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Elettroforesiproteine ed acidi
nucleici
Flavia FrabettiTecnici di laboratorio2010/2011
ELETTORFORESI
• metodo fisico di separazione che sfrutta la mobilità elettroforetica di molecole cariche, sottoposte ad un campo elettrico
• si realizza attraverso l’utilizzo di un sistema elettroforetico
matrice di gelcella elettroforeticaalimentatore (in cui applicare voltaggio o intensità di corrente costante)tamponi salini
si possono studiare sia gliacidi nucleici (DNA e RNA) sia le proteine
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Matrice di gel serve da “setaccio” molecolare e consentela separazione
può essere fatto di polimeriagarosio o poliacrilamide
Gel di agarosio: pesare l’agarosio misurare il buffer (TBE/TAE) bollire l’agarosio in buffer versare il gel nella vaschetta allestita
Gel di acrilamide:miscelando acrilamide e bis-acrilamide che formano un polimero complesso a maglia*
Come si forma il gel?
Gel di acrilamide
• utili soprattutto per la separazione e caratterizzazione di proteine• di solito in sistemi verticali, poiché se ne fanno “lastre” di 0,2-0,4 mmi cui pozzetti non sarebbero “caricabili” in un sistema orizzontale• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel dipende principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del peptideconcentrazione di acrilamideconformazione della molecola (denaturata o meno)voltaggio
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pozzetticon i campioni
campione
anodo
catodo
supportodiplastica
tampone
tampone
PAGE = Poli-Acrilamide Gel Elettroforesi delle proteineè di norma realizzata facendo polimerizzare la poliacrilamide tra due vetri piatti e la corsa viene eseguita in un sistemaverticaleSDS = detergente(sodio-dodecil-solfato)carico
-
Spesso si procede in condizioni denaturanti - SDS PAGE
well= pozzettolane= corsia
SDS = Sodio Dodecil-Solfato (detergente anionico)BME = β- mercaptoetanolo (riducente)
proteina tetramerica proteina monomerica
bollitura
bollitura
peptidi connessi daponti disolfuro
peptidi separati
DENATURAZIONE DELLE PROTEINE: preparazione del campione (sample) con proteine denaturate
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Acrilamide(%) Intervallo di separazione dei peptidi
(in kilodalton)
8 200 - 25
10 100 - 15
12.5 70 - 10
15 60 - 6
20 40 - 4
Scelta della % di acrilamide in rapporto alla taglia molecolare delle proteine
Dal Chieffiriquadro 2.2 pag:44-48
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALESU GEL o ISOELECTROFOCUSINGpunto isoelettrico (pI): il pH al quale la carica nettadi una proteina è nulla per un bilancio tra + e -, quiLa proteina non sarà più soggetta a migrazione elettroforetica
pH acido
pH basicoI fase:
separazionepercarica
II fase: separazione dimensionale
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Rivelazione della separazione elettroforetica:
• tramite colorazione aspecifica di tutte le proteine della miscela(es. con comassie blue o silver-stain)
• trasferimento, anche qui elettroforetico, su opportune matrici di nitrocellulosa attraverso la tecnica del Western Blotting per analisi più fini, specifiche
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
1- riconoscimento mediante autoradiografia di proteine marcate con radioisotopi
consente di evidenziare proteine neo-sintetizzate ed analizzare ilturn-over proteico (esperimenti di pulse-chaise)
l’isotopo radioattivo più usato è lo zolfo 35S (emivita di 87gg)
metionina
cisteina
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2- riconoscimento immuno-enzimatico utilizzando anticorpi specifici
consente di riconoscere una specifica proteina di interesse
consta di diverse fasi schematizzabili in:a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosab) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica)
a) elettro-trasferimento dal gel ad una membrana di nitrocellulosa
trasferimentodelle proteine
proteina di interesse
carta imbevutadi tampone
carta imbevutadi tampone
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b) rivelazione con l’anticorpo (colorazione immuno-enzimatica) -fasi procedurali
anticorpi Ilegano l’antigene
anticorpi IIlegano gli anticorpi I
la membrana viene saturata daproteine inerti
sviluppo della colorazione enzimatica
Verifica qualitativa e quantitativaacidi nucleici
SpettrofotometroAnalisi a λ= 260 nmSi misura la ssorbanza odensità ottica O.D.1 O.D. ≈ 50 µg DNA1 O.D. ≈ 40 µg RNA1 O.D. ≈ 30 µg oligonucleotidiλ= 280 nm proteine260/280 > 1,8 (≈2) è abbastanza puro
Nanodrop ®
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Gel di agarosio
• utili per la separazione e caratterizzazione di acidi nucleici• di solito in sistemi orizzontali• la velocità di migrazione elettroforetica attraverso i gel di agarosiodipende principalmente da 4 parametri
taglia molecolare del DNA o RNAconcentrazione di agarosioconformazione della molecolavoltaggio
Allestimento della tecnicaelettroforetica su gel orizzontalidi agarosio (schema)
preparazione gel
caricamento campioni(Ø 5mm/well)
connessione edaccensione
rilevazione
Campione (sample)viene diluito in untampone di caricamento (loadingbuffer) che contiene 2 coloranti pertracciare la corsa:
Blu di bromofenolo (Bb) 300 bp
Xilene cianolo (Xc) 4.000 bp
ed anche glicerolo per appesantire ilcampione
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Corsa e rilevazione su gel orizzontalidi agarosio - procedure
Riempire la vaschetta con il buffer
Caricare i campioni sul gel Accendere l’alimentatore (parte la corsa del gel)
Fine della corsa
Analisi del gel al transilluminatore
Risultato
Bande luminose per via del bromuro di etidio (intercalante del DNA) che “fluoresce” ai raggi UV e si vede banda giallo-arancioLimite di sensibilità 1-5 ng di DNA
Le molecole più grandi hannoV minore, per > attrito e perchévengono intrappolate di più nellemaglie del gel
std molecolari o markers a dimensione nota
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Taglia molecolare del DNA o RNA e migrazione
Agarosio (%) Intervallo di separazione di DNA lineare (in Kb)
0.3 60 - 5
0.6 20 - 1
0.7 10 - 0.8
0.9 7 - 0.5
1.2 6 - 0.4
1.5 4 - 0.2
2.0 3 - 0.1
Di norma si applica un voltaggio di 5 Volt /cm di lunghezzadella vaschetta
Il voltaggio (V) tende a variare durante la corsa in rapporto allavariazione nella distribuzione delle cariche e del pHDurante la corsa la resistenza (R) aumenta V= i x Rper avere una migrazione costante deve aumentare anche V
Uniformità di calore e pH:le corsie periferiche sono più fredde (effetto smile) di norma evitatocon tubicini che collegano parte negativa e positiva
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I gel di poliacrilamide per separare acidi nucleici sono usati se:• si devono separare piccoli oligonucleotidi < 100 basi, si possono risolvere anche oligo diversi anche per 1 nucleotide• sono di solito a basse concentrazioni di acrilamide (<=6%) e contengono Urea (6M)
Stima della dimensione di una molecola in rapporto alla mobilità elettroforetica di std di dimensione nota(questo vale anche per le proteine)
Il DNA è una molecola che ha un rapporto “carica/massa” costantee dunque uniformità nella separazione
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Gel controllo DNA
pozzetti
markersa dimensionenota
La quantità di DNA attesa è di 7 pg per cellula umana diploideEs. globuli bianchi 6.000/µl ovvero 6.000.000/ml6.000.000 x 7 pg= 42.000.000 pg = 42.000 ng= 42 µg
frammentidi DNA genomico (50-100Kb)
GEL DNA APOPTOSIladder (scala) apoptotico
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Gel controllo RNA
28S (5000 basi)18S (2000 basi)
5S+tRNA(100 basi)
L’80-85% di RNA cellulare e costituito da rRNA, circa il 10% da tRNAE tra 1-5 % da decine di migliaia di mRNA diversi
Gel degradazione RNA,contaminazione DNA
effetto SMEAR striscia