Elettroforesi di Acidi NucleiciElettroforesi di Acidi NucleiciSouthern e Northern BlotSouthern e Northern Blot

Corso di Biologia Molecolare IICorso di Biologia Molecolare II a.a. 2006-2007a.a. 2006-2007

Ubaldo GioiaUbaldo Gioia

ELETTROFORESI SU GELELETTROFORESI SU GEL

Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessada una miscela complessa

E’ una E’ una tecnica fondamentaletecnica fondamentale per: per:

•l’l’analisianalisi (elettroforesi (elettroforesi analitica analitica))•la la purificazionepurificazione degli acidi nucleici (elettroforesi degli acidi nucleici (elettroforesi preparativapreparativa))

-- ++

RNA e DNA sono RNA e DNA sono carichi negativamentecarichi negativamente

catodocatodo anodoanodo

Effetto “setaccio” in un gel uniformeEffetto “setaccio” in un gel uniforme

--

++

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

L’L’agarosioagarosio è un è un

polisaccaridepolisaccaride costituito da costituito da

residui alternati di residui alternati di D-D-

galattosgalattosiioo e e 3,6-anidro-L-3,6-anidro-L-

galattosgalattosiioo..

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

Consente la separazioni di Consente la separazioni di

molecole di molecole di grandigrandi dimensioni: dimensioni:

0.1 - 20 kb0.1 - 20 kb

Concentrazione Concentrazione

di agarosiodi agarosio

RisoluzioneRisoluzione 0.8% : 0.5 – 20 kb0.8% : 0.5 – 20 kb

2% : 0.1 – 3 kb2% : 0.1 – 3 kb

Come si prepara un gel Come si prepara un gel d’agarosiod’agarosio

Alla soluzione d’agarosioAlla soluzione d’agarosiosi aggiunge si aggiunge Etidio BromuroEtidio Bromuro((EtBrEtBr))

Si scioglie l’agarosio inSi scioglie l’agarosio inpolvere in una soluzione polvere in una soluzione tampone a 100°Ctampone a 100°C

100V 0,2A

tampone elettroforetico

generatore di corrente

Polo +

Polo -

gel di agarosio 1.2%

scatola elettroforetica

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

100V 0,2A

Polo +

Polo -

Loading dyeLoading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, glicerolo, Blu di bromofenoloBlu di bromofenolo e e Blu di xilencianoloBlu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità che migrano nel gel a velocità diversa.diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

100V 0,2A

Polo +

Polo -

ON

Loading dyeLoading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, glicerolo, Blu di bromofenoloBlu di bromofenolo e e Blu di xilencianoloBlu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità che migrano nel gel a velocità diversa.diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

100V 0,2A

Polo +

Polo -

ON

Loading dyeLoading dye aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene aiuta il caricamento del campione nel pozzetto del gel. Contiene glicerolo, glicerolo, Blu di bromofenoloBlu di bromofenolo e e Blu di xilencianoloBlu di xilencianolo che migrano nel gel a velocità che migrano nel gel a velocità diversa.diversa.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI AGAROSIOAGAROSIO

Etidio Bromuro (EtBr)Etidio Bromuro (EtBr)::

colorante fluorescentecolorante fluorescenteassorbe la luce assorbe la luce UVUV a a 300 nm 300 nm dando colore dando colore giallo-aranciogiallo-arancio

E’ utile sia per E’ utile sia per visualizzarevisualizzare, sia per , sia per quantificarequantificare il il campione: l’intensità campione: l’intensità della fluorescenza è, della fluorescenza è, infatti, proporzionale infatti, proporzionale alla quantità del alla quantità del campione.campione.

Per frammenti Per frammenti linearilineari di di DNA e/o RNA la distanza DNA e/o RNA la distanza di migrazione è di migrazione è inversamente inversamente proporzionaleproporzionale alle alle dimensioni della dimensioni della molecola (ovvero alla molecola (ovvero alla sua lunghezza in basi) sua lunghezza in basi)

Conoscendo la distanza Conoscendo la distanza di migrazione di di migrazione di frammenti di dimensione frammenti di dimensione nota (M) posso nota (M) posso “interpolare” la “interpolare” la lunghezza delle molecole lunghezza delle molecole A e BA e B

Dai Geni ai Genomi-EdiSES-

A = 2.5 A = 2.5 kbkbB = 6 kbB = 6 kb

Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: Non tutte le molecole di DNA sono lineari (es.: plasmidi batterici)plasmidi batterici)

Sebbene le due forme abbiano le Sebbene le due forme abbiano le stessestesse dimensioni, esse dimensioni, esse migreranno in maniera differentemigreranno in maniera differente

plasmide circolare “rilassato”

nick

plasmidesuperavvolto

migra più lentamente rispetto ad un DNA

lineare o superavvolto della

stessa massa

pBR322

pBR322pBR322 pBR322pBR322dopo digestionedopo digestione

plasmide“linearizzato”

Gli acidi nucleici a Gli acidi nucleici a singolo filamentosingolo filamento (come l’RNA) (come l’RNA) tendono a formare tendono a formare complesse strutture secondariecomplesse strutture secondarie, , pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente pertanto la loro “corsa elettroforetica” è fortemente influenzata dal modo in cui si ripiegano.influenzata dal modo in cui si ripiegano.

NB

L’RNA prima di essere separato per elettroforesi deveL’RNA prima di essere separato per elettroforesi deveessere prima essere prima denaturatodenaturato, al fine di mantenere le molecole, al fine di mantenere le molecolein forma in forma linearelineare

NB

ELETTROFORESI IN CONDIZIONI ELETTROFORESI IN CONDIZIONI DENATURANTIDENATURANTI

Agenti denaturanti comunemente usati: Agenti denaturanti comunemente usati: calore, calore, formaldeideformaldeide, , formammideformammide, , ureaurea

Separazione in gel d’agarosio di molecole Separazione in gel d’agarosio di molecole di RNAdi RNA

in condizioni in condizioni denaturantidenaturanti

28S (3400 nt)

18S (1800 nt)

Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la Per ottenere una buona separazione dei pesi molecolari durante la corsa nel gel, l’RNA deve essere corsa nel gel, l’RNA deve essere denaturatodenaturato, ossia le molecole , ossia le molecole devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia devono essere liberate sia da appaiamenti con altre molecole sia da strutture secondarie intramolecolari.da strutture secondarie intramolecolari.La denaturazione si ottiene “La denaturazione si ottiene “scottandoscottando” (90-95°C) il campione e ” (90-95°C) il campione e aggiungendo aggiungendo formaldeideformaldeide al gel. Anche il loading dye contribuisce al gel. Anche il loading dye contribuisce alla denaturazione poichè contiene alla denaturazione poichè contiene formaldeideformaldeide e e formammideformammide..

Separazione di frammenti minori di 1 kbSeparazione di frammenti minori di 1 kb

Permette di separare frammenti che Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)(determinazione della sequenza del DNA)

Separazione di frammenti minori di 1 kbSeparazione di frammenti minori di 1 kb

Permette di separare frammenti che Permette di separare frammenti che differiscono di una sola base differiscono di una sola base (determinazione della sequenza del DNA)(determinazione della sequenza del DNA)

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDEPOLIACRILAMMIDE (PAGE) (PAGE)

Formazione di un gel di Formazione di un gel di poliacrilammidepoliacrilammide

acrilamide/bis acrilamide 29:1 (6-15%)+ 7M Urea

Spessore del gel0,4-1,5 mm

Il gel è composto da acrilamide e bis acrilamide in un

rapporto caratteristico 29:1 che determina lo spessore dei pori. Esso inoltre contiene urea

che funziona da denaturante.

ELETTROFORESI IN GEL DI ELETTROFORESI IN GEL DI POLIACRILAMMIDEPOLIACRILAMMIDE (PAGE) (PAGE)

Risoluzione: 20 - 1000 nt

Polo +

Polo -

1000V 22 mA

1000V 22 mA

ON

Polo +

Polo -

5.8SL(circa 150 nt)

5S (circa 120 nt)

pre-tRNAs/tRNAs (circa 80 nt)

5.8SS

Separazione di RNA totaleSeparazione di RNA totaledopo PAGE 6%dopo PAGE 6%

1000V 22 mA

RNA RNA circolarecircolare

RIASSUMENDORIASSUMENDO

Acido nucleico Agarosio PAGECondizioni denaturanti

dsDNAssDNA oligoRNA > 1kb (mRNA, rRNA ecc.)piccoli RNAs (siRNA, miRNAs ecc.)

BlottingBlotting di Acidi Nucleici: di Acidi Nucleici:SouthernSouthern e e NorthernNorthern Blot Blot

1.1.ElettroforesiElettroforesi su gel su gel

2.2.TrasferimentoTrasferimento (blotting) su membrana (blotting) su membrana

3.3.IbridazioneIbridazione con una sonda marcata con una sonda marcata radioattivamenteradioattivamente

Permettono di studiare:Permettono di studiare:Struttura ed organizzazione del Struttura ed organizzazione del genomagenomaRegolazione dell’espressione Regolazione dell’espressione genicagenica