METODI DI MISURADELLE

CINETICHE ENZIMATICHE

LO STUDIO DELLA CINETICA ALLO STATO STAZIONARIONON DA MOLTE INFORMAZIONI SUL MECCANISMO DI REAZIONE

Allo stato stazionario possiamo solo misurare il flusso in uscita o in entrata,i quali sono uguali tra loro. Possiamo comunque ottenere alcune informazionisul meccanismo di reazione variando le condizioni sperimentali (dipendenza dal pH)

E + S EX EY EZ E + P

LO STUDIO DELLA CINETICA RAPIDA DELLE REAZIONIPUO’ DARE IMPORTANTI INFORMAZIONI SUL MECCANISMO

DI REAZIONE

(RAPID MIXING)

Tecniche di mescolamento rapido:

Il metodo del flusso continuo

(1923 – H. Hartridge and F.J.W. Roughton)

10 m/s

1 cm

1 ms

Tempo morto (dead time) Tempo massimo (upper time limit)

Spettrofotometro a flusso continuo

Tempo morto = 45 s Tempo massimo = 1 ms)

Spettrofotometro aflusso interrotto

Il metodo del flusso interrotto

1934 – F.J.W. Roughton 1940 B. Chance

Tempo morto = 2 ms

Tempo massimo = NO

50 -200 L

Il metodo del flusso “smorzato” chimicamente

Flash photolysis

1959 Q.H. Gibson

ATP “ingabbiato”

Flash at 347 nm

Tecniche di rilassamento:

Salto di temperatura o di pressione

Rate constant =1/relaxation time (0.721)

t

eConcConc

max

Tecniche di rilassamento:

Perturbazioni sinusoidali dell’equilibrio tramite ultrasuoni

BA k 1 1k

tkkeqt eAAA 11

0

1

1

k

k

A

BK

eq

eqeq

eqeq BAA 0

tkkeqt eBA 11

11

10

kk

kAAeq

tkkt e

kk

kAA 11

11

10 1

1

11 kk

1

10

k

k

A

AA

eq

eq

ESSE onk offk

ESE onk offk

[S]>>[E]

Skkk onoffobs 1

koff

= kon

CBA kk 21

E + S EX EZ E + P

STOPPED-FLOW DIODE ARRAY

330 360 390 420 450 4800.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06 ABCD

Wavelength (nm)

Ab

sorb

ance

OLOEIIPLPapoE kkk 32121

DCBA kkk 321

SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA

• Gli enzimi possono essere usati come strumenti analitici per identificare o quantificare sostanze chimiche specifiche in soluzione.

• E’ possibile determinare la presenza e la quantità di un determinato enzima in un fluido biologico misurandone l’attività con substrati specifici.

• Possiamo determinare i parametri cinetici (KM , Kcat o attività specifica) di un particolare enzima.

CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO

Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli)

SAGGI DI ATTIVITA’{CONTINUIDISCONTINUI o A PUNTI FISSI

In un saggio di attività enzimatica noi misuriamo il prodotto della reazione, più di rado misuriamo il consumo di substrato.

SAGGI CONTINUI Sono più accurati e meno laboriosi di quelli discontinui Per lo più usano metodi spettrofotometrici

• SAGGI DIRETTI

E + S E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo)

Esempio:

CH3

O

O-

C

CO

CH3

O-

C

CO

OHH

+ NADH

+ NAD+

LattatoDeidrogenasi

(LDH)

Piruvato

Lattato

• SAGGI ACCOPPIATI

E1 + S E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente)

E2 + P E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato)

Esempio:C

OH

H

COO-

CH2

+H3N

H3C

C

COO-

+H3N H

H

CH3CH

O

+

L-treonina glicina acetaldeide

L-treoninaaldolasi

CH3CH

O

acetaldeide

+ NADHH3C

HO

CH2 + NAD+

alcol etilico

alcoldeidrogenasi

[Etot] = 0,13 M

KM = 0,19 0,01 mM

Vmax = 26 0,3 M min-1

kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1

SAGGI DISCONTINUI

Alcuni sistemi non possono essere saggiati in modo continuo

1) Perché durante la reazione non si formano o consumano cromofori o fluorofori e le condizioni per far sviluppare colore o fluorescenza sono diverse da quelle del saggio.

2) Non è possibile far sviluppare colore o fluorescenza. La misura del prodotto (o del substrato consumato) devono essere fatte con altri sistemi, ad esempio HPLC, saggi biologici o immunologici.

3) Presenza di un fondo ( background ) elevato; ad esempio di assorbanza dovutaalle proteine in un estratto crudo o di altre molecole che assorbono alla lunghezza d’onda che a noi interessa. In questo caso dobbiamo condurre il saggio e poi eliminare la fonte di disturbo.

ESEMPI DI SAGGI DISCONTINUI

ENZIMA +SUBSTRATO

REAZIONE IN CORSO

PRELIEVO DI ALIQUOTEAD INTERVALLI DI TEMPO

La reazione viene bloccata con acido, denaturanti delle proteine, calore, inibitori dell’enzimaIl prodotto di reazione viene quantificato con vari metodi

E1 + S E1 + P

P-X metodi colorimetrici

Quantificazionecon HPLC

Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo

1a FASE

2a FASE

X

E2

Metodi radioisotopici

Esempio:

1a FASE Glutamato 1-semialdeide (GSA) 5-aminolevulinato (ALA)

2a FASE GSA + DMBA COMPOSTO COLORATO

Metodi radioisotopici

• Si basano sull’utilizzo di forme radiomarcate di un substrato

• Sono metodi molto sensibili ma limitati alle applicazioni in cui è possibile separare facilmente i substrati dai prodotti

Esempio: misura dell’attività di un’aminotrasferasi

COO-

O

R2

CCOO-C+H3N

H

R2

COO-+H3N

H

R1

14CCOO-14C

R1

O+ +1a FASE

2a FASE (separazione cromatografica e conteggio della radiattività)

Misceladi

reazione

colonnacromatografica

a scambio anionico

lavaggio Conteggioradiattività

eluizione

aminoacidi chetoacidi

INATTIVAZIONE DEGLI ENZIMI

REVERSIBILE {• COMPETITIVA• INCOMPETITIVA• MISTA

IRREVERSIBILE {• ASPECIFICA PER IL TIPO DI ENZIMA• BASATA SUL MECCANISMO DI REAZIONE DELL’ENZIMA (inibitori suicidi)

E + I EI

E + P1

E + P2

EX EY

• La parete batterica contiene D-aminoacidi (D-alanina ad es.) come costituenti dei ponti polipeptidici che connettono le catene di carboidrati.

• Questi vengono ottenuti dagli L-aminoacidi tramite reazioni di racemizzazione (catalizzate da racemasi).

• In alcuni batteri, il D-glutammato che viene incorporato nella parete batterica non è sintetizzato per racemizzazione ma tramite una reazione di transaminazione:

D-alanina + -chetoglutarato piruvato + D-glutammato

Questa reazione è catalizzata da un enzima dipendente dal piridossal fosfato:la D-aminoacido aminotrasferasi

CCH2-OOC

NH2

HCl

C-OOC

NH2

HCH3

D-alanina (substrato naturale)

D--cloroalanina (inibitore)

+ E-PLP

C-OOC

H

N

HN+

CH2

Cl

H

H

O-

+

B:

Il Cloro è un buon gruppo uscentenelle reazioni di sostituzione nucleofila

Normale reazionedi transaminazione

Verso l’inibizione

H2O

H2O

NH

O-

+

CH2

NH2

C-OOC CH2

Cl

O

+

INTERMEDIOAMINOACRILATO

E

E E

ENZIMAINATTIVATO

MECCANISMO DI INATTIVAZIONE

INTERMEDIOAMINOACRILATO

La VIGABATRINA: un farmaco contro l’epilessia.

• L’acido -aminobutirrico (GABA) è uno dei principali neurotrasmettitori inibitori del sistema nervoso centrale

3+HN

CH2

CH2

COO-

COO-

HC 3+HN

CH2

CH2

COO-

H

H

C

CO2

H+

L-glutammato GABA

3+HN

CH2

CH2

COO-

H

H

C 3+HN

CH2

CH2

COO-

COO-

HC

CH2

CH2

COO-

COO-

CO

CH2

CH2

COO-

H

CO+ +

GABA L-glutammato-chetoglutarato Succinico semialdeide

glutammatodecarbossilasi

GABAaminotrasferasi

L’epilessia può essere trattata aumentando la concentrazione di GABAnel sistema nervoso centrale. Un metodo per ottenere questo risultato èquello di inibire in modo specifico la GABA aminotrasferasi

3+HN

CH2

CH2

COO-

H

H

C

CH2

CH2

COO-

H

H

C+3HN C

CH2

La VIGABATRINA, un analogo del GABA, è un efficiente inibitoredella GABA aminotrasferasi ed è attualmente utilizzata con successo nel trattamento dell’epilessia

GABA 4-amino-5-esanoatoVIGABATRINA

MECCANISMO DI INIBIZIONE DELLA VIGABATRINA

75%

25%

R

NHH

H

Py

NH

Lys329

ENZIMAINATTIVATO

L’EFLORNITINA: un farmaco contro la malattia del sonno

L’ornitina decarbossilasi è un enzima essenziale per la produzione dellaputrescina, un precursore delle poliamine

+H3N

COO-

H

CH2

CH2

CH2

NH3+

C

Py

C

NH+

CH

COO-

R

H

Py

C

NH+

CHR

H

Py

C

NH+

CHR

H

H

+H3N H

CH2

CH2

CH2

NH3+

C

H

+ E-PLPCO2

H+

H+

+ E-PLP

ornitina

putrescina

+H3N

CH2

CH2

CH2

NH3+

C

COO-

CH

F

F

-difluorometilornitinao

eflornitina

MECCANISMO DI INIBIZIONE DELL’EFLORNITINA

ENZIMAINATTIVATO