima attiva in senso farmacologico e quella
attiva in senso tossicologico rappresenta la gamma delle concentrazioni attive.
L'intervallo di tempo che intercorre tra l’uptake dello xenobiotico e la comparsa dell'effetto
farmacologico è detto tempo di latenza e la sua durata dipende dalla velocità di assorbimento. In
generale differenze tra le concentrazioni minime attive e la concentrazione massima raggiunta sono
una misura relativa all'intensità dell'effetto ottenibile.
La durata dell'azione di un xenobiotico corrisponde all'intervallo di tempo entro cui le concentrazioni
ematiche si mantengono al di sopra della dose minima attiva. Tutti i parametri indicati dipendono dalle
complesse interazioni tra assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione di un dato
xenobiotico.
Differenze in tali parametri si traducono in differenze nella cinetica esprimente il variare delle
concentrazioni ematiche nel tempo e cioè in differenze nel tempo di comparsa, nell'intensità e nella
durata dell'attività terapeutica e/o tossicologica di uno xenobiotico nell'uomo.
Una volta raggiunto il picco le concentrazioni declineranno, più o meno rapidamente, a seconda
dello xenobiotico considerato, fino al raggiungimento del valore zero. I processi che influenzano
l'andamento della curva sono l'assorbimento, che prevale nella parte ascendente della curva, ma che
continua per qualche tempo anche dopo raggiunta la concentrazione di picco e l'eliminazione, che
inizia non appena il xenobiotico compare nel sangue e continua fino a completa scomparsa di questo
dal torrente circolatorio.
L'altezza del picco di una curva, (Cmax), ovviamente rappresenta la più alta concentrazione ematica
raggiunta dopo somministrazione di un dato xenobiotico. Essa varia in funzione della dose di
xenobiotico somministrato ed in funzione della velocità di assorbimento. Maggiore la velocità, più
elevato il picco ematico raggiunto.
_______________________________________________________________ G.PERIN – AMBIENTE E SALUTE - 12/11/2004- ERGOCINETICHE – pg.21
Fig.4.8- Profili concentrazione-tempo di una identica dose dello stesso xenobiotico somministrato in due forme diverse in uno stesso individuo.
L’applicazione pratica del metodo per la valutazione dell’equivalenza è riportato nella figura 4.8.
Come si può rilevare in corrispondenza degli uptake, per una stessa via, di due forme diverse ma con
la stessa dose di uno stesso xenobiotico: (dose A e dose B) si riscontrano due curve rappresentanti
processi cinetici diversi. (Il risultato sarebbe analogo se utilizzassimo la stessa forma dello xenobiotico
con percosri di uptake differenti.)
Si nota che la forma A esplica una azione quasi immediata con valori di attività alti mentre la forma
B raggiungerà molto più tardi un livello di azione abbastanza elevato. Peraltro la forma B avrà un
persistenza maggiore di quella A e, quindi, sottoporrà la cellula bersaglio ad una azione
maggiormente prolungata nel tempo rispetto alla forma B.
Il tempo di picco (tmax) esprime il tempo necessario a raggiungere la massima concentrazione
ematica, sierica o plasmatica (la concentrazione di picco). Questo parametro è strettamente correlato
alla velocità di assorbimento di uno xenobiotico da un dato preparato e viene usato come semplice
misura della velocità di assorbimento. Come la velocità di assorbimento diminuisce, anche il tempo per
il raggiungimento del picco diminuisce. In definitiva, la velocità di assorbimento influenza sia il valore di
picco che il tempo di picco, ma solo quest’ultimo è indipendente dalla dose somministrata, cosicché
solo il tempo di picco può essere usato per confrontare la velocità di assorbimento di sue forme diverse
di uno stesso xenobiotico.
Dall’esame della figura 4.8 si può, pertanto, concludere che le due forme/vie di uptake dello
xenobiotico sono diverse in quanto biodisponibilità e, quindi, i due sistemi sono inequivalenti.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.22
4.4.0.0.- Aspetti quantitativi
4.4.1.0.- Il fattore di bioconcentrazione e di bioaccumulo 4.4.1.1.- Il fattore di bioconcentrazione (BCF)
Il parametro che dà un’indicazione importante dell'andamento del processo di assunzione é il
BCF o fattore di bioconcentrazione.
Il BCF é il rapporto tra la concentrazione media dello xenobiotico (o di un qualsiasi composti
chimico ripartibile) nel tessuto dell'organismo esaminato in condizioni di stato stazionario e la
corrispondente concentrazione dello stesso tossico nell'acqua alla quale viene esposto
l'organismo.
BCF =Corganismo
Cacqua
=CCw
Il BCF é di norma correlato con il contenuto in grasso dell'organismo, e quindi varia entro e
fra le specie acquatiche in funzione del contenuto in grassi. Nel pesce, ad esempio il grasso può
variare da 2 a 15 %.
Se un composto ha un valore di BCF superiore a 1000 allora é necessario proseguire nelle
ricerche in merito al rischio tossicologico che il prodotto può porre. Composti come il DDT,PCB e
dieldrina hanno valori di BCF di gran lunga superiori a 1000. I valori di BCF possono ancora
variare considerevolmente (da uno a due ordini di grandezza) fra le specie ed il periodo di vita,
probabilmente per la diversa velocità delle reazioni di disintossicazione che sono, normalmente,
minori a livello dei primi stadi di vita.
Quindi un valore di BCF non deve essere utilizzato in assoluto quando il sistema biologico
varia nel tempo come caratteristiche dimensionali dell'individuo e come età. Ciò non ostante si
può dire con buona certezza che un composto che abbia un BCF di 100 o meno non presenta
problemi di concentrazione ambientale e, quindi, di tossicologia ambientale.
Contrariamente a ciò che succede per gli animali acquatici per gli animali terrestri il contatto
più importante é quello della dieta. I valori di BCF nel tessuto grasso, valutati per 23 prodotti
chimici di interesse ambientale, si sono riscontrati più piccoli con fattori da tre a quattro ordini di
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.23
grandezza rispetto al pesce anche se tra le specie si riscontra una buona correlazione ciò che
consente di ottenere dati per una specie acquatica attraverso una regressione dei dati per una
specie terrestre.
Un modo per predire la distribuzione dei composti chimici nell'ambiente si può ottenere
combinando le costanti Kow,Koc e la solubilità del prodotto in acqua (S o concentrazione massima
corrispondente alla saturazione) come riportato nelle relazioni che seguono.
BOX 4.1
Correlazione Eq.Regressione Coeff. Correlazione r ______________________________________________________________
S/BCF log S = 2,531-0,916 log BCF -0,72
Koc/BCF log Koc = 1,963+0,661 log BCF +0,67
BCF/S log BCF= 2,791-0,564 log S -0,72
BCF/Koc log BCF= -1,579+1,119 log Koc +0,67
S/Koc log S = 5,09-1,26 log Koc -0,64
Koc/ S log Koc= 3,64-0,55 log S -0,64
Come si può notare le prime quattro relazione includono direttamente il BCF mentre le
altre due consentono di calcolare parametri d'uso nelle prime quattro da altri fattori. Sul modo di
calcolo del BCF torneremo più avanti attraverso l'esame dei modelli d’assunzione di tossici in
modo monocompartimentale e bicompartimentale.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.24
4.4.2.0.- Modelli compartimentali
Gli obbiettivi principali dello studio chemio-bio-cinetico sono quelli di determinare la quantità,
la velocità e la natura dei processi di assorbimento, distribuzione, metabolismo, ed escrezione di
un composto chimico in una struttura animale.
Una premessa necessaria é che, poiché il fine delle ricerche della ecotossicologia e della che
chemio-bio-cinetica é quello di fare valutazioni previsionali del comportamento del composto
chimico nei confronti dell’essere umano, il soggetto animale da usarsi per le valutazioni chemo-
bio-cinetiche andrà cercato in un animale dal comportamento uguale o molto simile all’uomo.
Ma é difficile individuare, senza dati precedente, una specie animale che metabolizzi un
composto xenobiotico in modo simile all’uomo.
Di solito gli studi iniziali si fanno nel ratto o nel cane o nella scimmia, nel tentativo di
determinare la variabilità della specie. Se ci sono differenze significative fra specie, è importante
determinare se le differenze nei parametri dei processi chemo-bio-cinetici si correlino con le
differenze nella tossicità o nell’attività farmacologica.
Come abbiamo già detto, la chemo-bio-cinetica mira a quantificare i processi già discussi
precedentemente. Così, la chemo-bio-cinetica fornisce informazioni quantitativi sull'assorbimento,
distribuzione, biotransformazione, escrezione di composti chimici xenobiotici, (medicine e
sostanze endogene incluse), in funzione del tempo.
Una difficoltà di molti tossicologhi e biologhi relativamente alla chemo-bio-cinetica è il
concetto di compartimenti.
Un corpo è composto da un gran numero di organi, tessuti, cellule e fluidi, ed ad ognuno di
essi può essere definito, morfologicamente e funzionalmente, come un compartimento.
Comunque, in chemo-bio-cinetica, un compartimento si riferisce al complesso di quegli
organi, tessuti, celle, e fluidi per quale le velocità di uptake e di rimozione susseguente di un
composto chimico sono sufficientemente simili da escludere una differenziazione cinetica.
Il compartimento che si equilibria rapidamente viene considerato come il compartimento
centrale, e può comprendere tutti quei tessuti dove il sangue é presente in rapida perfusione
mentre i cosiddetti compartimenti lenti o periferici includono tessuti con una più lenta perfusione
di sangue (ad esempio: il grasso e le ossa).
4.4.2.1.- Modello monocompartimentale aperto
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.25
L'assunzione e il rilascio di un composto chimico dal tessuto animale possono essere
considerati come parte di un processo omogeneo in un organismo che si comporti come un
singolo compartimento, nel quale l'assunzione del tossico si verifica solo attraverso l'acqua ed é
direttamente proporzionale alla concentrazione nell'acqua del tossico stesso.
Inoltre tutte le molecole del tossico sono egualmente disponibili ad essere eliminate.
Ancora in questo caso, si assume che il processo di clearance o eliminazione sia una cinetica
del primo ordine e che, quindi, l'eliminazione del tossico sia direttamente proporzionale alla
concentrazione del tossico stesso nell'animale.
Infine va assunto che la dimensione ed il volume del compartimento non vari durante il
periodo in cui si effettua lo studio senza che vi siano, quindi, fenomeni di accrescimento
nell'animale. Il modello chemo-bio-cinetico più semplice è quello del modello aperto
monocompartimentale.
Fig. 4.9 Schema di modello mono-comportamentale con ka e
ke le costanti di assunzione e di clearance, rispettivamente.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.26
Usando questo modello, si presume che il composto chimico xenobiotico si equilibri con tutti
tessuti nei quali è distribuito in modo sufficientemente rapido da impedire differenziazioni
cinetiche.
Ad esempio se sono richiesti 30 minuti per raggiungere l’equilibrio nel corpo dopo l’entrata
dello xenobiotico nello stream sanguigno, analisi di sangue, tessuti ed excreti fatte a 30 minuti di
intervallo mostreranno che non vi é differenza di concentrazioni tra le varie fasi e, quindi, che
tutto l’assieme (corpo) rappresenta un solo compartimento.
In sostanza il modello prevede un’entrata di un composto xenobiotico nel substrato biologico
che, fino ad una certa concentrazione Ct, non mette in atto meccanismi di difesa in quanto la
cellula o la struttura biologica, in generale, non riconosce in tale concentrazione un rischio per la
sua propria sopravvivenza.
Oltre ad un certo valore soglia (threshold) si innescano meccanismi di allarme di tipo
biochimico che portano a processi di difesa.
Essi possono essere processi di inglobamento e/o precipitazione dl tossico sotto forma di
strutture chimiche inerti (es.: precipitazione dei granuli di metallo elementare in siti para-cellulari,
formazione di metallotioneine ecc.) o veri e propri processi metabolici di aggressione dei siti più
reattivi della molecola dello xenobiotico.
In tal caso, di solito, avviene una prima azione di ossidazione ed idrolisi che porta ad una
struttura chimica più facilmente metabolizzabile ed eliminabile come composto in grado, poi, di
essere escreta ed eliminata dalla struttura bersaglio.
Mentre, quindi, il processo di assunzione inizia immediatamente una volta che il substrato
biologico viene ad essere messo a contatto con lo xenobiotico in fase liquida e/o gassosa, quello
di clearance o release o di eliminazione entra in funzione solo e soltanto dopo un certo tempo
che é funzione del tipo di substrato biologico, del tipo di composto chimico e della pre-esistenza o
meno, nel substrato biologico stesso, di una certa quantità del composto.
Infatti, come é ben noto, il flusso di composto, ad esempio, attraverso una membrana
cellulare é determinato dal gradiente di concentrazione interno/esterno della membrana cellulare
che esprime, anche, la fugacità od il potenziale chimico del composto nella fase esterna e nella
fase interna della cellula, rispettivamente.
Al tempo t = 0, il composto xenobiotico si trova solo all’esterno della struttura e, quindi, in
funzione della legge di Fick, la sua velocità di passaggio (e quindi il flusso) é massimo. Man
mano che la differenza di concentrazione interno/esterno tende a zero, in funzione delle forze di
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.27
resistenza (Di) il flusso si riduce fino a portarsi anch’esso a zero. Ma oltre ad una certa
concentrazione inizia il processo di eliminazione per cui, se la sorgente di contaminazione
permane, si avrà un processo costante di assunzione e di clearance (stato stazionario o di
equilibrio dinamico con ∆G=0)
Se ogni organismo si comporta come un solo compartimento la cinetica di
bioconcentrazione di un tossico nel tessuto di un animale (nel caso il pesce) é la combinazione
tra i processi di assunzione, regolati dalla costante ka, e quelli di clearance regolati dalla ke. La
relazione generale della cinetica é quindi:
CkCkperditeassunzionedtdC
ewa −=−=
con
Cw = la concentrazione del composto chimico in acqua (mg L-1)
C = la concentrazione del composto chimico nell'animale
t = il tempo (in ore)
ka = la costante di assunzione (in ml g-1 h-1)
ke = la costante di clearance (in h-1)
In condizioni di stato stazionario le due velocità, di assunzione e di eliminazione, si
equivalgono e, pertanto:
ssewa CkCkdtdC
−== 0
dove con Css si indica la concentrazione del tossico nel tessuto del pesce allo stato
stazionario.
risolvendo per Css si ha:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.28
e
wasswasse k
CkCCkCk ==
Il valore di BCF in condizioni di stato stazionario può essere dato da:
e
a
w
ss
kk
CCBCF ==
Riferendoci alla quantità di tossico assunto per unità di tempo, dalla relazione principale e
integrata si ottiene:
( )[ ]tkexp1CkkC ew
e
a −−=
ovvero
( )[ ]tkexp1CC ess −−=
Come si può notare per la definizione di fattori di bioconcentrazione é indispensabile
conoscere i valori di ka e ke. Ciò può essere fatto sperimentalmente ovvero calcolato dai dati
fisiologici dell'animale da esperimento e dalla caratteristiche chimiche e chimico-fisiche del
composto. In questo secondo caso, due sono gli approcci fondamentali: quello
monocompartimentale e quello a due compartimenti.
Nel primo caso i tessuti dell'animale sono considerati come un unico pool in cui il tossico si
distribuisce in maniera omogenea; nel secondo caso, invece, i tessuti si comportano almeno con
due velocità di assorbimento diverse.
Come si può intuire, ai fini tossicologici ed ecotossicologici, il processo più importante é,
certamente quello di clearance e/o di eliminazione. é, quindi, opportuno esaminare con maggior
dettaglio questo processo iniziando dal sistema aperto mono-compartimentale.
Assumendo che la velocità d’eliminazione del composto chimico sia proporzionale alla sua
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.29
concentrazione nel plasma, detta concentrazione può essere descritta da una cinetica apparente
del primo ordine ed espressa nella forma di una equazione lineare differenziale:
tet Ck
dtdC
−=
dove C(t) è la concentrazione a tempo t, e ke, è la costante cinetica eliminazione. Soluzione
di questa equazione differenziale con le condizioni iniziali Ct = C0 al tempo zero danno le seguenti
forme esponenziale e logaritmiche:
)tkexp(CC e0t −=
e logaritmica
0et lnCtklnC +−=
0e
t lnCtklogC +−
=3032,
In queste equazioni C0 è la concentrazione del composto chimico nel plasma al tempo zero.
Plottando Ct contro il tempo su carta semilogaritmica si otterrà una linea diritta con slope - ke ed
intercetta C0.
Calcolato ke, che é espresso in unità di tempo reciproco, il tempo richiesto per ridurre la
concentrazione dello xenobiotico nel compartimento alla metà può essere calcolato; questo
tempo è definito come t1/ 2 o tempo di semi-vita e può essere calcolato dall’equazione:
ekekt 693,02ln
2/1 ==
Quando il composto chimico non è assorbito instantaneamente le espressioni matematiche
necessarie per descrivere la concentrazione nel plasma in funzione del tempo, divengono più
complicate. Assumendo che le cinetiche d’assorbimento e di eliminazione siano ambedue del
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.30
primo ordine, la concentrazione C(t) nel plasma è data dall'espressione:
( ) ( ) ( )tkexptkexpkkV
kf.DC(t) aeead
a0 −−−−
=
In questa espressione i termini che non sono stati finora menzionati sono D0 = la dose; f = la
frazione di dose assorbita; Vd, il volume apparente di distribuzione; e k1 = la costante cinetica
apparente di primo l'apparente ordine di assorbimento (uptake).
La costante d’eliminazione (clearance), k, viene determinata usando quello porzione della
linea solida che rappresenta la concentrazione del plasma dopo che l’assorbimento è completo.
In Fig.4.5 ciò si verifica quando la linea tratteggiata si fonde nella linea solida.
La costante della cinetica d’assorbimento, k1 può essere valutata proiettando la linea solida
all’indietro fino all'origine. Lo stesso diagramma può essere usato per il calcolo del t1/ 2 per il
processo di assorbimento e di ka.
Il volume di distribuzione, Vd, è un termine che descrive il volume apparente nel quale un
composto chimico è distribuito quando si possa ritenere che l’affinità del plasma e di tutti i tessuti
per quello specifico composto sia la stessa.
Un'analogia potrebbe essere quella di porre una nota quantità di colorante in un liquido
contenuto in un volume sconosciuto. All’equilibrio (e cioé quando il colorante si é distribuito
omogeneamente in tutta il volume), il volume del sistema (Vd) può essere ottenuto dividendo la
dose (D0) per la concentrazione unitaria.
Nel plasma la concentrazione dei composti chimici si riduce a causa del processo di
eliminazione (clearance) e della distribuzione nei tessuti. Perciò per valutare Vd è necessario
proiettare il tratto di curva corrispondente al processo di eliminazione fino all’origine. Il valore
ottenuto dall’intercetta al tempo zero da questa proiezione, diviso da D0 dà il volume di
distribuzione, Vd, in ml kg-1.
Il valore di Vd fornisce alcuni informazioni importanti sulla distribuzione del composto
xenobiotico nel corpo. Con l’aumento della distribuzione dello xenobiotico nei tessuti, per
qualunque motivo, (affinità chimico-fisica, attivo trasporto attivo nelle cellule ecc.), anche Vd
aumenta.
Se la distribuzione di un chimico nel corpo umano si limita al plasma, al fluido extracellulare
od al liquido corporeo totale, i valori rispettivi di Vd sono circa 40, 170, e 560 ml kg-1. Se uno
xenobiotico ha un'alta affinità per un tessuto particolare, per esempio, l'affinità di un lipofilo per il
grasso, Vd può eccedere in modo significativo i 1000 ml kg-1.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.31
Fino a ora si sono presi in considerazione solo i concetti relativi alla concentrazione dello
xenobiotico nel plasma. Ma questi concetti sono ugualmente applicabili ad altri tessuti come pure
agli escreti, all’aria ed ai gas emessi dal corpo, oppure ai liquidi e/o solidi come l’orina e le feci.
In aggiunta alla concentrazione, gli stessi concetti possono essere applicati se si desidera
calcolare la quantità totale di uno xenobiotico nel corpo, A(t), in funzione del tempo di
esposizione. Per esempio se una dose D0 è ingerita e si assume che il processo sia una cinetica
apparente del primo ordine, la quantità dello xenobiotico nel corpo é espresso da:
( )tkexpDA(t) e0 −=
che é equivalente a: Ct = C0 exp (-ket)
Una certa quantità (dose singola) di un composto xenobiotico entra in un compartimento
attraverso il fluido che bagna il compartimento stesso (esempio: il plasma). Ad un certo punto
inizia il processo d’eliminazione (clearance) controllato dalla costante di eliminazione Ke. A
seguito del processo di clearance, la concentrazione nel plasma diminuisce secondo un retta il
cui esempio è riportato nella figura seguente:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.32
Fig.4.10
Il valore della concentrazione iniziale viene valutato per estrapolazione dei dati di analisi del
plasma che si ottengono analizzando a tempi successivi il plasma stesso. La scala delle
concentrazioni viene posta logaritmica e l’inclinazione della retta fornisce il valore di –ke. Data la
seguente tabella di valori sperimentali della concentrazione dello xenobiotico, calcolare il valore
della concentrazione iniziale sia graficamente che numericamente sapendo che:
tkeeCC −= 0
e, quindi, che:
tkCC e−=− 0lnln
e
303,2loglog 0
tkCC e−=−
Calcolare, infine, il tempo di dimezzamento dello xenobiotico nel plasma, ricordando che:
ekt 2ln
2/1 =
Il processo di bioaccumulo in un “compartimento biologico” è descritto dall’espressione:
CkCkdtdC
eaa −=
ove C è la concentrazione internamente al compartimento e Ca quella nel sito di
assorbimento esterno al compartimento.
La curva sottostante riproduce l’andamento del processo di bioconcentrazione in un sistema
monocompartimentale per l’aggiunta di uno xenobiotico in una sola singola dose.. La prima parte
della curva espressa dai valori di concentrazione (pallini neri) rappresenta il progressivo
accumulo dello xenobiotico; come si nota la curva inizia con una rapida pendenza (fase
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.33
logaritmica) cui segue un flesso nel momento in cui entrano in funzione i sistemi di difesa da
parte della cellula (compartimento) che viene avvisata dai suoi sensori (di energia?) che un
composto anomalo rispetto alla sua struttura biochimica, si sta accumulando nel compartimento
con potenziale azione ostile alla stessa sopravvivenza della cellula. Inizia, quindi, il processo di
detossificazione.
Tale processo, chiamato di clearance o di eliminazione, è in realtà un processo (o più
processi) metabolico che annulla, attraverso modifiche della struttura molecolare, la capacità
tossica dello xenobiotico. Il metabolismo può inserire nella molecola dello xenobiotico gruppi –
OH, rendendo il composto stesso più solubile ed eliminabile nei liquidi organici; può complessate
lo xenobiotico con formazione di composti stabili e non tossici (es.: le Metallotioneine per i metalli
tossici), può bloccarlo sotto forma di composto inerte in situ (ossia internamente al
compartimento stesso (come è il caso dei granuli di metalli pesanti).
In ogni caso il processo di clearance si oppone a quello d’accumulo ed é controllato da una
costante d’eliminazione ke. Dalla relazione sovra scritta, quindi, si capisce come il processo di
bioaccumulo sia direttamente proporzionale alla concentrazione dello xenobiotico nel mezzo in
cui si trova il compartimento e proporzionale in senso negativo alla concentrazione che lo
xenobiotico ha raggiunto nel compartimento.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.34
Fig.4.11 Diagramma di concentrazione dello xenobiotico contro il tempo (ore)
La curva d’eliminazione è rappresentata dai pallini neri dopo che si è raggiunto il sommo
della curva stessa (parte a destra della curva). La sua inclinazione rappresenta la velocità di
depurazione del compartimento e, come si vede, la ke è data dall’inclinazione stessa moltiplicata
per 2,304. ed è, quindi, facile da calcolare.
Infatti:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.35
dalle:
tkeeCC −= 0
tkCC e−=− 0lnln
303,2loglog 0
tkCC e−=−
si ricava che
303,2loglog
12
12 ektt
CC−=
−−
Ricavata la ke è importante calcolare la ka (costante di uptake o di assorbimento).
Quest’ultima si calcola con il cosiddetto metodo dei residui. La formula da applicare è analoga a
quella riportata in (b) ma inserendo i valori della nuova retta (pallini chiari – (c)), costruita con i
valori delle differenze tra le concentrazioni nel compartimento riportate sulla linea estrapolata
[valori fino a circa 16 ore nel diagramma riportato come esempio - Fig.4.5(c) – retta tratto x ] ed i
valori delle concentrazioni nel compartimento nella curva a sinistra – tratto y.
La formula, quindi, diventa:
303,2loglog
12
12 aktt
CC−=
−−
Nel diagramma d’esempio si può notare come la cinetica d’assorbimento (uptake) è maggiore
di quella della clearance come mostrano le diverse inclinazioni delle due rette. Questo fenomeno
è generale e solo in pochi casi il processo di clearance è più rapido di quello di uptake (alcuni
composto polari).
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.36
Fig.4.12
La concentrazione massima nel compartimento (Cmax) ed il tempo che serve per raggiungere
la concentrazione massima possono essere calcolati dalle:
1ea
e
amax )k(k
kklnt −−=
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.37
)e(e)k(kV
DFkkk
VDFC maxamaxe
1eae
tktk
eaD
a
)k(kk
a
e
Dmax
−−
−
−−
=⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛=
−
ove D è la dose istantanea, F è la frazione dello xenobiotico che entra nel compartimento non
modificata (e quindi dà una indicazione sulla bio-disponibilità del composto: per F=0, nessuna
bio-disponibilità; per F=1, totale disponibilità) e VD è il volume apparente di distribuzione,.
Fig.4.13 Esempi di risposta cinetica di animali diversi (compreso l’uomo) ad uno stesso xenobiotico.
Dai grafici della fig.4.13 si possono notare tre cinetiche di assunzione (diffusione) di uno
stesso xenobiotico nelle stesse dosi inziali introdotte e tre diverse successive rette rappresentanti
le cinetiche del I° ordine di clearance dello xenobiotico assunto. L’uomo assume con estrema
rapidità lo xenobiotico raggiungendo valori nel plasma superiori a quelli degli altri due animali di
confronto. La cinetica di clearance nell’uomo è abbastanza rapida ma, fino a 48 ore
dall’intossicazione si mantiene su valori superiori a quelli degli altri animali osservati. Al tempo
t=48 l’uomo, che aveva nel plasma una concentrazione più elevata del cane, inverte la
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.38
concentrazione e metabolizza lo xenobiotico più rapidamente dell’animale.
Il ratto è l’animale che elimina più rapidamente il tossico. In termini di persistenza il
composto tossico appare rimanere nell’organismo nel cane assai più che non negli altri (uomo e
ratto). Prolungando le rette delle cinetiche di clearance, si può rilevare che nel ratto dopo circa 50
ore il tossico è totalmente metabolizzato; per l’uomo bisognerà attendere circa 190 ore: a quel
tempo il cane mantiene ancora valori significativi di tossico circolante nel sistema sanguigno.
In termini di azione tossica, tale fatto significa che le cellule del cane sono sottoposte al
tossico per un periodo più elevato che non quelle degli altri animali. E poiché per un composto ad
azione tossica-farmacologica, l’effetto è dato dalla concentrazione per il tempo di contatto,
tale persistenza del tossico può provocare gravi fenomeni di intossicazione.
Applicando tali concetti in senso benefico (xenobiotico = farmaco), l’ottenere, con
modifiche eventuali della struttura molecolare, un allungamento del periodo di persistenza dello
xenobiotico a livello dei tessuti e degli umori circolanti significa tenere per un tempo
sufficientemente lungo un organo bersaglio malato a concentrazione farmacologica terapeutica e,
quindi, risanarlo.
4.4.2.2.- Modello bicompartimentale/multicompartimentale
Le considerazioni fatte per il modello monocompartimentale non sono sempre verificate
nella realtà. Anzi, nella maggior parte dei casi molti residui di tossico nell'animale non si
comportano come fossero parte di un tutt'uno omogeneo.
Certi tessuti, infatti, rilasceranno con una velocità maggiore il tossico di altri per cui, in realtà,
bisognerà tener conto che, una volta determinata la concentrazione di tossico rilasciato al tempo
t, vi saranno altre parti dell'animale che continueranno il processo di clearance.
Indipendentemente dalle pathway del processo é chiaro che dovremo, quindi, pensare di aver
almeno come due diversi compartimenti uno in cui i processi di clearance sono veloci ed uno in
cui sono, relativamente, più lenti.
Anche questa é peraltro una soluzione semplificante ma, almeno si avvicina di
più alla realtà di situazioni che certamente si verificano specialmente negli animali a complessità
strutturale elevata. Un modo generico di esprimere il modello bicompartimentale é dato dalla
relazione:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.39
)exp()exp()( tttC βψαφ −+−=
ove ψφ + rappresentano la concentrazione totale del composto chimico nel corpo
dell'animale all'inizio del processo di clearance. Come si può notare il processo di clearance é
determinato dalla somma dei due processi, uno lento e l'altro veloce espressi dalle due equazioni
esponenziali in αt e βt.
Analizzando in maggior dettaglio il modello bicompartimentale (o (multicompartimentale),
riscontreremo che compartimenti nei quali il composto chimico xenobiotico ha raggiunto equilibrio
con plasma prima che vengano prelevati i campioni di sangue apparirà cineticamente come un
compartimento unitario, mentre quello in cui l’equilibrio si raggiunge più lentamente,
(compartimento profondo), darà origine a una curva di concentrazione nel plasma che si presenta
come bifasica. Il modello usato per descrivere questo sistema è, più propriamente, quello del
modello aperto bicompartimentale. Nel disegno che segue si possono notare il modello
bicompartimentale e quello tri-compartimentale.
Fig.4.14 Modello compartimentale (bi) aperto e tricompartimentale
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.40
Nel bi-compartimentale, il sub-compartimento centrale e quelli rapidamente compartimenti
equilibratisi sono da considerarsi unitari.
In un animale a sangue caldo i siti ove si realizza la maggiore quantità di trasformazioni
metaboliche e di escrezione sono il fegato ed i reni. Poiché questi organi sono perfusi col sangue,
si può ritenere che siano parte del compartimento centrale e che il processo di eliminazione
(clearance) si verifichi nel compartimento centrale. Organi più lontani possono essere il cervello
e le strutture periferiche o a lenta irrorazione (ossa ecc.)
In fig.4.16 viene simulata la curva di concentrazione nel plasma in un sistema a due
compartimenti dopo una rapida introduzione endovenosa di uno xenobiotico.
Il composto chimico viene come prima cosa rapidamente distribuito nei tessuti ben irrorati
dal sangue e poi, più lentamente, agli altri tessuti che formano il compartimento profondo.
Fig.4.15 Interpretazione di un sistema tricompartimentale e dei valori delle costanti k1 e
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.41
k2
Se, come precedentemente fatto, assumiamo che tutte le cinetiche di trasferimento dello
xenobiotico siano del primo ordine, un sistema di lineare di equazioni differenziali descrive il
modello bi-compartimentale e cioè:
dDD
e VtCVktCktCk
dttdC )()()()( 21
12 +−−= e
)()()(21
12 tCkV
tCVkdt
tdCD
d
dD −== dove Ct e CDt sono,
rispettivamente, le concentrazioni del composto chimico xenobiotico nei compartimenti centrali e
profondi. I volumi apparenti di distribuzione per questi compartimenti sono Vd per il
compartimento centrale e VD per il compartimento a lento scambio. Se il flusso volumetrico
apparente tra i due compartimenti fosse lo stesso, ossia se k12 Vd = k21 VD il sistema di equazioni
differenziali può essere risolto con le condizioni iniziali C0 = D0/ Vd e CD0 = 0 al tempo zero dando
una rappresentazione matematica per la curva solida della figura espressa da:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.42
Fig.4.16 (vedi testo)
)exp()exp()( tttC βψαφ −+−= espressione che é identica a quella vista precedentemente all’inizio del capitolo relativo ai
sistemi bi- o multi-compartimentali. β è l’inclinazione della linea per la fase lenta di eliminazione
ed α quella per la fase rapida di eliminazione.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.43
Il valore di beta viene calcolato come prima descritto mentre, per il calcolo di α si ricorre ad
una tecnica chiamata “feathering”. Questa tecnica consiste nel proiettare la linea solida per la
fase lenta all’indietro fino all'origine (linea trattino-linea-trattino) e sottraendo i valori rispettivi
proiettati dai valori sperimentali usati per costruire la fase rapida di rimozione. Questi valori
vengono riplottati (linea punteggiata).
La slope di questa linea è α. I valori per φ e ψ sono l'intercetta all’ordinata delle rette
rappresentanti le fasi di eliminazione rapida e lenta, rispettivamente.
Le costanti cinetiche k12 k21 e ke possono essere determinate dalle seguenti relazioni:
ψφψαφβ
++
=21k 21k
keαβ
=
( )ekkk +−+= 2112 βα k12 è di importanza particolare perchè da essa si può facilmente calcolare la quantità del
composto chimico xenobiotico nel compartimento profondo (AD(t)) mediante la seguente
equazione:
( ) ( )ttDktAD βααβ
−−−−
= expexp)( 012
La conoscenza della quantità di tossico presente nel compartimento profondo consente di
capire se vi sono relazioni tra l'effetto del tossico stesso, verificato sperimentalmente, e la sua
presenza in un compartimento profondo.
É inoltre, assai importante in ecotossicologia sapere se esiste una fase lenta di eliminazione
del composto xenobiotico (rappresentata, come detto, dal (o dai) compartimento(i) profondo(i)) la
cui esistenza si pone come un indicatore di allarme che suggerisce che con ripetute
somministrazioni del tossico si può andare incontro ad una fase di tossicità dovuta a
bioaccumulo.
La concentrazione di uno xenobiotico nel plasma o nei tessuti o la sua quantità nel corpo
totale a seguito di ripetute esposizioni è illustrata nel seguente diagramma per un sistema aperto
mono-compartimentale.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.44
4.17 Concentrazione di uno xenobiotico nel plasma o nei tessuti o la sua quantità nel
corpo totale a seguito di ripetute esposizioni La rappresentazione matematica di queste concentrazioni è ottenuta sommando i termini
esponenziali per ciascuna dose così che la concentrazione del tossico al tempo t seguente la
dose n-esima è data da:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.45
( )( ) ( )tk
knk
VfDtC e
ee
dn −
−−−−
= expexp1exp1)( 0
ττ
dove τ è l'intervallo tra dosi, Dopo un gran numero di dosi, il termine exp(-nkeτ)
tende a zero per cui la concentrazione dello xenobiotico diviene:
( )( )τe
ed k
tkVfDtC
−−−
=∞ exp1exp)( 0
Una volta che la concentrazione raggiunge il valore di plateau, ulteriori esposizioni alla stessa
dose ed alla stessa frequenza non porteranno a nuovi aumenti Al valore di plateau la
concentrazione massima che si verifica immediatamente dopo l’ultima esposizione sarà data da:
( )τed kVfDC
−−=∞ exp1
1(max) 0
e la concentrazione minima si verificherà immediatamente prima della successiva
esposizione e sarà data da:
( )( )τ
τ
ee
d kk
VfDC
−−−
=∞ exp1exp(min) 0
L'espressione che definisce la
concentrazione media dopo che il plateau è stato raggiunto è:
τedkVfDavC 0)( =∞
Se l'esposizione è tale che deve essere considerata anche la cinetica di assorbimento (del
primo ordine con ka = costante cinetica), la concentrazione dello xenobiotico nel plasma dopo n
dosi somministrate ripetutamente con intervalli di tempo τ, la concentrazione é data dalla:
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.46
( )( )( ) ( ) ( )
( ) ( )−−⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−−
−−−−⎟⎟
⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−−
−−−
= τττ
ττ
aaa
eee
eada
n kknktk
knk
kkVkfDtC exp
exp1exp1exp
exp1exp1)( 0
4.4.2.4.- Cinetiche di sistemi non lineari o saturabili
Le curve dose-effetto che risultano dall’analisi delle reazioni di una struttura biologica a
seguito della somministrazione di un composto xenobiotico, mostrano di solito, un andamento
log-normale. Estrapolando si può prevedere che che alcuni individui risponderanno a dosi
infinitesime mentre altri risponderanno mai, per quanto grande sia la dose.
L'assunzione che ne segue è che il profilo chemobiocinetico del composto sia indipendente
dal livello di dose somministrato.
Peraltro, molti processi metabolici ed escretori sono saturabili, e, quindi, la chemobiocinetica
non lineare è dell'importanza massima in tossicologia.
Molti processi metabolici e di trasferimento attivo hanno una capacità limitata di reazione con
un composto xenobiotico. La cinetica di tali processi non-lineari è definita dalla ben nota
equazione di Michaelis-Menten.
)()()(tCK
tCVdt
tdC
mm
+=
−
dove C(t) rappresenta concentrazione del chimico a tempo t, Vm è la velocità massima del
processo, e Km è la concentrazione dello xenobiotico alla quale la cinetica del processo è uguale
alla metà di Vm. Due importante limiti per questa equazione si hanno:
a) quando la concentrazione del composto è molto più piccola di Km (C (t)<< Km per cui
l’equazione si riduce a:
)()( tCKV
dttdC
mm=
−
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.47
ed il rapporto di Vm/ Km si approssima ad una costante cinetica apparente del primo ordine,
b) quando la concentrazione dello xenobiotico è molto più più grande di Km (C (t)>> Km)
allora la cinetica é espressa da:
mVdt
tdC=
− )(
In questo caso velocità di reazione non é più dipendente dalla concentrazione prevalente, ma
è divenuta di ordine zero e, quindi, indipendente dalla concentrazione.
La figura che segue mostra il tipico andamento della concentrazione contro il tempo per uno
xenobiotico per il quale il processo di eliminazione segue cinetiche non-lineari o di Michaelis-
Menten.
Fintanto che la concentrazione rimane significativamente inferiore a Km si può applicare la
parte log-lineare della curva come pure le cinetiche apparenti del primo ordine fa. Ma appena la
concentrazione si avvicina ed eccede il valore di Km il grafico semi-logaritmico diviene non lineare
e le cinetiche diventano di ordine zero.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.48
Fig.4.18 (vedi testo)
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.49
4.4.4.0.- Il Fattore di Bioaccumulazione
Abbiamo già visto l'importanza del fattore di Bioconcentrazione (BCF) ed il modo per
calcolarlo. Peraltro, sperimentalmente é strato possibile rilevare come in natura l'accumulo nel
corpo animale sia diverso (e qualche volta di un ordine di grandezza superiore) a quello che si
ottiene in laboratorio.
Ciò perché l'accumulo attraverso l'assorbimento cutaneo o branchiale é decisamente, in
questo caso, inferiore a quello che si ha attraverso l'ingestione del tossico attraverso la dieta.
Bisogna quindi tener conto di ulteriori importanti parametri che coinvolgano l'assimilazione
del tossico dal cibo ingerito, il rapporto tra il peso corporeo dell'animale ed il peso del cibo
ingerito e la concentrazione del tossico nell'alimento che viene tratto dall'acqua attraverso
l’ingestione di componenti di livelli trofici inferiori alla specie animale considerata.
La relazione che riassume questi concetti é espressa dalla:
wCfC
KRaN
e
akk
⎟⎟
⎠
⎞
⎜⎜
⎝
⎛+=
3 ove:
N = Fattore di Bioaccumulazione
ed
a = l'efficienza di assimilazione del composto chimico in esame (espressa in grammi di
tossico assorbiti per grammi di tossico ingeriti.
R = rapporto specifico del peso d’alimentazione (grammi di peso ingerito per grammo di
peso corporeo al giorno)
Cf = concentrazione del tossico nel cibo
Cw = concentrazione del tossico nell'acqua.
4.4.4.1.- Bioaccumulazione: Trasferimento attraverso la catena alimentare
Un composto chimico, come abbiamo visto, si accumula nel corpo dell'animale con
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.50
cinetiche più o meno rapide e secondo equilibri di assorbimento e di clearance.
Una parte del tossico viene inoltre metabolizzata nello stesso tessuto animale e permane
sotto forma di metaboliti e cataboliti fino alla eventuale finale eliminazione.
Per parametri conservativi, ossia per composti che non vengono rapidamente metabolizzati
lungo i vari step della catena alimentare, si può valutare il progressivo bioaccumulo che porta a
processo di bioaccumulo lungo la food chain o la food web.
Fig.4.19 – Sequenza dei processi di bioaccumulo
La conoscenza degli step di tale processo d’accumulo e quindi, la possibilità di conoscere la
concentrazione di un tossico in animali a livello trofico progressivamente superiore é di estremo
interesse in ecotossicologia.
La concentrazione di un tossico a ciascun livello trofico (i) é valutata per quel livello dal
fattore di Bioconcentrazione BCF corretto per il contributo dato dal livello trofico inferiore (i-1)
conoscendo, inoltre, i valori di trasferimento della catena alimentare per la specie trofica
superiore considerata, (fi).
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.51
La relazione che collega i vari livelli é data dalla:
Ni = (BCF) i +ai Ri
K3 (i)Ni−1
così, ad esempio:
{ }
13
223
332
333
3
13
222
333
323
3333
)('''''
)('''
)(
'')(
''')(
''')(
BCFk
Rak
RaBCFk
RaBCF
Nk
RaBCFk
RaBCFNk
RaBCFN
++=
=++=+=
e ponendo:
iii fik
Ra=
)(3
{ }123233
122332333)()()(
)()()(BCFffBCFfBCF
NfBCFfBCFNfBCFN++=
=++=+=
Con la stessa procedura e ponendo (BCF)i = Bi , le relazioni per i primi quattro livelli trofici
sono:
123441233
122
11
234344
233
2
3
1
BfffBffBfBNBffBfBN
NfBNKKBN
+++=++=
+=
==
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.52
4.4.4.1.1.- Esempio di applicazione di bioaccumulazione in trasferimento di catena alimentare - Il fattore di Bioamplificazione (BMF)
BOX 4.5 Esempio
Data la seguente tabella che riporta i parametri della catena trofica a quattro livelli per i PCB
calcolare il coefficiente di bioaccumulazione N ed i fattori di amplificazione (N/BCF) per il livello 2
e 4.
LIVELLO TROFICO
PARAMETRO 1 2 3 4
k2 - 0,010 0,004 0,001
g - 0,0092 0,0046 0,0016
R - 0,105 0,017 0,009
a - 0,9 0,9 0,9
BMF=N/BCF 105,5 10 24 104,59 104,90
Soluzione
Il coefficiente di bioaccumulazione a livello 2 (N2) é dato dalla somma del BCF del livello 2
(B2) più il prodotto di f2 per il coefficiente di bioaccumulazione al livello 1 ossia N2 = B2 + f2B1. In
maniera analoga si calcola il valore del coefficiente a livello 4 dalla relazione N4 = B4+f4B3+
f4f3B2+ f4f3f2B1. Calcoliamo quindi i valori dei vari f.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.53
89,20018,0001,0
009,0*9,0''''''''
74,10048,0004,0
017,0*9,0''''''
5,30092,001,0105,0*9,0
''''
2
444
2
333
2
222
=+
=+
=
=+
=+
=
=+
=+
=
gkRaf
gkRaf
gkRaf
I valori dei coefficienti sono allora:
9,45,525,5
59,49,4434344
11,65,529,52
1010*89,2*74,1*5,310*74,1*89,2
10*89,21012344
1010*5,310122
=+
++=+++=
=+=+=
BfffBffBfBN
BfBN
4.4.4.2.- Il fattore MATissueC
L'uso del BMF o fattore di biomagnificazione su descritto é usato, inoltre, nella valutazione
modellistica della catena alimentare per la definizione di rischio (environmental risk assessment).
Un approccio consiste nel valutare la concentrazione massima del tossico nel tessuto
(MATissueC) senza che intervengano, per l'animale, fenomeni di mortalità.
In questo caso il BMF consente di calcolare la concentrazione massima possibile nel mezzo
(acqua, sedimento, aria ecc.) chiamata anche criterio biotico probabilistico o PCB.
Così ad esempio, in acqua:
PCBw =MATissueC
BMFw ove con w a pedice si intende che il parametro é calcolato nel mezzo acqua.
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.54
4.4.4.0.- La Tossicocinetica per la Definizione dell'Esposizione.
La definizione dell'esposizione ad un tossico può essere fatta attraverso misure
sperimentali che forniscono il dato più obbiettivo atto a definire i fattori di bioconcentrazione
necessari, come vedremo, per correlare il processo di assunzione del tossico alla sua tossicità,
estrapolandola, se possibile, anche all'essere umano.
Sfortunatamente non sempre i dati sperimentali sono disponibili; anzi il più delle volte si
hanno solo alcune informazioni sulle caratteristiche del composto oltre a quelle del
comportamento dell'animale usato nell'esperimento.
É peraltro possibile ottenere da queste sole informazioni, dati utilizzabili per il prosieguo della
valutazione tossicologica; attraverso proprio le conoscenze della fisiologia dell'animale usato (in
questo caso il pesce) e le caratteristiche del composto chimico.
Vedremo, più avanti, quando esamineremo le tecniche del QSAR, come si possa arrivare
a più dettagliate valutazioni di correlazione tra alcune caratteristiche strutturali del composto
chimico e la sua azione tossica e/o il suo comportamento tossicocinetico.
Per ora esaminiamo come é possibile valutare le costanti K1 e K2 nonché il BCF da dati
presunti sia dell'animale sperimentato che del composto chimico esaminato.
L'esame tossicocinetico verrà fatto secondo due procedure: la prima che considera che il
tossico si assorba in maniera uniforme in tutto l'organismo dell'animale (modello ad un
compartimento), la seconda che i tessuti assorbano e rilascino in modo diverso tra loro il tossico
considerato (modello a due compartimenti)
4.4.4.1.- Il fattore di applicazione (AF e MATC)
La determinazione della tossicità cronica presenta notevoli difficoltà poiché pochi sono gli
individui che si prestano a tempi lunghi di sperimentazione.
Un altro fatto che crea non pochi problemi é la mancanza di relazioni significative tra la
tossicità acuta e quella cronica di un composto chimico tra mammiferi, pesci e la stessa Daphnia.
Un processo molto usato per predire la tossicità cronica da dati di tossicità acuta,
specialmente tra specie molto simili, é quello di calcolare il rapporto tra LC50 e quella che é
definita come la concentrazione del tossico alla quale cronicamente non si riscontra alcun effetto
(MATC = Maximum Acceptable Toxicant Concentration) in stadi di vita dell'animale
G.PERIN –AMBIENTE E SALUTE –.12-11-2004 – ERGO- TOSSICOCINETICHE – pg.55
particolarmente sensibili o nell'arco totale della vita.
Questo rapporto é conosciuto come il fattore di applicazione AF (Application Factor) e
quindi:
AF =LC 50
MATC
I valori per gli AF per 31 composti di varia struttura chimica e di interesse ambientale variano
da 2 a 3725.
Non sempre é possibile avere i dati sperimentali necessari per calcolare AF; in questo caso si
può estrapolare da valori esistenti per composti simili. Utilizzando il criterio del ubi minor, maior
cessat ossia quel criterio di sicurezza che consiste nello scegliere (nell'impossibilità di avere dati
sicuri) le condizioni più favorevoli all'ambiente, si può avere una certa informazione in massima
sicurezza nell'attesa, comunque di ottenere sperimentalmente i dati necessari (che probabilmente
riducono i termini di rischio).
Per esempio, per il 1,1,1,-tricloroetano (TCE) non ci sono dati per la sua tossicità cronica.
D'altro canto egli fa parte di una numerosa schiera di composti similari per i quali ci sono dati
abbondanti. Gli AF di nove cloroderivati organici simili variano da 1 a 35; su tale base si può
scegliere un fattore conservativo di 35 (AF=35); conoscendo il valore della tossicità acuta (che
esiste e, comunque sarebbe facile ottenere sperimentalmente) che é di 5 mg L-1, si può calcolare
il MATC di 145 µg L-1 in acqua. Questo MATC fornisce almeno un fattore di sicurezza di 14 volte
al di sopra della concentrazione media di meno di 10 µg L-1 di TCE che si può riscontrare
nell'ambiente (escludendo, ovviamente, i casi di incidente grave).